ELISA

Alat
-Elisa Plate
-Elisa reader
-Mikropipet
-Vortex
-Stirer
-pH meter

Bahan
Na2CO3
NaHCO3
DI Water
NaN3
NaCl
Na2HPO4
KH2PO4
KCl
Tween 0.5 %
BSA
H2O
H2SO4
TMB
Metanol
Antibodi Sekunder

PROSEDUR ELISA
Coating Antigen
SGE Ae. aegypti dalam bicarbonate buffer @ 50 l
Ditutup plate sealed, Bungkus Alumunium foil
Shaker 5 menit, inkubasi overnight 4C
Buang dan cuci dengan PBST @ 250 l 3X
Coating Blocking Buffer
@ 200 l
Ditutup plate sealed dan Alumunium foil
Shaker 5 menit, Inkubasi 2 jam, 37 C
Buang dan cuci dengan PBST @ 250 l 3X
Coating Ab Primer (Serum)
@ 50 l
Ditutup plate sealed, Bungkus Alumunium foil
Shaker 5 menit, Inkubasi 1 jam, 37 C
Buang dan cuci dengan PBST @ 250 l 3X

Coating Ab Sekunder ( anti-human IgG)

@ 50 l
Ditutup plate sealed, Bungkus Alumunium foil
Shaker 5 menit, Inkubasi 1 jam, 37 C
Buang dan cuci dengan PBST @ 250 l 3X
Substrat TMB
Masukkan Substrat TMB
@ 50 l dalam ruang gelap
Inkubasi 30 menit dalam ruang gelap
Stop Solution
Masukkan H2SO4 @ 50 l
Inkubasi 10 menit suhu ruang
Reader 450 nm

SDS PAGE
Alat
SDS Page
Micropipet
Erlenmeyer
Vortex

Bahan
Acrylamid 30 %
Lower Gel Buffer (LGB)
Upper Gel Buffer (UGB)
TEMED
APS
H2O
Buffer Sampel
Buffer Elektroda

Prosedur SDS-PAGE
Membuat Gel SDS
Separating Gel (Lower gel)
Acrylamid 30 % (4150 l)
LGB (2500 l)
H2O (3300 l)
TEMED (100 l)
APS (10 l)

Stacking Gel (Upper Gel)

Acrylamid 30 % (450 l)
UGB (750 l)
H2O (1800 l)
TEMED (4,5 l)
APS (10 l)

Preparasi sampel
Tambahkan 10 l Buffer Sampel @ masing sampel
Panaskan selama 2 menit
Siapkan Alat SDS Page
Masukkan sampel pada setiap well
Running 100 V, selama 2 jam
Hasil

Wester Blot (WB)

Alat

Bahan

Micropipete
Semidray transfer
Shaker
Gelas ukur
Pinset
Tissue

Buffer Transfer
TBS (pH 7.4) 1L
5% skimmed milk dalam TBS
Antibodi primer
Antibodi sekunder
Whatman paper
BCIPNBT
PVDF membrane
H2O

Prosedur
Siapkan Whatman paper
Potong whatman paper dengan ukuran yang sama dengan gel
Rendam dalam buffer transfer 15-20 menit
Keringkan whatman paper
Siapkan Membran PDV
Potong membrane PVDF dengan ukuran yang sama dengan gel
Rendam dalam methanol 1 menit
Rendam dalam buffer transfer
Keringkan whatman paper
Transfer Gel pada whatman paper
Buka mesin semi dry
Letakkan pada panel yang terdapat dalam mesin semi dry
Letakkan mebran PVDF
Letakkan gel
Letakkan whatman paper
tutup dengan panel fiber yang kedua
tutup mesin
running 100 mA selama 1 jam
Immunodetection
Pisahkan membrane PVDF

Tambahkan 10 mL TBS hingga seluruh membrane tertutup

Cuci 3x@ selama 5 menit
Buang TBS dan tambahkan 10 mL 5% skim milk/ TBS
Shaker membrane selama 1 jam
Buang skim milk dan cuci 3x @ 5 menit dengan TBS
Buang TBS dan tambahkan antibody primer (1:50) dalam 10 mL 5%
Skim milk/TBS
Inkubasi overnight 4 C ( Tutup membrane dengan kain gelap)
Buang antibody primer dan cuci 3x @ 5 menit dg TBS
Buang TBS dan tambahkan antibody sekunder (1:5000) dalam 10 mL
5% Skim milk/TBS
Shaker membrane selama 2 jam
Buang antibodi sekunder dan cuci 3x @ 5 menit dg TBS
Keringkan membrane PVDF dengan tissue
Tambahkan 1 mL BCIP/NBT ( 10 cm2 membran)
Inkubasi 5-15 menit
Cuci dengan H2O stelah berubah warna
Hasil