SEL INANG DAN VEKTOR

1
Learning Outcome (LO)
LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
LO 23: menjelaskan transformasi
LO 24: menjelaskan transfeksi
LO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik
2
Tiga hal yang harus dilakukan untuk mengisolasi gen
tertentu dari koleksi urutan DNA rekombinan:
molekul rekombinan individu harus secara fisik
terpisah satu sama lain,
urutan rekombinan harus diperbanyak untuk
menyediakan cukup bahan untuk analisis lebih
lanjut
fragmen target tertentu harus dipilih melalui
metode yang didasarkan atas urutan basa spesifik.
Kloning gen berkaitan dengan pemilihan dan
penggunaan:
vektor (molekul pembawa)
sel inang (host) di mana vektor dapat diperbanyak.
Sel Inang dan Vektor
3
LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen
Tipe sel inang
LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen
Jenis sel inang yang digunakan untuk aplikasi tertentu
tergantung terutama pada tujuan percobaan kloning.
Jika untuk mengisolasi gen untuk analisis struktur,
maka gunakan sistem yang sederhana dan mudah
Jika untuk mengekspresikan informasi genetik dalam
eukariot tingkat tinggi seperti tanaman, maka
gunakan sistem yang lebih spesifik
4
Tipe sel inang
5
LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen
Sel inang ideal harus:
mudah ditangani dan ditumbuhkan (propagasi)
tersedia dalam berbagai galur (strain) genetik
dapat menerima berbagai vektor
Escherichia coli memenuhi persyaratan sebagai sel
inang yang ideal
Bakteri lain yang dapat digunakan sebagai sel inang
untuk eksperimen kloning gen:
Bacillus
Pseudomonas
Streptomyces
Sel inang prokariotik
6
LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen
Salah satu kelemahan menggunakan E. coli sebagai sel
inang untuk kloning gen eukariotik:
gen eukariotik tertentu mungkin tidak berfungsi dalam E. coli
sel inang prokariotik mungkin tidak menghasilkan protein
eukariotik yang berfungsi penuh.
Sel inang eukariotik:
Yeast (S. cerevisiae)
Aspergillus nidulans
Neurospora crassa
Algae (Chlamydomonas reinhardtii )
Plant cells
Animal cells
Sel Inang Eukariotik
7
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Tipe vektor
Plasmid
Bakteriofaga (faga)
Cosmid
Phagemid (phasmid)
Yeast episomal plasmids (YEps)
Yeast integrative plasmids (YIps)
Yeast replicative plasmids (YRps)
Yeast centromere plasmids (YCps)
Yeast artificial chromosomes (YACs)
Bacterial artificial chromosomes (BACs)
Vektor
berukuran cukup kecil
asal replikasi (ori)
penanda seleksi
minimal satu situs restriksi
Fitur penting vektor
8
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
ditemukan di alam pada bakteri dan beberapa ragi.
molekul DNA sirkular ekstrakromosomal.
sering memberi ciri-ciri (seperti resistensi antibiotik)
pada organisme inang.
Gen-gen resistensi antibiotik dikode oleh DNA plasmid
(pDNA) sering digunakan dalam konstruksi vektor
Penamaan plasmid:
P = menunjuk plasmid, dan ini biasanya diikuti
dengan inisial pembuatnya (s)
bilangan digunakan untuk mengklasifikasikan isolat
khusus.
Contoh: pBR322 dikembangkan oleh Francisco
Bolivar dkk
Plasmid
9
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Fitur plasmid pBR322
Berat molekul rendah
Gen-gen resisten antibiotik
asal replikasi (origin of replication, ori)
Beberapa situs pengenalan enzim restriksi
tunggal
Plasmid pBR322
Fig. 5.1. Map of plasmid pBR322. Important regions indicated are
the genes for ampicillin and tetracycline resistance (Apr and Tcr) and
the origin of replication (ori). Some unique restriction sites are given.
The hatched region shows the two fragments that were removed
from pBR322 to generate pAT153.
10
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
memiliki ori
memiliki gen resisten ampisilin
memiliki gen lacZ (fragmen -
peptida dari -galactosidase)
untuk skrining klon rekombinan
memiliki polylinker atau
multiple cloning sites (MCS) di
dalam gen lacZ
Skrining klon rekombinan
menggunakan substrat X-gal
Plasmid pUC18
Fitur plasmid pUC18
Fig. 5.2. Map of plasmid pUC18.
11
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
12
Note: There are hundreds of variants available from many different suppliers. A good source
of information is the suppliers catalogue or website. Ap
r
ampicillin resistance; Tc
r

tetracycline resistance; Neo

r
neomycin resistance (selection using kanamycin in bacteria,
G418 in mammalian cells); MCS multiple cloning site; SP6/T7 are promoters for in vitro
transcription; lacZ -galactosidase gene; CMV human cytomegalovirus. The terms pGEM,
pCI and pCMV-Script are trademarks of the suppliers.
13
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Bakteriofaga digunakan sebagai vektor kloning karena
kemampuannya memasukkan (menginfeksikan) DNA ke bakteri.
Dua jenis bakteriofaga, dan M13, banyak digunakan untuk kloning.
Bakteriofaga (Faga)
Fig. 5.3. Structure of
bacteriophages and M13.
Fag memiliki kapsid atau kepala
yang membungkus genom DNA
beruntai ganda. Daerah ekor
diperlukan untuk adsorpsi ke
sel inang. M13 memiliki
struktur yang lebih sederhana,
dengan genom DNA beruntai
tunggal yang dibungkus dalam
mantel (coat) protein.
14
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Bakteriofaga
Pemanfaatan fag sebagai vektor kloning didasarkan pada
kenyataan bahawa tidak semua dari genom sangat penting bagi
fungsi faga.
Fig. 5.4. Peta genom faga . Beberapa gen ditunjukkan.
Daerah fungsional ditunjukkan oleh garis horizontal.
Daerah non-esensial (blok hitam) dapat dimanipulasi
dalam konstruksi vektor.
Panjang genom faga
= 48.5 kb, berisi
46 gen.
Pada kedua ujung
genom linier
terdapat daerah
untai tunggal (12
basa) yang dikenal
sebagai situs cos
(cos site.
15
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
(a) Vektor insersi (insertion vector)
ditunjukkan dalam bagian i. Vektor
tersebut memiliki situs restriksi tunggal
(RS). Untuk menghasilkan DNA
rekombinan, fragmen DNA dimasukkan ke
situs ini. Ukuran fragmen yang dapat
disisipkan ditentukan oleh perbedaan
antara ukuran vektor dan ukuran fragmen
maksimum packagable (Max).



(b) Sebuah vektor pengganti (replacement vector) ditunjukkan pada bagian i. Vektor ini
memiliki situs restriksi dua (RS) yang mengapit sebuah wilayah yang dikenal sebagai
fragmen stuffer. Jadi bagian dari genom faga diganti fragmen DNA, seperti yang
ditunjukkan pada bagian ii. Pendekatan ini memungkinkan kloning fragmen DNA yang
lebih besar.
Bakteriofaga dibagi dalam dua kelas utama:
(i) Vektor insersi (Contoh: gt10 and Charon 16A)
(ii) Vektor pengganti (substitusi) (Contoh: EMBL4 and Charon 40)
Fig. 5.7. Insertionand replacement phage vectors
16
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
17
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Genom M13: DNA beruntai tunggal
sirkular berukuran 6407 basa.
Faga hanya akan menginfeksi E. coli
yang memiliki F-pili.
Ketika DNA memasuki sel, DNA
untai tunggal akan diubah menjadi
DNA beruntai ganda yang dikenal
sebagai bentuk replikatif atau RF.
Genom untai tunggal diproduksi
dan dikeluarkan dari sel sebagai
partikel M13.
Bakteriofaga M13
Fig. 5.10. Map of the filamentous phage vector M13mp18. The double-stranded replicative
form is shown. The polylinker region (MCS) is the same as that found in plasmid pUC18 (Fig.
5.2). Genes in the REP region encode proteins that are important for DNA replication. The CAP
and MOR regions contain genes that specify functions associated with capsid formation and
phage morphogenesis, respectively. The vector M13mp19 is identical except for the
orientation of the polylinker region.
18
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
19
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Cosmid merupakan gabungan plasmid situs cos fag .
Berukuran 4-6 kb, karena itu dapat mengakomodasi
fragmen DNA 47 kb.
Bersifat seperti plasmid dalam E. coli.
kapasitas kloning dua kali lipat lebih besar daripada
vektor pengganti (replacement vector).
Phagemid (phasmid): vektor hibrid plasmid/faga f1
Contoh:
ZAP
pEMBL9
pBluescript
Cosmid dan Phagemid (phasmid)
20
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
21
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
22
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Berbagai vektor yang digunakan dalam sel ragi telah
dikembangkan.
Yeast episomal plasmids (YEps) didasarkan atas plasmid 2 m
ragi, dan dapat mereplikasi secara mandiri atau
mengintegrasikan ke kromosom.
Yeast integrative plasmids (YIps) dirancang untuk
mengintegrasi ke kromosom dalam cara yang mirip dengan
plasmid YEp,
Yeast replicative plasmids (YRps) tetap sebagai plasmid
independen dan tidak mengintegrasikan
Yeast centromere plasmids (YCps) mengandung urutan dari
seluruh wilayah sentromerik dari kromosom dan perilaku
dasarnya sebagai minikromosom.
Vektor yang digunakan dalam sel eukariotik
23
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Tujuan rekayasa genetika pada eukariota tingkat tinggi ada dua:
untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel tanaman
dan hewan dalam kultur jaringan, untuk penelitian dasar pada
ekspresi gen atau untuk produksi protein
untuk mengubah susunan genetik organisme dan
menghasilkan transgenik, di mana semua sel akan membawa
modifikasi genetik.
Vektor yang digunakan untuk sel tumbuhan dan hewan dapat
dimasukkan ke dalam sel
langsung dengan teknik tertentu
virus atau agen infeksi lainnya seperti Agrobacteria.
Beberapa contoh dari jenis sistem yang telah digunakan dalam
pengembangan vektor untuk sel tumbuhan dan hewan diberikan
dalam Tabel 5.5.
24
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
25
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Pengembangan vektor untuk kloning fragmen DNA berukuran
sangat besar adalah penting untuk memungkinkan proyek-proyek
sekuensing genom besar..
YACs memungkinkan fragmen
DNA berukuran megabase
dapat dikloning
YACs memiliki daerah
centromeric dan telomeric.
DNA rekombinan
dipertahankan sebagai
kromosom ragi..
Yeast artificial chromosomes (YACs)
Fig. 5.11. Map of the yeast artificial
chromosome vector pYAC2
26
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
BAC didasarkan pada plasmid F, yang jauh lebih besar dari
vektor kloning plasmid standar sehingga mempunyai potensi
untuk mengkloning fragmen berukuran lebih besar.
BAC dapat disisipi fragmen DNA dari sekitar 300 kb
BAC lebih stabil dibanding YACs dalam sel inang bakteri.
Sebagian besar urutan genom manusia telah dicapai dengan
menggunakan perpustakaan BAC rekombinan.
Bacterial artificial chromosomes (BACs)
27
LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen
Transformasi: pengambilan DNA plasmid oleh sel inang
Sel inang perlu dibuat kompeten.
sel-sel inang diberi perlakukan kalsium klorida (CaCl2) dingin
Transformasi sel kompeten dilakukan
dengan mencampur DNA plasmid dengan sel
inkubasi pada es selama 20-30 menit
memberikan heat shock singkat (2 menit pada 42 C)
Sel-sel transforman biasanya diberi media pertumbuhan (LB cair)
dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 60-90 menit.
Sel-sel kemudian ditumbuhkan di media selektif
Efisiensi transformasi sekitar 10
6
atau 10
7
CFU/g DNA

Transformation
28
LO 23: menjelaskan transformasi
CFU = colony forming units
29
LO 23: menjelaskan transformasi
Transfeksi: pemasukan DNA faga ke sel inang bakteri.
Pemasukan DNA faga
ke sel E. coli
memerlukan
packaging in vitro
packaging in vitro
memerlukan
komponen capsid dan
endonuklease

Transfection
LO 24: menjelaskan transfeksi
Fig. 5.12. Phage DNA and packaging
(a) A concatemeric DNA molecule composed of wild-type phage DNA (+). The individual
genomes are joined at the cos sites. (b) Recombinant genomes ( rec) are shown being
packaged in vitro.
30
Sebuah alternatif untuk prosedur transformasi adalah untuk
memasukkan DNA ke dalam sel menggunakan jarum yang sangat
halus dan menyuntikkan DNA langsung ke inti sel (nukleus).
Teknik ini telah digunakan
dengan sukses pada sel
tumbuhan dan hewan.
Teknik ini membutuhkan
mikromanipulator mekanik dan
mikroskop, dan banyak praktek!
Mikroinjeksi
LO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik
Fig. 5.13. Microinjection of a protoplast-
derived potato cell
31
Teknik penembakan ke dalam sel
Biolistic
LO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik
DNA ini dilapiskan ke
microprojectiles, yang dipercepat
oleh macroprojectile pada pistol.
Di halte pelat macroprojectile
yang masih dipertahankan dalam
ruangan dan microprojectiles
membawa ke jaringan target.
Fig. 5.14. Biolistic apparatus
32
Kloning Gen
Vektor
menggunakan
Sel inang
memerlukan
Prokariot Eukariot
E. coli
B. subtilis
S. cerevisiae
Sel tanaman
Sel hewan
Memasukan
DNA terklon
Transformasi
Transfeksi
Packaging in
vitro
Mikroinjeksi
Biolistic
An origin of
replication
Selectable
marker(s)
Single
restriction site
Multiple
cloning site
Expression
signals
dimasukkan
dalam sel inang
Plasmids Phages
Cosmids
Phagemids
Yeast
artificial
chromsomes
Viruses
molekul DNA
sirkuler
dibuat secara
spesifik
M13
Insertion
vectors
gt10
Charon
16A
Replacement
vectors
EMBL4
Charon 40
dan
meliputi
seperti seperti
memerlukan
metode untuk
seperti
dapat
mempunyai
harus
mempunyai
dengan cara
dan dapat
tipe lain
berupa
seperti
dua tipe
yang
seperti seperti
dua tipe
33