Pengertian Western Blot (WB)

Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran
nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui
elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode autoradiografi,
pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan 125I, pelabelan dengan antibodi
terikat protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya (Attwood et al., 2006).

Prinsip teknik Western Blotting

Prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan
yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan
dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian
akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.
Membran tersebut (PVDF) dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga
protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi.
Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan
antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan
secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara
fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil
fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.
Immunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang rapuh untuk
dapat melalui proses inkubasi yang lama dan pencucian yang berulang kali. Untuk mengatasi hal
ini, maka protein terlebih dahulu ditansfer dari gel ke membran nitroselulosa (NC) atau
membrane poliviniliden difluorida (PVDF).
Membran digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang diuji karena:
1.

Mudah manipulasinya

2.

Mengurangi lama inkubasi dan pencucian

3.

Hasil protein yang ditrnsfer (hasil blot) dapat dipakai lagi untuk immunodeteksi protein yang
lain (sesudah diinkubasi dengan detergen untuk menghilangkan probing reagent.

4.

Blot dapat disimpan sampai 1 bulan

5.

Blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi (fatchiyah dkk, 2011).

Prosedur teknik Western Blotting

Tahapan Western

Blot (WB)
Berdasarkan

pengertian

tersebut,

dilakukan

melalui

tahap.

Tahap

WB
beberapa

pertama,

elektroforesis.

Tahap

kedua,

elektrotransfer.

Tahap

ketiga,

deteksi (Gambar 1) (Kindt et al., 2007).

Tahap Elektroforesis
Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara
elektroforesis. Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam
suatu tegangan listrik tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang mengandung protein
biasanya dicampur dengan SDS. SDS merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif.
Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami
denaturasi. Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan hidrogen yang menyebabkan suatu protein
mengalami folding untuk menjaga kestabilannya menjadi terganggu akibat adanya SDS. Suatu

protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya. Akibatnya, protein-protein
yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul
suatu protein, maka rantai polipeptida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai
polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus
listrik. Protein yang telah bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub
positif. Laju pergerakan protein dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung
pada daya hambat antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan
memiliki daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan
dengan
pergerakan

protein

yang

berukuran

lebih kecil.

Setelah

dialiri arus

listrik

selama

beberapa

waktu,

masing-

masing

protein

akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau memiliki berat
molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein yang lebih besar. Dalam gel
poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan protein-protein yang telah
terpisah berdasarkan berat molekul (Gambar 2) (Koolman dan Roehm, 2005).

Tahap Elektrotransfer

Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer.
Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein.
Oleh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer. Elektrotransfer dapat
dilakukan dengan

dua metode, yaitu

(Bollag et

1996):

1.

al.,
Blotting

semikering

Blotting

semikering

menggunakan

kertas saring yang

telah dibasahi dengan buffer transfer. Kertas saring tersebut diletakkan di antara gel
poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit dengan
arus lstrik tertentu.
2. Blotting basah
Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer,
tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan lapisanlapisan pada blotting basah diperlihatkan pada Gambar 3 (Wenk dan Fernandis, 2007).
Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga 1 malam. Metode blotting
basah lebih umum digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.

Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon. Pada
sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena relatif tidak mahal dan
bloking mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan terutama pada beberapa keadaan
khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari
kapasitas pengikatan nitroselulosa dan protein. Kedua, protein terikat sangat lemah pada
nitroselulosa. Ketiga, adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik (Bollag et al.,
1996).

Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap yang sangat penting
dalam WB. Oleh karena itu, ada beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam proses transfer
protein tersebut.
1. Arus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu tinggi dapat
menghasilkan panas selama transfer yang dapat menimbulkan masalah.
2. Kekuatan ion yang rendah buffer transfer yang rendah dapat digunakan pada tegangan listrik
yang tinggi tanpa perlu dikhawatirkan menghasilkan panas yang tinggi.
3. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah 200 mA selama 2 jam.
4. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel dengan konsentrasi
poliakrilamid yang rendah.
Tahap Deteksi
Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran transfer.
Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat
spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama terletak pada penggunaan antibodi primer dan
sekunder, serta penggunaan molekul penanda. Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah
dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi
biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu :
a. Antibodi Primer
Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem
imun ketika terpajang protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas
membran paling sedikit selama 30 menit.
b. Antibodi Sekunder
Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah
diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk
suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi
primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter
seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan
menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer. Sekarang, proses deteksi dapat
dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali
protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi.

Analisis Chemiluminescent
Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan
antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur
dengan densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang
paking canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak
digunakan sekarang.
Aplikasi dan manfaat dari teknik Western Blotting

Aplikasi teknik western blotting

Teknik western blotting telah banyak dikembangkan dalam berbagai penelitian, salah
satunya

pada

penelitian

mengenai

spesifitas

dan

sensitifitas

antibodi

anti

eRF3

ragi Saccharomyces cerevisia. Protein eRF3 (eukaryotic release factor-3) merupakan salah satu
protein yang berperan padaproses terminasi translasi. Protein ini bersama-sama dengan
eRF1 (eukaryotic release factor-1) saling berinteraksi membentuk kompleks release factordalam
memediasi pelepasan rantai polipeptida dari ribosom.
Untuk memahami mekanisme terminasi translasi dalam sistemeukariot dilakukan
evaluasi struktur fungsi eRF1 yang dilanjutkan dengan studi interaksi in vitro eRF1 mutan dan
eRF1 wild type dengan eRF3. Namun demikian, hasil deteksi dari studi interaksi in vitro sulit
terdeteksi secara kuantitatif. Untuk dapat mengkuantisasi pita-pita eRF3 hasil studi interaksi in
vitro diperlukan antibodi anti eRF3.

Manfaat Western Blotting

Konstruksi antibodi anti eRF3 telah dilakukan, tetapi antibodi ini belum terkarakterisasi
dengan baik. Sehingga dilakukan analisa Western blotdengan cara mengukur tingkat spesifitas
dan sensitifitas antibodi anti eRF3 terhadap protein eRF3. Spesifitas antibodi ditentukan
berdasarkan kemampuan antibodi ini dalam mengenali epitop protein eRF3 dari berbagaiprotein
yang terdapat pada crude extract ragi, sedangkan sensitifitasnya ditentukan melalui variasi
jumlah antigen (eRF3) yang berinteraksi dengan antibodi tersebut.
Avian reo (respiratory enteric orphan)-virus (ARV) merupakan agen penyakit penting pada
peternakan ayam dan kalkun di seluruh dunia. Infeksi ARV menyebabkan kondisi multi penyakit,

se perti viral arthritis, tenosynovitis, stunting/runting syndrome, penyakit pernafasan, penyakit

enteric dan malabsorption syndrome
Preparasi sampel dan isolasi virus
Lima ekor ayam pedaging masing-masing berasal dari dua flok peternakan yang berbeda,
digunakan sebagai sampel. Satu flok dengan gangguan pertumbuhan dan kelumpuhan (flok I),
serta flok lainnya dengan kelumpuhan dan pembengkakan sendi kaki (flok II). Beberapa organ
dan cairan tubuh, seperti limpa, saluran pencernaan (usus), saluran pernafasan (trachea), cairan
sinovial, hock-joint dan serum dikumpulkan. Organ tersebut kemudian digerus dan dibuat
suspensi 10% dengan penambahan Phosphate Buffer Saline (PBS) yang mengandung antibiotik
(100 I U penisilin dan streptomisin 100g/ml suspensi). Sebagian suspensi langsung diperiksa
secara serologic dan sebagian lagi suspensi diinokulasikan pada chorioallantois membrane
(CAM) telur ayam berembrio (TAB) umur 9 hari dengan dosis 0,1 ml/butir. Isolasi virus pada
kultur sel CEF ditumbuhkan pada media Dolbeccos Modified Eaglel Medium (DMEM) dan
Rose Park Memorial Intitute (RPMI) yang mengandung Foetal Bovine Serum (FBS) 0,5%.
Pengamatan dilakukan selama 4 hari dan pada akhir pengamatan semua TAB dan kultur sel
diidentifikasi melawan antibody anti-reovirus dengan teknik is-ELISA (Olson, 1980).
Antibodi anti-ARV
Antibodi anti-ARV diproduksi pada mencit dan ayam. Imunisasi pada mencit menggunakan ARV
strain S1133 dan pada ayam menggunakan ARV isolat lokal.
Identifikasi virus dengan indirect sandwich-ELISA
Identifikasi terhadap ARV dilakukan dengan metode yang dikembangkan oleh Suwarno (2005).
Sebanyak 100 l antibodi primer (mencit anti-ARV dengan pengenceran 1/100) di-coating pada
sumuran mikroplat ELISA menggunakan bufer coating (50 mmol karbonat, pH 9,6) dan
diinkubasi pada suhu 4C semalam. Selanjutnya sumuran mikroplat dicuci 4 kali dengan bufer
washing (0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20; ph 8,6) dan diblok menggunakan buffer blocking
(PBS-Tween pH 7,4 yang mengandung 4% skim milk) sebanyak 200 l/sumuran dan diin kubasi
pada suhu 37C 1 jam. Berikutnya sumuran mikroplat dicuci 4 kali, untuk kemudian

ditambahkan suspense yang diduga mengandung ARV (berasal dari cairan sinovial, suspensi
hock-joint, limpa, usus, trachea, serum dan CAM TAB) pada pengenceran 1/50, 1/100 dan pekat,
sebanyak 100 l/sumuran dan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Sebagai kontrol
positif digunakan ARV isolat lokal dan ARVS1133, serta sebagai kontrol negatif berupa organ
sama berasal dari hewan dan TAB normal . Pasca pencucian, sumuran mikroplat ditambah
dengan antibodi sekunder (ayam anti-ARV pada pengenceran 1/100) sebanyak 100 l/sumuran
dan diinkubasi kembali. Tahap berikutnya sumuran mikroplat dicuci dan seterusnya ditambah
dengan konjugat goat antichicken Ig G yang dilabel dengan alkali fosfatase , serta diinkubasi
kembali. Tahap terakhir setelah proses pencucian, setiap sumuran mikroplat ditambah dengan
substrat p-NPP 2,7 mmol/l (dalam buffer substrat yang mengandung 1 M d ietanolamin; 0,5 M
MgCl2, pH 9,8) sebanyak 100 l, diinkubasi suhu kamar pada ruang gelap. Tigapuluh menit
kemudian reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 l NaOH 3 N pada tiap sumuran dan
resapan dibaca pada ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm.
Analisis protein dengan SDS-PAGE dan Western blot
Analisis protein terhadap ARV dilakukan dengan teknik SDS-PAGE menggunakan komposisi gel
12%. Sebanyak 15 l sampel didenaturasi dengan bufer Laemmli dan diinkubasi pada suhu 420
C selama 2 jam, kemudian dimasukkan dalam sumuran pada stacking gel. Elektroforesis
dijalankan dengan tegang - an 120 V dan kuat arus 25 mA selama kurang lebih 1 jam. Gel
kemudian dicuci untuk selanjutnya diwarnai dengan Coomassie blue (larutan fiksasi 33,3%
methanol dan 10% asam asetat yang mengandung 0,25% Coomassie blue) selama 30 menit.
Berikutnya gel disimpan dalam larutan asam asetat 10%. Untuk western blot, protein tanpa
diwarnai ditransfer pada membran nitoselulose selama 1 jam dengan kuat arus 100mA dalam
semidry blotting apparatus. Membran kemudian diblok dengan 1% Bovine Serum Albumin
(BSA) selama 20 menit dan dicuci 3x5 menit dengan PBS-Tween, ditambahkan antiserum ayam
anti-ARV pada konsentrasi 1/100 selama 3 jam. Membran dicuci 3x5 menit dan ditambah
konjugat goatantichicken pada konsentrasi 1/1000 selama 1 jam. Tahap akhir, membran dicuci
3x5 menit dan diwarnai dengan western blue (Grande et al., 2002).
Analisis data

Data berupa nilai Optical Density (OD) hasil pembacaan ELISA ditentukan berdasarkan Cut off
Value (COV). Nilai OD sampel dinyatakan positif apabila memiliki COV sebesar 1,5 kali dari
rata-

rata

kontrol negatif (de Savigny dan Voller, 1980).

Hasil dan pembahasan
Data pada Tabel 1 menunjukkan hasil pengujian sejumlah organ terhadap adanya ARV dengan
teknik is-ELISA. Semua organ yang diperiksa mem berikan hasil positif (+), kecuali serum darah
dengan hasil negatif. Batasan positif didasarkan atas COV sebesar 0,197. Nilai OD sampel
0,197 dinyatakan positif (de Savigny dan Voller, 1980). Hasil identifikasi menunjukkan, bahwa
ARV dapat dideteksi secara langsung di sejumlah organ, seperti cairan sinovial, hock-joint,
limpa, trachea dan usus. Berdasarkan hasil identifika si dengan is-ELISA terdapat pola yang
sama antara ARV isolat lokal dengan ARV yang berhasil diisolasi pada penelitian ini. Perbedaan
pola justru muncul jika dibandingkan dengan kontrol positif ARV-S1133. Antibodi anti-ARV
isolat lokal kurang dapat mengikat ARV-S1133, sehingga memberikan nilai OD yang rendah.
Diduga terdapat perbedaan genetik antara ARV-S1133 dengan ARV hasil isolasi. Menurut
Shumelevitz et al. (2002), antara strain avirulen ARV-1133 dengan strain virulen ARV-76
memiliki urutan sekuens nukl eotida dengan derajat tinggi pada segmen genom S1 dan terdapat
20 nukleotida yang mengalami salah letak. Perubahan ini terjadi pada ujung-3 Open Reading
Frame (ORF) C dan urutan 450 nukleotida pada ujung-5, yang menyebabkan anti genesitas
dari kedua strain ini berbeda.

Secara nyata tersirat, bahwa cairan sinovial dan hock-joint memiliki kandungan virus tertinggi
dibanding organ lainnya, karena hock joint merupakan cell tropism bagi ARV. Infeksi ARV dapat
menyebabkan pembengkakan bilateral tendon fleksor digitalis dan ekstensor tarsometatarsal,
serta pecahnya tendon gastroknemius (Fenner et al., 1995). Organ dalam, seperti limpa yang
berperan sebagai penyaring antigen juga menunjukkan kandungan virus cukup tinggi, selain
trachea dan usus. Pe ngujian serum dengan hasil negatif dapat disebabkan karena infeksi sudah
berjalan beberapa hari, sehingga fase viremia sudah berlalu. Menurut Ni dan Kemp (1995) dan
Huang (1995), beberapa strain ARV virulen setelah infeksi melalui saluran gastrointestinal dapat
menyebar ke seluruh organ tubuh, dan menetap menjadi infeksi persisten. Salah satu manifestasi
pada infeksi kronik adalah timbulnya arthritis pada tendon. Infeksi pada sel tendon
menunjukkan, bahwa pelepasan progeny virus masih terus berlangsung sampai hari ke-16. Pada
penelitian ini belum dapat dibedakan ada tidaknya hubungan antigenik antara strain ARV yang
menginfeksi flok I dan flok II.
Data pada Tabel 2 menunjukkan hasil pengamatan terhadap perubahan pada CAM TAB dan
kultur sel CEF pasca inokulasi dengan isolat virus. Hasil isolasi virus pada TAB dan kultur sel

CEF, kemudian dideteksi dengan cara yang sama juga menunjukkan hasil positif. Pertumbuhan
virus pada CAM TAB ditandai dengan timbulnya bintil -bintil pock berwarna merah muda,
sedangkan pada kultur sel dijumpai adanya cytophatic effect (CPE) berupa bentukan sinsitium
(Olson, 1980). Perubahan ini menunjukkan adanya pertumbuhan virus. Teknik isolasi sangat
bermanfaat terutama untuk memperbanyak jumlah virus dan mempermudah deteksi. Beberapa
sampel yang semula menunjukkan hasil negatif, setelah diisolasi pada TAB dan kultur s el CEF
menjadi positif. Menurut Labrada et al.( 2002), CPE pada kultur sel CEF timbul akibat ARV
menginduksi apoptosis. Apoptosis yang diprogram melalui intracellular apoptotic terjadi pada
tahap awal siklus hidup virus.
Hasil analisis protein ARV dengan teknik SDS-PAGE menggunakan pewarnaan Coomassie blue
dapat dilihat pada Gambar 1. Teknik SDS -PAGE hanya dapat menunjukkan protein pada bagian
inti, yakni A dengan berat molekul 147,5 kDa; B 130,6; C 114,3; A 74,1dan A 41;
sedangkan bagian luar kapsid adalah protein B 70,8; B 38,8 dan C 31,7 kDa. MartinezCostas et al.(1997) dengan menggunakan ARV-1133 mendapat gambaran hampir sama tentang
berat molekul protein. Berturut -turut gambara protein bagian inti ARV -1133 masing-masing
dengan berat molekul 147, 130, 120, 79 dan 43 kDa, sedangkan protein bagian luar kapsid
masing-masing dengan berat molekul 72, 42 dan 34 kDa. Pada penelitian ini protein yang tercat
tebal (A, B dan B) tampak dominan dan dapat dihubungkan dengan persentase bagian virion
yang lebih besar disbanding protein lain yang terliha t lebih tipis. Menurut Schnitzer et al.(1982)
virion tersusun atas polipeptida A sebesar 12%, B 1%, C 9%, A 6%, B 32%, A 9%, B
30%, dan C 1%. ,ml;,k[ll

Attwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling dan F. Vella (Ed), 2006,Oxford
Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition, Oxford University
Press.
Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein, 1996, Protein Method, Wiley-Liss, Inc

Kindt, T.J., R.A.Goldsby, B.A. Osborne, J. Kuby, 2007, Kuby Immunology, W.H. Freeman,
New York.
Koolman, J. dan K. Roehm, 2005, Color Atlas of Biochemistry, Second edition, revised and enlarged, Thieme.

Wenk, M.R. dan A.Z. Fernandis, 2007, Manuals in Biomedical Research : A Manual For Biochemistry
Protocols, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd

Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein. 1996. Protein Method. Wiley-Liss, Inc
Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.