Hasil

Sepuluh hepatoseluler carcinoma manusia (HCC) bagian jaringan yang

diproses untuk imunohistokimia. Ekspresi plectin dan CK18 di bagian HCC jelas
berbeda jika dibandingkan dengan jaringan non-tumor. Seperti ditunjukkan dalam
Gambar. 1, sel-sel tumor (panah) yang diamati menjadi pleomorfik dan diatur
dalam irregular nests, dan pewarnaan untuk plectin lemah. Dalam jaringan non-
tumor (panah), hepatosit muncul sebagai sel kuboid seragam diatur dalam
lembaran atau pola piring, dan pewarnaan untuk plectin kuat. Juga ditunjukkan
pada Gambar. 1, ekspresi CK18 diamati secara dramatis berbeda antara HCC
dan jaringan hati non-tumor. Pewarnaan untuk CK18 kuat di jaringan non-tumor
(panah). Sebaliknya, jaringan tumor menunjukkan massa pleomorfik dan sel
tumor hiperkromatik, dan pewarnaan untuk CK18 lemah (panah). Namun, tidak
ada perbedaan antara aktin dan ekspresi tubulin di HCC dan jaringan non-tumor
(Gambar 1).
Dalam rangka untuk mengkonfirmasi temuan di atas, analisis Western blot
dilakukan pada jumlah total ekstrak protein. Setelah elektroforesis, ekspresi
diferensial plectin diamati ketika membandingkan HCC dan jaringan hati normal.
The plectin zymogenic bermigrasi sebagai single band di sekitar 300 kDa pada
jaringan hati non-tumor. Sebaliknya, plectin terdegradasi bermigrasi pada sekitar
200 kDa jelas hadir dalam jaringan HCC, dan tingkat zymogenic plectin yang
nyata menurun (Gambar 2). Demikian pula, ekspresi CK18 dalam sampel
jaringan HCC berbeda dari jaringan hati non tumor. Khususnya, CK18 dalam
jaringan non-tumor bermigrasi sebagai salah satu band, sementara CK18 dalam
jaringan tumor berlari sebagai dua band dengan berat molekul tinggi (Gambar 2).
Sementara itu, ekspresi aktin dan tubulin tidak menunjukkan perbedaan antara
HCC dan jaringan non-tumor dalam analisis ini (Gambar 2). Hasil ini konsisten
dengan temuan dari penyelidikan imunohistokimia di atas.
Berdasarkan analisis Western blot, plectin zymogenic dari sel-sel hati yang
tidak diobati (Gambar 3, CB) bermigrasi di sekitar 300-400 kDa, sedangkan
plectin terdegradasi (200 kDa) ada dalam sel yang diperlakukan dengan STS
(Gambar 3, CS1-CS7). Produk-produk pembelahan plectin diamati pada titik
waktu 1-jam (Gambar 3, CS1). Plectin hampir dibelah secara kuantitatif antara
titik waktu 1 - 3 jam dan hampir membelah sepenuhnya setelah 4 jam dari
pengobatan dengan STS (Gambar 3, CS4). Demikian pula, zymogenic CK18
bermigrasi sebagai single band di sel yang tidak diobati (Gambar 3, CB),
sedangkan dua band, termasuk zymogenic CK18 dan CK18 yang terbelah,
muncul setelah pengobatan STS (Gambar 3, CS1-CS7). CK18 yang terbelah ada
pada saat titik waktu 3-jam (Gambar 3, CS3) dan tetap sampai ke titik waktu 7-
jam (Gambar 3, CS7). Sebaliknya, tingkat ekspresi aktin dan tubulin tidak
berubah, dan tidak ada bukti aktin atau tubulin membelah yang terlihat dalam sel-
sel hati setelah pengobatan STS. Perbandingan antara pembelahan plectin dan
CK18 mengungkapkan bahwa pembelahan awal plectin terjadi sekitar 2 jam lebih
awal daripada CK18. Analisis kuantitatif mengungkapkan bahwa tingkat ekspresi
plectin dan CK18 dikurangi dengan 95% dan 60%, masing-masing, tapi tingkat
aktin dan tubulin tidak terpengaruh oleh perlakuan STS (data tidak ditampilkan).
Untuk mengetahui apakah plectin penting bagi organisasi dari sitoskeleton
dalam sel hati, kami membandingkan jaringan cytoskeletal dalam kontrol dan sel
plectin dibelah dengan imunofluoresensi. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 4,
plectin dalam sel yang tidak diobati terutama didistribusikan sebagai struktur
mesh di wilayah perinuklear dan diperluas ke pinggiran sel dalam filamen halus
atau pendeknyanya, serat berorientasi tidak beraturan dan garis putus-putus
(kontrol). CK18 hadir dalam jaringan filamen halus dalam sitoplasma, dengan
kelimpahan di wilayah perinuklear, dan distribusi seperti mesh diperluas menuju
membran sel (kontrol). Pewarnaan Plectin tumpang tindih dengan pewarnaan
CK18 dalam sel-sel ini, yang menunjukkan bahwa plectin itu dikolokalisasi
dengan CK18 dalam sel hati manusia.
Setelah pengobatan STS, karakteristik lokalisasi plectin dan CK18 mulai
menampilkan pola terganggu dan struktur granular pada 1 jam setelah induksi
apoptosis (Gambar 4, 1H). Plectin mesh kolaps, terkonsentrasi di wilayah
perinuklear, dan menunjukkan pola granular. Jaringan CK18 didistribusikan
sebagai kumpulan filamen tebal dan tampaknya ditarik ke arah inti. Kolaps
jaringan tampak jelas, dan tidak terorganisir kumpulan filamen tebal kusut dan
struktur lingkaran yang bergerombol telah diamati. Jaringan tampaknya lebih
padat dan kompak dan telah ditata ulang menjadi cincin dan patch sekitar inti bila
dibandingkan dengan sel kontrol. Fenomena ini diamati sampai ke titik waktu 7-
jam (1H-7H). Namun, tidak ada perbedaan yang jelas dalam organisasi MFs atau
MTs antara kontrol dan sel yang diperlakukan dengan STS (data tidak
ditampilkan).



Diskusi
Keterlibatan regulasi abnormal sitoskeleton dan protein yang terkait dalam
HCC manusia diselidiki dalam laboratorium kami. Dalam studi ini, berdasarkan
imunohistokimia dan analisis imunoblot, kami menemukan bahwa ekspresi in
vivo dari plectin adalah menurunkan regulasi dalam jaringan HCC dibandingkan
dengan pasangan jaringan hati nontumor. Ekspresi CK18 juga dimodulasi dalam
jaringan HCC. Ekspresi aktin dan tubulin, bagaimanapun, tidak diubah dalam
jaringan HCC. Analisis in vitro menunjukkan bahwa plectin dan CK18 yang
dibelah mengikuti pengobatan STS pada sel hati Chang manusia. Tentu saja
waktu percobaan mengungkapkan bahwa plectin dibelah 2 jam lebih awal dari
CK18. Sebaliknya, aktin dan tubulin tidak terpengaruh oleh STS-pengobatan.
Berdasarkan pengamatan immunofluorescent, morfologi sel-sel hati Chang
manusia berubah mengikuti apoptosis yang diindksi STS, dan organisasi plectin
dan jaringan CK18 juga terbukti telah kolaps. Temuan in vitro yang kompatibel
dengan penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi dan
organisasi CK18, tapi tidak dari aktin atau tubulin, diubah mengikuti knockdown
plectin via RNAi dalam sel hati Chang manusia [12].
Regulasi abnormal sitoskeleton serta protein yang terkait telah diteliti di
beberapa neoplasma. Misalnya untuk, downregulation CK19 pada sel skuamosa
karsinoma mulut [22], downregulation dari MFs dan gelsolin binding protein
dalam kanker payudara [23], dan upregulation tenascin-C dan vimentin pada
kanker payudara [24] semuanya telah didokumentasikan. Selain itu, hubungan
antara struktur cytoskeletal dan pleomorfisme dari sel kanker dikonfirmasi ketika
perubahan dalam bentuk sel dari garis sel kanker prostat manusia DU145
menunjukkan pengaturan oleh MFs berdasarkan mikroskop elektron [25].
Keterlibatan peraturan sitoskeleton dalam perubahan morfologi, invasi, dan
karsinogenesis sel kanker juga diangkat di studi sebelumnya. Ini adalah
pandangan kami bahwa pleomorfisme sel HCC manusia mungkin terkait dengan
downregulation plectin dan CK18, kami mengamati bahwa kedua protein
menurunkan regulasi dalam jaringan HCC manusia secara in vivo. Selain itu,
kami mengusulkan bahwa aktin dan tubulin tidak terlibat dalam pleomorfisme
seluler sel HCC, seperti yang kami temukan ekspresi aktin dan tubulin tidak
berubah pada sel-sel kanker tersebut.


Degradasi atau downregulation plectin dalam sel mungkin menghapuskan
kemampuannya untuk cross-link unsur-unsur cytoskeletal, menyebabkan
disorganisasi dari sitoskeleton dan pleomorfisme seluler. Sebelumnya kami
menemukan apoptosis yang diinduksi STS pada sel hati Chang manusia
mengakibatkan plectin dan CK18 membelah serta perubahan morfologi [17].
Dalam studi saat ini, kami lebih lanjut menegaskan bahwa pembelahan CK18
terjadi downstream pembelahan plectin mengikui pengobatan dengan STS.
Dengan demikian, pembelahan plectin sebelum degradasi CK18 mungkin
mempromosikan perubahan morfologi sel hati manusia. Sebuah fenomena
analog diamati oleh peneliti lain yang melaporkan bahwa pembelahan plectin
oleh caspase 8 di MCF7 garis sel kanker payudara manusia, yang didahului
pembelahan substrat caspase lainnya termasuk CK18 [13], dan ini mungkin
terlibat dalam perubahan morfologi mendalam yang diamati selama apoptosis.
Dalam studi saat ini, plectin ditemukan menurunkan regulasi dan dibelah
pada jaringan HCC manusia in vivo. STS-induced apoptosis dalam sel-sel hati
yang sehat menirukan kami in vivo pengamatan menunjukkan degradasi plectin,
modulasi CK18, organisasi terganggu dari CK18, dan adanya morfologi sel
berubah. Sementara itu, kami mengamati bahwa ekspresi aktin dan tubulin
adalah tidak berubah setelah STS-pengobatan.
In this current study, plectin was found to be downregulated
and cleaved in human HCC tissues in vivo. STS-induced apoptosis
in healthy liver cells mimicked our in vivo observations indicating
degradation of plectin, modulation of CK18, disrupted organization
of CK18, and the presence of transformed cell morphology. Meanwhile,
we observed that the expression of actin and tubulin was
not altered after STS-treatment.