PRINSIP DAN KONSEP

REKAYASA GENETIKA
KELOMPOK 2
Ahmad Darisa (190341621669)
Nadya Rosma (190341621603)
Risza Nuril Samsiyah (190341621627)
1. Isolasi DNA

• Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau
lisis) atau Teknik untuk mendapatkan DNA dari makhluk hidup biasanya dilakukan
dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
• Prinsipnya
prinsip dasar isolasi DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan
mengekstrasi jaringa tersbut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA,
RNA, dan substansi dasara lainnya
Tahapan Isolasi DNA
• Lisis
Untuk memecah dinding dan membrane sel
• Sentrifugasi
Untuk memisahkan hasil lisisan (dinding sel, dan kloroform) dari DNA dengan kecepatan
tertentu
• Ekstraksi
untuk memisahkan senyawa DNA dari pengotornya dengan kecepatan tertentu
• Purifikasi
Untuk memurnikan DNA dari kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida.
• Presipitasi
Untuk pengendapan DNA
• Rehidrasi
Untuk pemurnian DNA
Lisis
• Untuk menghancurkan dinding sel atau membrane sel
• Ada beberapa cara:
-Fisik : menggerus sampel dengan mortar dan pestle dalam nitrogen cair, metode
freezing thawing, radiasi
-Kimiawi : menggunakan detergen atau sodium dodecylsulphate
-Enzimatik : enzim lysozyme
 • Bahan yang digunakan
1. Deterjen berperan dalam melisiskan membrane sel, kemudian juga berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim nuclease yang merupakan enzim pendegradasi DNA
2. Sodium dodecyl sulphate (SDS) berperan dalam melisiskan membrane sel
3. Cetyl trimethylammonium (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membrane
sel pada isolasi DNA tumbuhan karena efektivitasnya dalam menghilangkan
poliskarida
Sentrifugasi
• Memisahkan DNA dari kontaminan-kontaminan lainnya yaitu komponen-komponen
penyusun yang lain seperti polisakarida, protein melalui proses sentrifugasi.
• Akan terlihat 3 lapisan:
• DNA dan RNA → lapisan paling atas
• Material padat hasil lisis sel → lapisan kedua
• Klorofil yagn larut dengan kloroform → lapisan paling bawah
Ekstraksi
• Seringkali digunakan chelating agent sperti ethylediame tetraacetic acid (EDTA) yang
berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi,
EDTA menginaktivasi enzim nuclease dengan cara mengikat ion magnesium dan
kalsium yang dibiuuhkan sebagai kofaktor enzim Dnase dengan dikocok berulang kali
Purifikasi
• pemurnian/ purifikasi DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa kontaminan
seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, Rna dan juga protein.
• Bahan yang digunakan
• Rnase : berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA
• Kloroform isoamilalkohol, dan asam asetat : mendenaturasi protein
• enzim protease : Pemurnian DNA dari kontaminan protein
Prepitasi
• Merupakan tahapan pengendapan DNA. Pemekatan DNA dilakukan menggunakan
isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA tersbut mengendap atau mengumpul
sekaligus memisahkannya dari garam – garam mineral sisa CTAB.
Rehidrasi
• Pemurnian merupakan tahapan paling penting dalam isolasi DNA. Karena bila ada
kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA gagal.
Rehidrasi
• Pemurnian merupakan tahapan paling penting dalam isolasi DNA. Karena bila ada
kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA gagal.
3. Pemindahan DNA ke Vektor

DIABETES ?

• Apakah diabetes militus? DNA Insulin

 Menumpuknya kadar gula di Sel
dalam darah Mahkluk
• Bagaimana cara mengatasi hidup
diabetes militus?
 Hormon insulin
 Insulin adalah hormon alami
yang diproduksi  oleh DNA Insulin
Sel
pancreas.
Mahkluk
Penderita Diabetes militus hidup
produktifitas insulinnya Vektor
rendah
Vektor adalah agen pembawa
fragman DNA masuk ke dalam sel
mahkluk hidup yang berfungsi
Memasukkan dan mengintegrasikan memperbanyak fragmen.
gen yang menyandikan insulin
manusia kedalam genom
VEKTOR Ilmuan Cohen tertarik pada biologi molekuler
potongan DNA  plasmid.
• dianggap DNA ekstrachromosomal
• Plasmid berukuran kecil; dengan rata-rata sekitar 1.000
hingga 4.000 pasangan basa (bp)
• Mampu menggandakan secara independen dari
kromosom.
Cohen dan Boyer
• Cohen dan Boyer menghasilkan vektor plasmid pertama
untuk keperluan kloning, yang disebut pSC101 dan dinamai
"SC" untuk Stanley Cohen.
• Plasmid dapat digunakan sebagai vektor potongan-potongan
DNA yang dapat menerima, membawa, dan mereplikasi
(mengkloning) potongan-potongan DNA lainnya

Gambar 3. Mengkloning Gen dalam Seleksi Plasmid dan Biru-Putih

(a): Mata Ilmu Pengetahuan / Peneliti Foto., (b): Michael A. Palladino.
 KRITIK UNTUK PARA
PERINTIS KLONING
“kritikus
menyuarakan National Institutes of Health
keprihatinan tentang (NIH) membentuk Komite
keamanan Penasihat DNA Rekombinan
organisme yang (RAC), yang ditugaskan
dimodifikasi secara untuk mengevaluasi risiko
genetis” teknologi DNA rekombinan
dan menyusun pedoman
Cohen dan
untuk penelitian DNA
Berg
Boyer rekombinan
Example: Example: Penemuan plasmid
menciptakan molekul dan experiment vektor
hibrida dari SV40 dan plasmid pertama untuk
DNA E. coli keperluan kloning, yang
disebut pSC101 .
Tabel 1. Perbandingan Vektor DNA dan Aplikasinya
Vector Type Maximum Insert Size (kb) Applications Limitations
Bacterial plasmid vectors ~ 6–12 DNA cloning, protein expression, Restricted insert size; limited
(circular) subcloning, direct sequencing of expression of proteins; copy
insert DNA number problems; replication
restricted to bacteria

~ 25
cDNA, genomic and expression Packaging limits DNA insert size;
Bacteriophage vectors (linear)
libraries host replication problems
Cosmid (circular) ~ 35 cDNA and genomic libraries, Phage packaging restrictions; not
cloning large DNA fragments ideal for protein expression;
cannot be replicated in
mammalian cells
Bacterial artificial ~ 300 Genomic libraries, cloning large Replication restricted to bacteria;
chromosome DNA fragments cannot be used for protein
(BAC, circular) expression
Yeast artificial chromosome 200–2,000 Genomic libraries, cloning large Must be grown in yeast; cannot
(YAC, circular) DNA fragments be used in bacteria
Ti vector Varies depending on type of Ti Gene transfer in plants Limited to use in plant cells only;
(circular) vector used number of restriction sites
randomly distributed; large size of
vector not easily manipulated
Tabel 2. Perbandingan Vektor DNA

Fungsional yang paling penting sifat-sifat vektor plasmid adalah

1) Ukuran, mereka harus cukup kecil agar mudah dipisahkan dari DNA kromosom bakteri inang.
2) Asal replikasi (ori), Situs untuk replikasi DNA yang memungkinkan plasmid untuk bereplikasi secara
terpisah dari kromosom sel inang.
3) Beberapa situs kloning (MCS), M MCS adalah segmen DNA dengan situs pengenalan untuk berbagai
enzim restriksi umum
4) Gen penanda yang dapat dipilih, Gen ini memungkinkan untuk pemilihan dan identifikasi bakteri yang
telah ditransformasi dengan plasmid rekombinan. Beberapa penanda yang paling umum dipilih adalah
gen untuk resistensi ampisilin (ampR), resistensi tetrasiklin (tetR), dan gen lacZ yang digunakan untuk
seleksi biru-putih.
5) Urutan promotor RNA polimerase, Rangkaian ini digunakan untuk transkripsi RNA in vivo dan in vitro
oleh RNA polimerase
4. Transformasi DNA
Metode transformasi yang digunakan sebagian berasal dari
biologis dan non biologis (kimia dan prosedur fisik)

DNA ditransfer ke dalam sel hidup dengan berbagai cara:

1) transfer oleh plasmid, fag, atau virus
• Konjugasi
 Perpindahan DNA dari (sel donor) sel resipien melalui kontak fisik 2 sel. Transefer
melalui pili seks.
• Transduksi
 Perpindahan DNA dari satu sel ke sel lainnya melalui perantara bakteri faqe.
• Transfeksi
 Bantuan infeksi virus
2) penyerapan langsung (transformasi)
 Pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekelilingnya terjadi secara alami.
Transformasi DNA
Metode non biologis (kimia dan prosedur fisik)

• E. coli adalah "transformasi kejutan panas:"sel yang

diberi perlakuan sebelumnya dengan CaCl2 atau
RbCl2 dibuat"kompeten" untuk penyerapan DNA
asingmelalui “kejutan panas” singkat (42 °C selama
60 detik)
• Elektroporasi menggunakan pulsa listrik pendek
yang mengarah pada pembentukan pori-pori
sementara dalam membran sel, menghasilkan
penyerapanDNA-nya.
• Untuk transformasi sel hewan atau tumbuhan
protoplas (keduanya tidak mengandung dinding sel),
DNA dapat diendapkan sebagai garam Ca di
permukaan sel, memulai endositosis.
• Prosedur lain termasuk fusi sel dengan liposom
mengandung DNA (lipofeksi) dan mikroinjeksi DNA
ke dalam inti eukariotik
5. Seleksi dan Skrining Organisme Rekombinan

Seleksi organisme rekombinan: proses penyaringan yang

dirancang untuk memudahkan identifikasi bakteri rekombinan
sambil mencegah pertumbuhan (pemilihan) bakteri.

Seleksi Antibiotik
Seleksi Organisme
Rekombinan
Seleksi Biru-Putih
1. Seleksi Antibiotik

1. Seleksi Antibiotik
Suatu teknik di mana sel-sel bakteri yang ditransformasi dilapisi pada
pelat agar dengan antibiotik yang berbeda, sebagai cara untuk
mengidentifikasi bakteri rekombinan dan sel-sel yang tidak berubah
bentuk.
 Ampicillin memiliki kemampuan untuk menghambat
pembentukan peptidoglikan pada membran sel E.coli.

Pada plasmid pUC 19,

memiliki ampicilin dimana
memiliki sifat resistan atau
tahan terhadap antibiotik.
Hal ini memungkinkan kita
untuk melakukan seleksi
dengan antibiotik

Plasmid rekombinan yang mengandung ampicilin akan

memproduksi enzim B-lactamase yang akan bereaksi
pada antibiotik
 2. Seleksi Biru-Putih

• Dalam seleksi biru-putih, DNA

dikloning ke situs restriksi
dalam gen lacZ.
• Gen lacZ mengkodekan β-
galaktosidase (β-gal), enzim
yang mendegradasi disakarida
laktosa menjadi glukosa
monosakarida, dan galaktosa.
Ketika terganggu oleh gen yang
disisipkan, gen lacZ tidak
mampu menghasilkan β-gal
fungsional.
 2. Seleksi Biru-Putih
• Bakteri yang ditransformasi dilapisi pada
agar-agar yang mengandung antibiotik
ampisilin. Bakteri yang tidak mengalami
transformasi tidak dapat tumbuh di
hadapan ampisilin karena mereka
kekurangan plasmid yang mengandung
gen resistensi ampisilin (ampR).
• Tetapi pemilihan antibiotik saja tidak
membedakan bakteri yang ditransformasi
dengan plasmid non rekombinan yang
telah diresirkulasi dari plasmid
rekombinan. Untuk mengidentifikasi
bakteri dengan plasmid rekombinan, agar-
agar juga harus mengandung substrat
kromogenik (penghasil warna) untuk βgal
yang disebut X-gal (5-bromo-4-chloro-3-
indolylβ-D-galactopyranoside).
 2. Seleksi Biru-Putih

• X-gal mirip dengan laktosa

dalam struktur dan berubah
biru ketika dibelah oleh β-gal.
• Hasilnya, bakteri non
rekombinan yang mengandung
plasmid yang diikat kembali
tanpa memasukkan DNA
mengandung gen lacZ
fungsional, menghasilkan β-
gal, dan berubah menjadi biru.
Sebaliknya, bakteri
rekombinan diidentifikasi
sebagai koloni putih.
 2. Seleksi Biru-Putih

• Karena sel-sel ini mengandung

plasmid dengan DNA asing yang
dimasukkan ke dalam gen lacZ,
βgal tidak diproduksi, dan sel-
sel ini tidak dapat
memetabolisme X-gal.
• Oleh karena itu, melalui seleksi
biru-putih, Bakteri
nontransformasi dan non
rekombinan dipilih. Koloni putih
diidentifikasi atau dipilih
sebagai koloni yang diinginkan
yang mengandung plasmid
rekombinan.
Koloni putih diidentifikasi
atau dipilih sebagai koloni
yang diinginkan yang
mengandung plasmid
rekombinan.

Sumber:blackwellpublishing.com