A.

Judul
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dari Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) Sebagai Antioksidan
B. Bidang Kajian
Kimia Organik
C. Latar Belakang Masalah
Pada era globalisasi semakin banyak orang yang menyukai segala
sesuatu yang bersifat instan, sehingga menyebabkan gaya hidup yang tidak
sehat. Gaya hidup tidak sehat menimbulkan efek samping yang buruk
terhadap kesehatan, misalnya munculnya penyakit degeneratif. Penyakit
degeneratif merupakan penyakit yang disebabkan karena adanya kemunduran
fungsi sel tubuh dari keadaan normal menjadi lebih buruk. Salah satu
penyebab penyakit tersebut adalah radikal bebas.
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang mengandung satu
atau lebih molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak
berpasangan pada orbital terluarnya. Untuk mencegah akibat radikal bebas
dibutuhkan suatu zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi
oksidasi radikal bebas, yang dikenal sebagai antioksidan. (Fessenden &
Fessenden,1986)
Sumber- sumber antioksidan dapat dikelompokkan menjadi dua
kelompok, yaitu antioksidan sintetik dan antioksidan alami (hasil ekstraksi
bahan alami). Senyawa- senyawa yang umum terdapat dalam antioksidan
alami adalah fenol, polifenol, dan yang paling umum adalah flavonoid.
Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar
ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu,
dan biru, dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuhtumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15
atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai
propan (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan ini
dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yakni 1,3-diarilpropan atau
neoflavonoid. Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis
tergantung pada tingkat oksidasi dari rantai propane dari sistem 1,3diarilpropana.Flavon, flavonol dan antosianidin adalah jenis yang banyak
ditemukan dialam sehingga sering disebut sebagai flavonoida utama.
Banyaknya senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat

hidroksilasi, alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut. Flavonoid

merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gu gus hidroksil yang
tidak tersub stitusi. Pelarut polar seperti etanol, metanol, etilasetat, atau
campuran dari pelarut tersebut dapat digunakan untuk mengekstrak flavonoid
dari jaringan tumbuhan. (Rijke, 2005)
Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa
metode diantaranya metode 1,1-diphenil-2-pikrihidrazil (DPPH), metode karoten, pengukuran Ferric Tio Cyanate (FTC), reduksi garam Fremy dan
pengukuran Trolox Equivalent Capacity (TEAC), dan lain sebagainya.
Tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) termasuk dalam
famili piperaceae, tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati
dan bertangkai, yang tumbuh berselang seling dari batangnya serta
penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Dalam
daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia yakni alkoloid, saponin, tanin
dan flavonoid. (Daniel, 2010)
Penggunaan daun sirih merah dapat digunakan dalam bentuk segar
maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih merah dapat menyembuhkan
berbagai jenis penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ
tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim,
leukimia, TBC, radang pada lever, ambeien, jantung koroner, darah tinggi,
dan asam urat. (Daniel, 2010)
Hasil uji praklinis pada tikus dengan pemberian ekstrak hingga dosis
20g/kg berat badan, aman dikonsumsi dan tidak bersifat toksik. Sirih merah
banyak digunakan pada klinik herbal center sebagai ramuan atau terapi bagi
penderita yang tidak dapat disembuhkan dengan obat sintesis. Potensi sirih
merah sebagai tumbuhan obat multi fungsi sangat besar sehingga perlu
ditingkatkan dalam penggunaannya sebagai bahan obat modern. (Daniel,
2010)
Berdasarkan latar belakang tersebut, pada daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) terdapat senyawa flavonoid, dimana senyawa tersebut
berpotensi untuk memberikan efek antioksidan.Maka dari itu peneliti akan
melakukan kegiatan isolasi, dan identifikasi senyawa flavonoid yang
terkandung dalam

daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

Diharapkan senyawa hasil isolasi dari daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav) ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang aman untuk
menangkal radikal bebas. Oleh karena itu juga akan
antioksidan

dengan

menggunakan

metode

dilakukan uji

1,1-diphenil-2-pikrihidrazil

(DPPH).
D. Rumusan Masalah
Bagaimana struktur molekul senyawa flavonoid pada daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) ?
Bagaimana aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) ?
E. Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui struktur molekul senyawa flavonoid pada daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
2. Untuk mengetahui keefektifan senyawa flavonoid pada daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) sebagai penangkal radikal bebas
F. Manfaat Penelitian
1. Untuk memberikan pengetahuan bahwa daun sirih merah dapat
digunakan sebagai antioksidan.
2. Untuk menambahan pengetahuan tentang kimia organik bahan alam.
G. Definisi Operasional, Asumsi dan Pembatasan Masalah
a. Definisi Operasional
Dari permasalahan yang telah dikemukakan di atas, maka perlu
dijelaskan definisi operasional sebagai berikut :
a.

Isolasi adalah proses pemisahan suatu zat dari bagian tertentu suatu
organisme dengan cara-cara pemisahan tertentu yang lazim
digunakan dalam pemisahan kimia bahan alam. Dalam penelitian ini
isolasi dilakukan pada daun sirih merah (Piper rocatum Ruiz & Pav)
dengan menggunakan metode ekstraksi bertahap dan kromatografi.

b.

Identifikasi adalah proses penentuan ciri fisik dari suatu senyawa

hasil isolasi dengan uji titik leleh, uji sifat kimia dengan uji
fitokimia, dan kelarutan untuk menetapkan struktur molekul melalui
analisis spektrum UV-Vis, IR, NMR (H1 dan C13), dan GC-MS.

c.

Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang mempunyai

kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua

cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propan (C3) sehingga
membentuk suatu susunan C6-C3-C6.
d.

Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau

mencegah

proses

memperlambat

oksidasi.

atau

Zat

ini

secara

nyata

mampu

menghambat oksidasi zat

yang

mudah

teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga

sesuai

didefinisikan

sebagai

senyawa-senyawa yang

melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika
berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal
dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya.
b. Asumsi
Senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) dapat digunakan sebagai penagkal radikal bebas
(antioksidan).
c. Pembatasan Masalah
1. Keterbatasan hanya mengidentifikasi senyawa flavonoid pada daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).
2. Keterbatasan hanya menguji aktivitas antioksidan dari isolat daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
H. Kajian Pustaka
1. Teori- teori yang Mendukung
a. Tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Tumbuhan sirih merah memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Kerajaan:

Plantae

Divisi:

Magnoliophyta

Kelas:

Magnoliopsida

Ordo:

Piperales

Famili:

Piperaceae

Genus:

Piper

Spesies:

P. ornatum

Tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) termasuk

dalam famili piperaceae, tumbuh merambat dengan bentuk daun
menyerupai hati dan bertangkai, yang tumbuh berselang seling dari
batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan
dan mengkilap. Dalam daun sirih merah terkandung senyawa
fitokimia yakni alkoloid, saponin, tanin dan flavonoid. (Daniel, 2010)
Penggunaan daun sirih merah dapat digunakan dalam bentuk
segar maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih merah dapat
menyembuhkan berbagai jenis penyakit seperti diabetes mellitus,
peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh,
kanker payudara dan kanker rahim, leukimia, TBC, radang pada lever,
ambeien, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat. (Daniel, 2010)
Hasil uji praklinis pada tikus dengan pemberian ekstrak hingga
dosis 20g/kg berat badan, aman dikonsumsi dan tidak bersifat toksik.
Sirih merah banyak digunakan pada klinik herbal center sebagai
ramuan atau terapi bagi penderita yang tidak dapat disembuhkan
dengan obat sintesis. Potensi sirih merah sebagai tumbuhan obat multi
fungsi sangat besar sehingga perlu ditingkatkan dalam penggunaannya
sebagai bahan obat modern. (Daniel, 2010)

b. Senyawa Flavonoid
Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar
ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna
merah, ungu, dan biru, dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan
dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar
karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene
(C6) terikat pada suatu rantai propan (C3) sehingga membentuk suatu
susunan C6-C3-C6. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis
struktur, yakni 1,3-diarilpropan atau neoflavonoid. Senyawa-senyawa
flavonoid terdiri dari beberapa jenis tergantung pada tingkat oksidasi
dari rantai propane dari sistem 1,3-diarilpropana. Flavon, flavonol dan
antosianidin adalah jenis yang banyak ditemukan dialam sehingga

sering disebut sebagai flavonoida utama. Banyaknya senyawa

flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi,
alkoksilasi

atau

glikosilasi

dari

struktur

tersebut.

Flavonoid

merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gu gus hidroksil

yang tidak tersub stitusi. Pelarut polar seperti etanol, metanol,
etilasetat, atau campuran dari pelarut tersebut dapat digunakan untuk
mengekstrak flavonoid dari jaringan tumbuhan. (Rijke, 2005)

c. Teknik Isolasi, dan Identifikasi Senyawa

Isolasi
Isolasi adalah proses pemisahan suatu zat dari bagian tertentu
suatu organisme dengan cara-cara pemisahan tertentu yang lazim
digunakan dalam pemisahan kimia bahan alam. Isolasi didasarkan
pada sifat kimia atau kereaktifan bahan alam terhadap pereaksi
tertentu. Bahan alam diisolasi melalui reaksi kimia dan
dipisahkan dari senyawa lain yang tidak bereaksi.
Identifikasi senyawa
a. Uji Sifat Kimia
Untuk mendeteksi senyawa hasil isolasi yang diperoleh
termasuk senyawa flavonoid, maka dilakukan uji fitokimia.
b. Uji Sifat Fisika
Uji sifat fisika dilakukan untuk mengetahui kemurnian
senyawa hasil isolasi yaitu dengan menggunakan uji titik leleh.
Hasil titik leleh tersebut murni apabila memiliki rentang jarak
leleh tidak melebihi 20 C.
c. Spektroskopi
Spektrofotometer Serapan Ultraviolet dan Sinar Tampak
(UV-Vis)
Spektrofotometer UV-Vis adalah teknik pengukuran
spektroskopi untuk memperoleh data spektra yang
memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat
(190 380 nm) dengan sinar tampak (380 780 nm).

Pengukuran ini ditujukan untuk mengetahui gugus

kromofor yang terdapat dalam senyawa hasil isolasi yang
hasil data spektranya digunakan dalam karakterisasi
senyawa. Serapan ultraviolet mempunyai keuntungan yang
selektif yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal
dalam

molekul-molekul

Komponen-komponen

yang

dari

sangat

kompleks.

spektrofotometer

UV-Vis

terdiri dari sumber energi, monokromator, wadah sampel,

dan detektor (Underwood & Day, 1986)
Spektroskoipi Inframerah (IR)
Spektroskopi Inframerah (IR) sangat penting
dalam kimia modern terutama dalam kimia organik.
Spektrofotometer

ini

merupakan

alat

rutin

untuk

mendeteksi gugus fungsional, mengidentifikasi senyawa,

dan menganalisis campuran (Underwood & Day, 1986).
Fungsi utama dari spektroskopi inframerah adalah
untuk mengenal struktur molekul khususnya gugus
fungsional beserta lingkungannya. Kebanyakan gugus
fungsi seperti C-H, O-H, dan C=O, menimbulkan serapan
inframerah yang hanya sangat sedikit berubah dari satu
molekul ke molekul lain bergantung pada substituensubstituen lain.
Spektroskopi Massa (MS)

Spektrofotometer massa adalah suatu instrumen

yang dapat menyeleksi molekul-molekul gas bermuatan
berdasarkan massa atau beratnya (Khopkar, 2002).
Spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa
suatu sampel menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang
dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap
muatan (m/e). Proses ionisasi menggunakan berkas
elektron yang

ditembakkan

pada sampel sehingga

menghasilkan partikel-partikel bermuatan positif, dimana

massa yang terdistribusi adalah spesifik terhadap senyawa

induk (Khopkar, 2002).
Ion-ion tersebut direkam pada kertas rekaman
sebagai spektrum massa harga m/e-nya. Muatan ion dari
kebanyakan partikel yang dideteksi dalam spektrum massa
adalah + 1. Intensitas puncak pada spektrum massa
berbanding lurus dengan jumlah ion yang terbentuk
(Fessenden & Fessenden, 1986)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Spektroskopi NMR didasarkan pada penyerapan

gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam molekul
organik, apabila molekul ini berada dalam medan magnet
yang kuat. Untuk memperoleh pengukuran yang kualitatif
diperlukan suatu titik rujukan (referensi). Senyawa yang
dipilih untuk titik rujukan adalah tetrametilsilana (TMS),
(CH3)4Si yang proton-protonnya menyerap pada ujung
kanan dalam spectrum NMR. Absorpsi kebanyakan proton
lain dijumpai di bawah medan absorpsi TMS. Dalam
praktek, TMS ditambahkan langsung pada contoh dan
peak TMS bersama dengan peak-peak absorpsi dari
senyawa contoh diperoleh dalam spektrum. Selisih antara
posisi absorpsi TMS dan posisi absorpsi suatu proton
tertentu disebut geseran kimia (chemical shift), yang
dilaporkan dalam nilai , yang dinyatakan sebagai bagian
tiap pita (ppm) dari radiofrekuensi yang digunakan.
Berdasarkan prinsip penggunaannya terdapat dua
macam NMR yaitu NMR proton atau NMR 1H dan NMR
karbon atau NMR

13

C. spektroskopi proton atau

memberikan informasi struktural mengenai atom-atom H

dalam sebuah molekul organik. Spektroskopi NMR

13

menghasilkan informasi struktur mengenai karbon-karbon

dalam sebuah molekul organik. Geseran-geseran kimia

dalam NMR

13

C jauh lebih besar daripada geseran yang

dijumpai dalam NMR 1H (Fessenden & Fessenden, 1986).

d. Antioksidan
Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau
mencegah proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat
atau menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun
dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga sesuai didefinisikan
sebagai

senyawa-senyawa yang

melindungi sel dari

efek

berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan

penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolismetubuh
maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang
tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan
mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi. Protein
lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber
pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan
kerusakan protein dan DNA, kanker,
dan penyakit lainnya. Komponen

kimia

penuaan,
yang

berperan

sebagai

antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik.

Senyawa-senyawa

golongan tersebut

banyak

terdapat

dialam,

terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk

menangkap radikal bebas. Antioksidan yang banyak ditemukan pada
bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid.
(Anonim,2013)

e. Metode DPPH (1,1-diphenil-2-pikrihidrazil)

Salah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas
antioksidan adalah metode DPPH. Metode DPPH didasarkan pada
kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan
mendonorkan atom hidrogen. Perubahan warna ungu DPPH menjadi
ungu kemerahan dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa
antioksidan. Metode

ini

menggunakan kontrol

positif sebagai

pembanding untuk mengetahui aktivitas antioksidan sampel. Kontrol

positif ini dapat berupa tokoferol, BHT, dan vitamin C. Uji aktivitas
antioksidan dengan metode DPPH menggunakan 1,1-difenil-2pikrilhidra-zil (DPPH) sebagai radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi
penangkapan hidrogen oleh DPPH dari senyawa antioksidan, misalnya
troloks, yang mengubahnya menjadi 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin.
(Anonim,2013)

2. Kerangka Konseptual dan Hipotesis Penelitian

a. Kerangka konseptual
Fakta :
-

Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav) banyak dimanfaatkan sebagai obat
tradisonal
Kandungan senyawa flavonoid pada daun
sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Senyawa flavonoid dapat menangkal radikal
bebas

Bagaimana struktur senyawa flavonoid daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) dan bagaimna keefektivan isolat daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) sebagai antioksidan ?
Teori :
Kulit batang tumbuhan kamboja
(Plumeria acuminata Ait)
mengandung senyawa flavonoid
Senyawa flavonoid dapat
menangkal radikal bebas

Penelitian Terdahulu :
Senyawa flavonoid dapat menagkal
radikal bebas

Dilakukan penelitian tentang isolasi dan identifikasi senyawa

flavonoid daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) sebagai
antioksidan.
b. Hipotesis
Senyawa flavonoid pada daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav) efektif digunakan sebagai antioksidan.

I. Metode Penelitian
1. Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini ini adalah penelitian eksperimen.
2. Sasaran Penelitian atau Populasi dan Sampel
Populasi

: daun sirih merah

Sampel

: daun sirih merah

3. Rancangan Penelitian
Dalam penelitian ini menggunakan rancangan the post test-only
control group design

Random

P0

P1

O1

P2

O2

P3

O3

Keterangan
P0 = Kelompok kontrol
P1 = Isolat dengan konsentrasi 50 ppm
P2 = Isolat dengan konsentrasi 70 ppm
P3 = Isolat dengan konsentrasi 100 ppm
O = Keefektivan antioksidan pada kelompok kontrol
O1 = Keefektivan antioksidan pada isolat dengan konsentrasi 50 ppm
O2 = Keefektivan antioksidan pada isolat dengan konsentrasi 70 ppm
O3 = Keefektivan antioksidan pada isolat dengan konsentrasi 100 ppm

4. Variabel yang Digunakan

Variabel penelitian terdiri atas variabel bebas, variabel terikat
dan variabel kontrol, yang dapat dijelaskan sebagai berikut :
1. Variabel bebas

: Konsentrasi isolat daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) yaitu 50, 70, dan 100 ppm

2. Variabel terikat

Keefektivan

menangkal

radikal

bebas

(antioksidan)
3. Variabel kontrol : daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav),
dan
pelarut yang digunakan
5. Tempat dan Waktu Penelitian
a. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Jurusan
Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya
b. Waktu Penelitian
Penelitian dimulai pada bulan Juni - Juli 2015

6. Alat dan Bahan yang digunakan

a. Alat
1. Isolasi senyawa flavonoid
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini dapat
digolongkan menjadi dua, yaitu peralatan untuk isolasi dan
peralatan untuk karakterisasi isolat. Peralatan yang digunakan
untuk isolasi senyawa meliputi botol gelap kaca 2,5 liter, pompa
vakum, neraca analitik, shaker bath, corong pisah, oven, vial,
alat- alat gelas, lampu UV 365 nm, alat ekstraksi maserasi,
seperangkat

alat

destilasi,

rotary

vacuum

evaporator,

seperangkat alat kromatografi vakum cair, seperangkat alat

kromatografi kolom gravitasi, dan plat KLT. Peralatan yang
digunakan untuk karakterisasi isolat meliputi Melting Apparatus,
Spektrometer UV-vis, IR, NMR, dan GC-MS.
2. Uji aktivitas antioksidan
Peralatan yang digunakan untuk pengujian ini meliputi
gelas kimia, gelas ukur, tabung reaksi, pipet, plat KLT, kertas
tissue, botol, Spektrometer UV-vis dan lain-lain.
b. Bahan
1. Isolasi senyawa flavonoid
Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun
sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav), serbuk Mg, asam
klorida pekat, metanol, n- heksana, etil asetat, asam asetat glasial,
asam sitroborat, iodin, silika gel 60 (35-70 mesh), silika gel 60
GF254, kertas saring, kapas, alumunium foil dan aquadest.
2. Uji aktivitas antioksidan
Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian ini meliputi
bahan-bahan bioaktif berupa ekstrak dan isolat hasil pemisahan
dari daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav), senyawa
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).

7. Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan tahap sebagai berikut:
1. Ekstraksi dan fraksinasi flavonoid
Ekstraksi senyawa flavonoid yang terdapat dalam tumbuhan
dengan sampel daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) yang
telah dihaluskan sebanyak 250 gram dimaserasi yaitu direndam
dengan menggunakan pelarut metanol 10 x 1000 mL dan disimpan
ditempat yang terlindung cahaya matahari sambil sekali- kali
dikocok (shaker). Maserasi dilakukan berulang kali sampai diperoleh
larutan yang bening yang menandakan hasil yang negatif terhadap
flavonoid. Hasil maserasi disaring dan dipekatkan dengan rotary
evaporator. Ekstrak yang diperoleh disebut sebagai ekstrak pekat
metanol.
Kemudian dilakukan proses fraksinasi terhadap ekstrak pekat
metanol tersebut berdasarkan pada perbedaan kepolaran pelarut
organik. Fraksinasi untuk masing- masing fraksi dilakukan berulang
kali, sampai warna pelarut pada fraksi yang diinginkan bening.
Caranya adalah sebagai berikut; ekstrak kasar (ekstrak pekat
metanol) dilarutkan dalam pelarut metanol air (6 : 4), kemudian
fraksinasi dengan pelarut n- heksana dengan perbandingan 1 : 1(v/v).
Fraksinasi dilakukan dengan corong pisah, sehingga diperoleh 2
fraksi, yaitu fraksi n- heksana dan fraksi metanol air. Kemudian
dilanjutkan dengan fraksinasi antara fraksi metanol air dengan
pelarut etil asetat dengan perbandingan 1:1. Sehingga dihasilkan 3
fraksi, yaitu fraksi metanol air, fraksi etil asetat dan fraksi nheksana.
Pada fraksi etil asetat dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui
ada tidaknya senyawa flavonoid, kemudian fraksi etil asetat ini
dipekatkan dengan rotary evaporator.
2. Pemisahan dan permunian flavonoid
Dari hasil uji fitokimia yang dilakukan, dapat diketahui pada
fraksi etil asetat mengandung senyawa flavonoid. Kemudian fraksi

etil asetat dilakukan uji KLT untuk mencari komposisi eluen yang
baik dengan cara melihat hasil pemisahan noda yang ada. Komposisi
dari eluen yang digunakan, dan penampak noda yang digunakan
adalah uap iodin. Penampak noda iodin merupaka pereaksi lokasi
umum untuk senyawa organik, untuk senyawa tak jenuh akan
memberikan noda- noda yang tak berwarna, tetapi banyak senyawa
organik yang jenuh akan menimbulkan noda- noda berwarna coklat.
Semua warna ini akan cepat hilang dibiarkan di atmosfer. Dimana
komposisi eluen tersebut akan digunakan sebagai fase gerak pada
proses selanjutnya, yaitu n-heksa 100 %, n-heksana dan etil asetat
dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 30:70; 20:80;
10:90 dan etil asetat 100% pada kromatografi kolom.
Fraksi etil asetat lalu dikromatografi kolom dengan fase gerak
n-heksana : etil asetat (20:80) dan fase diam silika gel 60 (35-70
mesh). Silika gel disuspensikan lebih dahulu dengan n- heksana : etil
asetat (20:80) dimasukan ke dalam kolom yang dasarnya telah diberi
kapas. Kemudian didiamkan selama satu malam. Ekstrak dari fraksi
etil asetat dilarutkan dengan sedikit etil asetat, yang kemudian
disebut preadsorbsi. Hasil preadsorbsi dimasukan ke dalam kolom,
dielusi dengan n- heksana dan etil asetat (20:80) secara bertahap.
Hasil dari kromatografi kolom yang telah didapatkan ditampung
di dalam vial masing- masing 10 mL, selanjutnya diamati dengan
KLT dengan eluen n-heksana : etil asetat (20:80) dan penampak noda
digunakan asam sitroborat dan diamati dengan lampu UV = 365
nm. Dengan adanya fraksi yang memberikan noda dengan harga Rf
yang sama dapat digabungkan.
Fraksi gabungan diangin- anginkan selama seminggu agar pekat dan
mudah terdeteksi pada saat KLT. Fraksi yang positif mengandung
senyawa

flavonoid

dan

memberikan

noda

tunggal

pada

kromatogram, dimurnikan melalui rekristalisasi. Hasil rekristalisasi

diamati dengan KLT menggunakan berbagai eluen. Pelarut dari

kristal yang telah diperoleh dipisahkan dan kristal disimpan dalam

desikator.
3. Identifikasi senyawa flavonoid
Senyawa flavonoid yang diperoleh dikarakterisasi dengan titik
leleh, Spektroskopi UV Vis, IR, MS, NMR, dan GC.
Titik leleh dari kristal dapat ditentukan dengan pemanasan
kristal. Kristal ditempatkan pada alat yang telah tersedia kemudian
suhu dari kristal disaat mulai meleleh diamati sampai suhu dimana
semua kristal telah habis meleleh. Spektrum senyawa isolat untuk
UV Vis ditentukan dalam larutan etil asetat.
4. Tahap pengujian aktivitas antioksidan
Tahap uji aktivitas antioksidan isolat daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) adalah sebagai berikut :
a. Melakukan uji pendahuluan di atas plat KLT dengan menotolkan
isolat yamg telah dilarutkan dalam 1 mL etanol pada silika gel,
kemudian plat KLT disemprot dengan senyawa DPPH (1,1difenil-2-pikrilhidrazil) 0,004% dalam metanol.
b. Membuat larutan uji berupa isolat dengan variasi konsentrasi 50,
70, dan 100 ppm.
c. Menambahkan senyawa DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) pada
setiap konsentrasi larutan uji
d. Diuji masing- masing larutan dengan Spektrometer UV-vis, dan
diamati absorbansi masing- masing larutan.
e. Melakukan pengulangan sebanyak 3 kali.

Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

Dipotong kecil-kecil
Diangin-anginkan sampai kering
Daun sirih merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav)
kering Digiling
kering daun
sirih merah
8. KerangkaSerbuk
Operasional
Penelitian
(Piper crocatum Ruiz & Pav)

a. Isolasi senyawa dari ekstrak etil asetat

Dimaserasi sebanyak 3 kali, masing-masing selama 24

jam menggunakan pelarut metanol sampai ketinggian
1 cm diatas permukaan sampel pada suhu kamar
Disaring

Filtrat

Residu

Diuapkan menggunakan evaporator

Endapan

Ekstrak pekat metanol

Difraksinasi dengan metode KCV menggunakan pelarut H 100%,

H:E=90:10, H:E=80:20, H:E=70:30, H:E=60:40, H:E=30:70,
H:E=20:80, H:E=10:90, E 100%
Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen H:E=20:80
Fraksi dengan Rf yang sama digabung menjadi satu
Fraksi A (1 17)

Fraksi B (18 20)

Difraksinasi dengan metode KKG menggunakan eluen H:E=20:80

Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen H:E=20:80
Fraksi dengan Rf yang sama digabung menjadi satu

Fraksi
A1 (1-6)

Fraksi A2 (7 20)

Fraksi A3
(21 40)

Fraksi A2 (7 20)
Difraksinasi dengan metode KKG menggunakan
eluen H:E=20:80
Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen
H:E=20:80
Fraksi dengan Rf yang sama digabung menjadi satu

Fraksi A2A
(1-5)

Fraksi A2B (6 10)

Fraksi A2C
(11-18)

Difraksinasi dengan metode KKG menggunakan

eluen H:E=20:80
Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen
H:E=20:80
Fraksi dengan Rf yang sama digabung menjadi satu

Fraksi
A2BA
(1 6)

Fraksi A2BB
(710)

Fraksi A2BC
(11 20)

Direkristalisasi dengan pelarut metanol p.a

isolat
Dimonitor dengan KLT dengan 3
perbandingan eluen
Diidentifikasi dan dikarakterisasi

Uji titik
leleh

Rentang
jarak
leleh 2
0
C

Spektroskopi
UV-Vis
IR
H1-NMR
C13-NMR
GC-MS

b. Uji aktivitas antioksidan

Uji pendahuluan pada plat KLT
1 mg isolat daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav)
Dilarutkan ke dalam 1 mL etanol
Ditotolkan pada plat KLT
Disemprot dengan senyawa DPPH

(1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil) 0,004% dalam metanol

Bercak kuning berlatar ungu

Uji antioksidan
Isolat daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav)
Dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 50, 70,
dan 100 ppm
Ditambahkan senyawa DPPH (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil) pada setiap konsentrasi larutan

uji
Diuji masing- masing larutan dengan
Spektrometer UV-vis, dan diamati absorbansi
masing- masing larutan
Nilai LC50

9. Teknik Analisis Data

Data-data yang diperoleh dari pengujian titik leleh, kromatografi
lapis tipis (KLT), kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom
gravitasi (KKG), spektrum UV-Vis, IR, NMR, dan GC-MS selanjutnya
digunakan untuk mengetahui karakteristik senyawa hasil isolasi.
Besarnya aktivitas penangkapan radikal bebas dinyatakan dengan
LC50, yaitu besarnya konsentrasi larutan uji yang mampu menurunkan
50% absorbansi DPPH dibandingkan dengan larutan blanko.
J. Jadwal Penelitian
No

Kegiatan

Feb - April Mei

Bimbingan
dan
1.

menyusun
proposal
skripsi
Ujian

2.

proposal
skripsi
Revisi

3.

proposal
skripsi
Persiapan

4.

alat

5.

bahan
Tahap

dan

penelitian
Ekstraksi dan
fraksinasi

Bulan
Juni
Juli

Agustus

flavonoid
Pemisahan
dan
permunian
flavonoid
Identifikasi
senyawa
flavonoid
Pengujian
aktivitas
antioksidan
Penyusunan
6.

7.
8.

draft
proposal
skripsi
Ujian skripsi
Revisi
skripsi

K. Daftar Pustaka
Anonim.2013.Sirih Merah. http://id.wikipedia.org/wiki/Sirih_merah (diakses
12 Desember 2014)
Anonim.2013.Antioksidan. http://id.wikipedia.org/wiki/Antioksidan (diakses
6 Desember 2014)
Daniel.2010.Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid pada Fraksi Etil
Asetat dari Daun Tumbuhan Sirih Merah.Mulawarman Scientifie 9
(1) : 17-26
Fessenden & Fessenden.1986.Kimia Organik Edisi Ketiga Jilid I.Jakarta:
Erlangga

Khopkar.2002.Konsep Dasar Kimia Analitik.Jakarta: UI Press

Rijke E. 2005. Trace-level Determination of Flavonoids and Their
Conjugates Application ti Plants of The Leguminosae Family
[disetasi]. Amsterdam: Universitas Amsterdam.
Taufiqurrochman, Mochammad.2009.Isolasi, Identifikasi, dan Uji
Bioaktivitas Insektisida Isolat dari Ekstrak n- heksana Kulit
Batang Tumbuhan Nyiri Batu (Xylocarpus moluccensis(Lamk) M.
Roem) (MELIACEAE). Skripsi yang tidak dipublikasikan. Surabaya
: Universitas Negeri Surabaya
Underwood & Day.2002.Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam.Jakarta:
Erlangga