I.

Pengertian Teknologi Fermentasi

Fermentasi mempunyai pengertian suatu proses terjadinya perubahan

kimia pada suatu substrat organik melalui aktivitas enzim yang dihasilkan oleh
mikroorganisme. Untuk hidup semua mikroorganisme membutuhkan sumber
energi yang diperoleh dari metabolisme baahan pangan dimana mikroorganisme
berada di dalamnya. Bahan baku energi yang paling banyak digunakan oleh
mikroorganisme

adalah

glukosa.

Dengan

adanya

oksigen

beberapa

mikroorganisme mencerna glukosa dan menghasilkan air, karbondioksida, dan

sejumlah besar energi (ATP) yang digunakan untuk tumbuh. Ini adalah
metabolisme tipe aerobik. Akan tetapi beberapa mikroorganisme dapat mencerna
bahan baku energinya tanpa adanya oksigen dan sebagai hasilnya bahan baku
energi ini hanya sebagian yang dipecah. Bukan air, karbondioksida, dan sejumlah
besar energi yang dihasilkan, tetapi hanya sejumlah kecil energi, karbondioksida,
air, dan produk akhir metabolik organik lain yang dihasilkan. Zat-zat produk akhir
ini termasuk sejumlah besar asam laktat, asam asetat, dan etanol, serta sejumlah
kecil asam organik volatil lainnya, alkohol dan ester dari alkohol tersebut.
Pertumbuhan yang terjadi tanpa adanya oksigen sering dikenal sebagai fermentasi.
II.

Bahan Teknologi Fermentasi yang Terlibat

Fermentasi bahan pangan adalah sebagai hasil kegiatan beberapa jenis

mikroorganisme baik bakteri, khamir, dan kapang. Mikroorganisme yang

memfermentasi

bahan

pangan

dapat

menghasilkan

perubahan

yang

menguntungkan (produk-produk fermentasi yang diinginkan) dan perubahan yang

merugikan (kerusakan bahan pangan). Dari mikroorganisme yang memfermentasi
bahan pangan, yang paling penting adalah bakteri pembentuk asam laktat, asam
asetat, dan beberapa jenis khamir penghasil alkohol. Jenis-jenis mikroorganisme
yang berperan dalam teknologi fermentasi adalah :
A. Bakteri Asam Laktat.
Dari kelompok ini termasuk bakteri yang menghasilkan sejumlah besar
asam laktat sebagai hasil akhir dari metabolisme gula (karbohidrat). Asam laktat
yang dihasilkan dengan cara tersebut akan menurunkan nilai pH dari lingkungan
pertumbuhannya dan menimbulkan rasa asam. Ini juga menghambat pertumbuhan

dari beberapa jenis mikroorganisme lainnya. Dua kelompok kecil mikroorganisme

dikenal

dari

kelompok

ini

yaitu

organisme-organisme

yang

bersifat

homofermentative dan heterofermentative.

Jenis-jenis homofermentatif yang terpenting hanya menghasilkan asam
laktat

dari

metabolisme

gula,

sedangkan

jenisjenis

heterofermentatif

menghasilkan karbondioksida dan sedikit asam-asam volatil lainnya, alkohol, dan

ester disamping asam laktat. Beberapa jenis yang penting dalam kelompok ini:
Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis dan Streptococcus
cremoris. Semuanya ini adalah bakteri gram positif, berbentuk bulat (coccus) yang
terdapat sebagai rantai dan semuanya mempunyai nilai ekonomis penting dalam
industri susu.
Pediococcus cerevisae. Bakteri ini adalah gram positif berbentuk bulat,
khususnya terdapat berpasangan atau berempat (tetrads). Walaupun jenis ini
tercatat sebagai perusak bir dan anggur, bakteri ini berperan penting dalam
fermentasi daging dan sayuran.
Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum. Bakteri ini adalah
gram positif berbentuk bulat yang terdapat secara berpasangan atau rantai pendek.
Bakteri-bakteri ini berperanan dalam perusakan larutan gula dengan produksi
pertumbuhan dekstran

berlendir. Walaupun

demikian, bakteribakteri ini

merupakan jenis yang penting dalam permulaanfermentasi sayuran dan juga

ditemukan dalam sari buah,anggur, dan bahan pangan lainnya.
Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii. Organisme-organisme ini
adalah bakteri berbentuk batang, gram positif dan sering berbentuk pasangan dan
rantai dari sel-selnya. Jenis ini umumnya lebih tahan terhadap keadaan asam dari
pada jenis-jenis Pediococcus atau Streptococcus dan oleh karenanya menjadi lebih
banyak terdapat pada tahapan terakhir dari fermentasi tipe asam laktat. Bakteri
bakteri ini penting sekali dalam fermentasi susu dan sayuran.
B. Bakteri Asam Propionat
Jenis-jenis yang termasuk kelompok ini ditemukan dalam golongan
Propionibacterium, berbentuk batang dan merupakan gram positif. Bakteri ini
penting dalam fermentasi bahan pangan karena kamampuannya memfermentasi

karbohidrat dan juga asam laktat dan menghasilkan asam-asam propionat, asetat,
dan karbondioksida. Jenis-jenis ini penting dalam fermentasi keju Swiss.
C. Bakteri Asam asetat
Bakteri ini berbentuk batang, gram negatif dan ditemukan dalam golongan
Acetobacter sebagai contoh Acetobacter aceti. Metabolismenya lebih bersifat
aerobik (tidak seperti spesies tersebut di atas), tetapi peranannya yang utama
dalam fermentasi bahan pangan adalah kemampuannya dalam mengoksidasi
alkohol dan karbohidrat lainnya menjadi asam asetat dan dipergunakan dalam
pabrik cuka.
D. Khamir
Khamir sejak dulu berperan dalam fermentasi yang bersifat alkohol
dimana produk utama dari metabolismenya adalah etanol. Saccharomyces
cerevisiae adalah jenis yang utama yang berperan dalam produksi minuman
beralkohol seperti bir dan anggur dan juga digunakan untuk fermentasi adonan
dalam perusahaan roti.
E. Kapang
Kapang jenis-jenis tertentu digunakan dalam persiapan pembuatan
beberapa macam keju dan beberapa fermentasi bahan pangan Asia seperti kecap
dan tempe. Jenis-jenis yang termasuk golongan Aspergillus, Rhizopus, dan
Penicillium sangat penting dalam kegiatan tersebut. Dalam proses fermentasi,
mikroorganisme harus mempunyai 3 (tiga) karakteristik penting yaitu:
1. Mikroorganisme harus mampu tumbuh dengan cepat dalam suatu substrat
dan lingkungan yang cocok untuk memperbanyak diri.
2. Mikroorganisme harus memiliki kemampuan untuk mengatur ketahanan
fisiologi dan memilki enzim-enzim esensial yang mudah dan banyak
supaya perubahanperubahan kimia yang dikehendaki dapat terjadi.
3. Kondisi lingkungan yang diperlukan bagi pertumbuhan harus sesuai
supaya produksi maksimum.
Berdasarkan sumber mikroorganisme, proses fermentasi dibagi 2 (dua)
yaitu:
1. Fermentasi spontan, adalah fermentasi bahan pangan dimana dalam
pembuatannya tidak ditambahkan mikroorganisme dalam bentuk starter
atau ragi, tetapi mikroorganisme yang berperan aktif dalam proses

fermentasi berkembang baik secara spontan karena lingkungan hidupnya

dibuat sesuai untuk pertumbuhannya, dimana aktivitas dan pertumbuhan
bakteri asam laktat dirangsang karena adanya garam, contohnya pada
pembuatan sayur asin.
2. Fermentasi tidak spontan adalah fermentasi yang terjadi dalam bahan
pangan yang dalam pembuatannya ditambahkan mikrorganisme dalam
bentuk starter atau ragi, dimana mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan
berkembangbiak secara aktif merubah bahan yang difermentasi menjadi
produk yang diinginkan, contohnya pada pembuatan tempe dan oncom.
III.

Asimilasi, Biosintesa, Desimilasi, dan Hidrolisis

Pertumbuhan mikroba dalam medianya terdiri dari beberapa tahapan

yaitu : pertumbuhan asimilasi, biosintesi, desimilasi, dan hidrolisis (Winarno

1973). Pertumbuhan merupakan pertambahan ukuran sel yang terdiri atas
pertumbuhan logaritmik, fase setimbang, dan fase kematian (Pelczar dan Chan
1977). Transformasi substrat ke dalam bahan sel yang berfungsi memberikan
bahan yang diperlukan bagi pertumbuhan dan aktivitas hidup lainnya disebut
asimilasi, sementara itu, pembentukan senyawa kompleks di dalam sel dalam
jumlah yang lebih besar dari kebutuhan aktivitas hidupnormal merupakan
biosintesis. Disimilasi terjadi di dalam sel dan hasilnya dilepaskan ke media
lingkungannya. Pengaruh suhu, pH, tekanan, oksigen, dan konsentrasi substrat
berperan pada aktivitas mikroorganisme dalam fermentasi (Pelczar dan Chan,
1977).
a)

Pertumbuhan
Pertumbuhan merupakan pertambahan secara mikroindividu atau seluruh

kelompok mikroorganisme yang hidup bersama sebagai satu koloni/ biakan.Bila

suatu sel mikroorganisme mikroorganisme ditempatkan ditempatkan dalam suatu
medium yang medium yang mengandung mengandung nutrisi nutrisi yang
diperlukan

diperlukan

untuk

pertumbuhan

pertumbuhan

mikroorganisme

mikroorganisme, di dalam suatu sistem tertutup tertutup (batchsystem) maka pola

pertumbuhannya pertumbuhannya mengikuti mengikuti fase s-fase tertentu
tertentu. Menurut Lim (1998), bakteri akan membelah diri dalam waktu 20-90
menit, ragi 90-120 menit, dan kapang 4-8 jam. Syarat mikroba tumbuh adalah ada

sel hidup, ada sumber energi, ada nutrisi dan faktor pertumbuhan, tidak ada
inhibitor atau toksin, kondisi fisikokimia yang mendukung.
b)
Asimilasi
Asimilasi merupakan aktivitas transformasi sebagai komponen dari
substrat ke dalam sel yang berfungsi memberikan bahan-bahan yang diperlukan
bagi pertumbuhan dan aktivitas hidup.Asimilasi merupakan aktivitas metabolisme
yang memerlukan energi (anabolisme) dan menghasilkan senyawa tertentu (Jarvis,
1978).
c)
Biosintesis
Biosintesis sering juga disebut metabolisme.Biosintesis atau metabolism
ini merupakan pembentukan senyawa kompleks di dalam sel dalam jumlah yang
lebih besar dari kebutuhan pemeliharaan aktivitas hidup normal. Contoh: vitamin,
enzim, dll. Metabolisme pada semua organisme pada prinsipnya memiliki
kesamaan (Unity in biochemeistry) namun ada beberapa perbedaan tergantung
pada jenis organismenya.Metabolisme mikroba meliputi semua reaksi biokimia
yang terjadi dalam sel mikroba yang berperan penting dalam regenerasi energi dan
metabolit.

Gambar 1. Metabolisme Mikrooganisme

d)

Desimilasi
Desimilasi atau disimilasi merupakan kebalikan dai asimilasi. desimilasi
dapat diartikan sebagai proses perubahan komponen organic menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Proses ini terjadi di dalam sel dan
hasilnya dilepaskan ke media lingkungan. Contoh: karbohidrat, asam
amino.

IV.

Katabolisme Aerobik dan Anaerobik

Pengertian Katabolisme adalah proses penguraian atau pemecahan

senyawa organik kompleks menjadi senyawa sederhana. Dalam proses

katabolisme, terjadi pelepasan energi sebagai hasil pemecahan senyawa-senyawa

organik kompleks tersebut. Adapun anabolisme adalah proses pembentukan atau

penyusunan senyawa organik sederhana menjadi senyawa kompleks. Kebalikan
dari katabolisme, proses anabolisme ini memerlukan energi. Kali ini akan dibahas
mengenai proses katabolisme.
Contoh dari proses katabolisme adalah respirasi selular. Berbeda dengan
pengertian respirasi pada umumnya (proses pengikatan O2 ), respirasi selular
diartikan sebagai reaksi oksidasi molekul berenergi tinggi untuk melepaskan
energinya. Respirasi selular terjadi pada semua sel tubuh hewan maupun
tumbuhan terutama di mitokondria. Pada respirasi selular, molekul glukosa
(karbohidrat) dan bahan makanan lain diuraikan atau dipecah menjadi karbon
dioksida (CO2 ), air (H2 O), dan energi dalam bentuk ATP.
A. Respirasi Anaerob
Respirasi anaerob merupakan respirasi yang tidak memerlukan oksigen
atau O2.

Respirasi anaerob terjadi di bagian sitoplasma yang bertujuan

mengurangi senyawa organik. Respirasi anaerob menghasilkan sejumlah energi

yang lebih kecil yaitu 2 ATP. Proses respirasi anaerob didapati pada reaksi
fermentasi dan pernapasan intra molekul. Respirasi anerob, glukosa dipecah
secara tidak sempurna menjadi komponen H2O dan CO2. Di respirasi anaerob,
hidrogen bergabung bersama sejumlah komponen yaitu Asam Piruvat,
Asetaldehida yang selanjutnya membentuk asam laktat dan etanol.
B. Respirasi Aerob
Respirasi aerob adalah sebuah reaksi katabolisme yang memerlukan
suasana aerobic dengan proses keberadaan oksigen sangat dibutuhkan yang
menghasilkan energi dengan jumlah yang besar. Energi yang disimpan dalam
bentuk kimiawi yang dikenal dengan kode ATP. Energi ATP digunakan oleh sel
dalam tubuh makhluk hidup untuk menunjang pertumbuhan, gerak, transportasi,
reproduksi dan kegiatan yang lainnya. Untuk lebih sederhananya, rumus aerob
digambarkan secara sederhana yaitu C6H12+6O2=6HCO2+6H2O.
Respirasi aerob dibagi dalam 3 tahapan yaitu :
1. Glikolisis adalah proses pemecahan molekul C6 atau glukosa yang menjadi
senyawa asam piruvat atau dikenal dengan rumus kimia C3

2. Siklus krebs, ialah reaksi molekul aseil CoA yang kemudian menghasilkan
oksalosetat dan asam sitrat.
3. Transpor electron, merupakan reaksi reduksi atau oksidasi NADH2 dan
molekul FADH2 yang akhirnya menghasilkan H2O energi berupa ATP
Perbedaan Respirasi Anaerob dan Aerob
1. Respirasi Aerob

Memerlukan oksigen

Proses yang terjadi dalam matriks mitokondria

Untuk memecah senyawa organik ke an-organik menghasilkan energi

dalam jumlah besar yaitu 36 ATP

2. Respirasi Anaerob

V.

Tidak memerlukan kehadiran oksigen dalam prosesnya

Berlangsung dalam sitoplasma

Tujuan untuk mengurangi senyawa organik

Menghasilkan energi tapi dalam jumlah sedikit yaitu 2 ATP

Medium Fermentasi dan Jenisnya
Medium fermentasi memiliki fungsi untuk menyediakan semua nutrisi

yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk memperoleh energi, pembentukan

sel dan biosintesis produk-produk metabolisme. Oleh karena itu, suatu medium
fermentasi harus mengandung komponen-komponen yang diperlukan oleh
mikroorganisme dalam proses fermentasi. Komponen-komponen tersebut adalah:
1. Air
Semua proses fermentasi, kecuali solid-substrat fermentasi, memerlukan
sejumlah besar air. Di banyak kasus juga menyediakan elemen mineral. Tidak
hanya Air merupakan komponen utama dari semua media, tetapi penting untuk
peralatan pendukung dan pembersihan.
2. Sumber karbon

Sumber karbon yang umum digunakan adalah karbohidrat, antara lain;

serealia, umbi ketela pohon, jagung dan lain-lain. Selain itu juga yang umum
digunakan adalah sukrosa yang diperoleh dari gula tebu, laktosa yang diperoleh
dari gula susu serta corn step liquor dari hasil samping ekstrak pati jagung dan
molase, malt extract, starch, sulphite waste liquor, selulosa serta whey.
3. Sumber Nitrogen
Kebanyakan mikroba industri dapat memanfaatkan baik anorganik dan
organik sumber nitrogen. Nitrogen anorganik mungkin disediakan sebagai garam
amonium, amonium sulfat seringkali dan diamonium hidrogen fosfat, atau
amonia. Amonia juga dapat digunakan untuk mengatur pH fermentasi. Sumber
nitrogen organik termasuk amino asam, protein dan urea. Nitrogen sering
disediakan dalam mentah bentuk yang pada dasarnya produk sampingan dari
industri lain, seperti jagung curam, minuman keras ekstrak ragi, peptones dan
kedelai makan. Asam amino murni hanya digunakan dalam situasi khusus,
biasanya sebagai prekursor untuk spesifik produk.
4. Mineral
Mg, P, K, S, Ca, dan Cl merupakan komponen penting dalam medium
fermentasi selain Cu, Co, Fe, Mo, Zn yang merupakan sumber mineral untuk
mikroorganisme dalam fermentasi.
5. Vitamin dan Faktor Pertumbuhan
Banyak bakteri dapat mensintesis semua vitamin yang diperlukan dari
elemen dasar. Untuk bakteri lainnya, jamur berfilamen dan ragi, mereka harus
ditambahkan sebagai suplemen untuk media fermentasi. Paling alami karbon dan
nitrogen Sumber juga mengandung setidaknya beberapa dari yang diperlukan
vitamin sebagai kontaminan ringan. Lainnya yang diperlukan faktor pertumbuhan,
asam amino, nukleotida, asam lemak dan sterol, ditambahkan baik dalam bentuk
murni atau, untuk ekonomi alasan, sebagai tanaman lebih murah dan ekstrak
hewan.
6. Buffer
Buffer merupakan zat untuk mengendalikan atau menjaga pH medium.
Biasanya pH medium dipertahankan sekitar pH netral.
pospat, protein, pepton, asam amino.

Misalnya, Ca , garam

7. Oksigen
Tergantung pada jumlah oksigen yang dibutuhkan oleh organisme, itu
mungkin diberikan dalam bentuk udara yang mengandung sekitar 21% (v / v)
oksigen, atau kadang-kadang sebagai oksigen murni ketika persyaratan yang
sangat tinggi.Organisme Kebutuhan oksigen dapat bervariasi tergantung pada
sumber karbon.
8. Antifoams
Antifoams diperlukan untuk mengurangi pembentukan busa selama
fermentasi. Busa ini terutama disebabkan oleh protein. Jika tidak dikontrol busa
dapat menghalangi filter udara, yang mengakibatkan kerugian kondisi aseptik.
VI.

Preparasi Proses Fermentasi

1. Tahapan fermentasi
1 Media Fermentasi
Perancangan substrat pertumbuhan dan pembentukan hasil merupakan

kunci keberhasilan percobaan atau produksi. Komponen-komponen yang

diperlukan bagi pertumbuhan diklasifikasikan ke dalam empat kategori, yaitu:

Substrat sebagai C-(N-, P-,O-,...) dan energi

Nutrien (elemen makro) untuk persiapan pembentukan block,

yaitu P, N, K, Mg, diperlukan dalam jumlah yang cukup

Elemen makro yang merupakan elemen esensial tetapi diperlukan

dalam jumlah yang kecil seperti Mn, Mo, Zn, Co, V, B, Cl, dan Si.
Faktor pertumbuhan seperti prekursor dan kofaktor. Bahan yang
umum digunakan adalah vitamin, asam amino, asam lemak tidak
jenuh, dan sterol. (Rialita dan Sumanti, 2008)

Sebagai sumber energi, karbohidrat dan protein diperlukan oleh mikroba

untuk menghasilkan ATP (adenosin trifosfat), serta produk hasil metabolisme
lainnya. Selain itu, mikroba juga memerlukan beberapa faktor pertumbuhan,
yaitu:

Asam amino, sebagai bagian dari protein

Vitamin, sebagai grup prostetik dari enzim
Purin dan pirimidin, sebagai bagian dari asam nukleat

Keperluan mikroba terhadap nutrisi umumnya bervariasi dan komposisi

kimia sel mikroba menunjukkan keperluan mikroba akan nutrisi tersebut. Unsur

C, O, N, H, P, dan S menyusun sekitar 96% dari berat kering sel di mana unsur
utamanya adalah unsur C sebanyak 50%, unsur O sebanyak 20%, dan unsur N
sebanyak 14%. Selain itu, diperlukan pula unsur mikro seperti K, Ca, Mg, Cl, Fe,
Mn, Co, Cu, Zn, dan Mo untuk pertumbuhan hampir semua mikroba.
2

Penyiapan Starter

Menurut Rialita dan Sumanti (2008), penyiapan starter meliputi regenerasi kultur
pada agar miring dan starter pada media cair yang dijelaskan sebagai berikut.

Regenerasi kultur
Pertumbuhan umum dapat dicapai bila kultur dalam keadaan segar

sebelum diinokulasikan. Untuk itu kultur yang akan digunakan diinokulasikan

pada media agar miring selama 48 jam. Selain itu regenerasi memungkinkan
untuk mendapatkan kultur starter dari fase eksponensial. Hal ini akan dapat
mempersingkat adaptasi dan laju pertumbuhan optimal yang mungkin diperoleh
dalam waktu yang relatif cepat.

Starter dalam Media Cair

Tujuan inokulasi ke dalam media cair adalah untuk mengadakan adaptasi

kultur dengan substrat yang digunakan. Pentahapan pembuatan starter dalam

media cair dimaksudkan untuk memudahkan kultur beradaptasi dengan
lingkungan yang baru. Seperti halnya regenerasi pada media agar, starter dalam
media cair juga bertujuan untuk mempersiapkan inokulum pada fase eksponensial.
Komposisi media cair ini dibuat dengan basis konssentrasi substrat yang
lebih encer.Jumlah yang diperlukan sesuai dengan volume fermentasi sehingga
dicapai volume inokulum 10 persen, yang diawali dengan 50 ml media cair.
3

Sterilisasi
Tujuan sterilisasi adalah mematikan mikroorganisme pencemar atau yang

tidak dikehendaki, sehingga proses fermentasi berjalan sempurna. Secara umum

produk fermentasi dihasilkan dengan kultur yang mengandung satu jenis atau
lebih mikroorganisme dalam suatu substrat bernutrisi.
Sterilisasi secara umum menggunakan panas atau uap air terutama untuk
mensterilkan

substrat.Penggunaan

panas

(uap),

selain

dapat

membunuh

mikroorganisme juga dapat merusak komponen substrat. Salah satu akibat yang
dapat ditimbulkan selama proses sterilisasi substrat adalah penurunan nilai nutrisi.

Dua tipe dasar reaksi yang menurunkan nilai nutrisi selama fermentasi adalah
interaksi antara komponen media dan degradasi komponen yang peka terhadap
panas (seperti vitamin dan asam amino). (Rialita dan Sumanti, 2008)
4

Pemanenan dan Pemurnian Hasil

Ekstraksi dan pemurnian hasil fermentasi seringkali sulit dan mahal.Secara

ideal, pemurnian dilakukan untuk mendapatkan hasil yang bermutu tinggi dalam
waktu yang singkat, dengan laju pengumpulan yang efisien, investasi yang
minimum,

serta

dioperasikan

pada

tingkat

biaya

yang

minimal.Untuk

mendapatkan pengumpulan dan pemurnian, kecepatan operasi merupakan faktor

penting karena produk bersifat labil.Tipe dan ukuran alat harus sesuai sehingga
memungkinkan pemanenan dilakukan pada batas waktu yang memuaskan.
Beberapa kriteria yang mendasari pemilihan proses pengumpulan adalah:
a
b
c
d
e
f
VII.

Lokasi produk intraseluler atau ekstraseluler

Konsentrasi produk dalam cairan fermentasi
Sifat fisik dan kimia produk
Batas kotoran minimal
Kotoran dalam cairan fermentasi
Harga pasar

Kriteria Mikroba yang Diperlukan untuk Fermentasi

Dalam fermentasi makanan tentunya membutuhkan mikroba sebagai

media yang diharapkan akan menghasilkan suatu produk baru dengan nilai yang
tinggi. Persiapan atau pengawetan bahan pangan dengan cara fermentasi
tergantung pada produksi mikroorganisme tertentu. Perubahan-perubahan
biokimia

yang

terjadi

karena

fermentasi

mikroba

ada

yang

bersifat

menguntungkan dan ada yang bersifat merugikan, oleh karena itu dalam
melakukan fermentasi ada beberapa syarat yang harus dipenuhi agar dapat
membuat mikroba dapat bekerja dengan optimal, yaitu :
1. Murni
Mikroba yang akan di biakkan harus dalam keadaan murni atau
steril hal ini bertujuan untuk membantu menghasilkan produk yang
berkualitas tinggi
2. Unggul

Mikroba yang digunakan haruslah memiliki sifat unggul yang

berarti

bahwa

mikroba

yang

diharapkan

adalah

mikroba

yang

menguntungkan
3. Stabil
Kestabilan mikroba sangatlah dibutuhkan karena jika mikroba
hidup tidak stabil maka proses penanganan dan produksi akan terganggu,
bisa saja dalam proses pemanfaatannya mikroba sewaktu-waktu akan mati
4. Bukan Pathogen
Tentunya mikroba yang akan digunakan bukanlah mikroba yang
bersifat pathogenic baik bagi manusia maupun hewan
5. Mampu tumbuh cepat dalam substrat dan lingkungan yang cocok
untuk memperbanyak diri.
6. Mudah dibudidayakan dalam jumlah yang besar
7. Mikroorganisme harus memiliki kemampuan untuk mengatur ketahan
fisiologi dan memiliki enzim essential yang mudah dan banyak supaya
perubahan-perubahan kimia yang dikehendaki dapat terjadi
8. Kondisi lingkungan yang diperlukan bagi pertumbuhan harus sesuai
supaya produksi maksimum
A. Sumber Mikroba untuk industri.
Mikroba yang umum digunakan dalam industri fermentasi terutama
tergolong dalam bakteri dan fungi tingkat rendah yaitu kapang dan khamir. Selain
digunakan dalam industri fermentasi, mikroba juga banyak digunakan untuk
tujuan lain, misalnya dalam pengolahan limbah dan pembersihan bahan-bahan
beracun, serta fiksasi nitrogen di bidang pertanian. Beberapa contoh penggunaan
mikroba untuk industri :
Produksi massa sel : protein sel tunggal untuk makanan ternak dan
manusia, pertisida (Bacillus thuringiensis). Penggunaan bagian-bagian yang
penting dari sel : biokatalis (enzim), antigen permukaan, protein lamelar untuk
filter membran, polisakharida kapsul (kriptoxantin, xantan, alginat, skleran,
kurdlan), pigmen, lipid (untuk biotransformasi lipid). Produksi metabolisme
primer : alkohol, asam organik, asam amino, kofaktor, vitamin (B12 dan
riboflavin), metana, hidrogen.

Produksi metabolisme sekunder : antibiotik, toksin, komponen flavor.

Aplikasi aktivitas metabolisme mikroba dalam :
1. Pengawetan : keju, yoghurt, saurkraut, pikel, sosis, silase.
2. Pengolahan : roti, kecap.
3. Pengolahan limbah dan pembersihan bahan-bahan beracun : penghilangan
fosfat, H2S, hidrokarbon halogenasi.
B. Pengaruh Nutrien Dan Lingkungan Terhadap Kecepatan Pertumbuhan
Mikroba.
Perbedaan dalam anatomi mikroba dan mekanisme pertumbuhan
menyebabkan perbedaan dalam kecepatan pertumbuhan. Pada umumnya semakin
kompleks struktur sel suatu organisme, semakin lama waktu yang dibutuhkan
untuk membelah diri atau semakin lama waktu generasinya. Oleh karena itu
bakteri mempunyai waktu generasi yang paling cepat, diikuti oleh khamir dan
kapang, sedangkan protozoa mempunyai waktu generasi yang paling lama.
1. Pengaruh Nutrien.
Kecepatan pertumbuhan pada fase logaritmik dipengaruhi oleh tersedianya
nutrien didalam medium dan dapat mencapai maksimum. Kecepatan pertumbuhan
mempengaruhi ukuran sel dan jumlah asam nukleat di dalam sel. Semakin tinggi
kecepatan pertumbuhan semakin besar ukuran sel dan semakin tinggi jumlah asam
nukleat di dalam sel. Demikian pula semakin tinggi kecepatan pertumbuhan akan
meningkatkan jumlah massa sel dan ribosoma per unit DNA.
2. Pengaruh Suhu.
Pengaruh

suhu

terhadap

kecepatan

pertumbuhan

spesifikmikroba

dapat

digolongkan menjadi:
(1). Psikrofilik
(2). Mesofilik
(3). Thermofilik.
Suhu juga mempengaruhi efisiensi konversi substrat (karbonenergi)
menjadi massa sel . Pada umumnya yield konversi maksimum terjadi pada suhu
yang lebih rendah dari pada suhu dimana kecepatan pertumbuhan maksimum.Hal
ini

penting

dalamproses

optimasi

dimana

diinginkan

pertumbuhanmaksimum tetapi bukan yield pertumbuhan maksimum.

3. Pengaruh Aktifitas air.

kecepatan

Air sangat penting untuk pertumbuhan mikroba karena selain merupakan

80% dari berat sel mikroba juga karena air berfungsi sebagai reaktan misalnya
dalam reaksi hidrolisis, dan sebagai produk misalnya dari reduksi oksigen dalam
sistem transpor elektron.
4. Pengaruh pH.
Kebanyakan mikroba dapat tumbuh pada kisaran pH sebesar 3 4 unit pH
atau pada kisaran 1000 10.000 kali konsentrasi ion hidrogen. Kebanyak bakteri
mempunyai pH optimum sekitar pH 6.5 7.5. Dibawah 5.0 dan diatas 8.5 bakteri
tidak tumbuh dengan baik. Khamir menyukai pH 4 5 dan tumbuh pada kisaran
pH 2.5 8.5. Oleh karena itu untuk menumbuhkan khamir biasanya dilakukan
pada pH rendah untuk mencegah kontaminasi bakteri. Kapang mempunyai pH
optimum antara 5 dan 7 dan dapat tumbuh pada kisaran pH 3 8.5. Nilai pH
untuk pertumbuhan mikroba mempunyai hubungan dengan suhu pertumbuhannya.
Jika suhu pertumbuhan naik, pH optimum untuk pertumbuhan juga naik. Dalam
fermentasi, kontrol pH penting sekali dilakukan karena pH yang optimum harus
dipertahankan selama fermentasi . Perubahan pH dapat terjadi selama fermentasi
karena H dilepaskan selama konsumsi NH4+ dan dikonsumsi selama metabolisme
NO3 -dan penggunaan asam amino sebagai sumber karbon.
5. Pengaruh Oksigen.
Berdasarkan kebutuhan akan oksigen mikroba dapat dibedakan yaitu
mikroba yang bersifat aerobik, anaerobik dan anaerobik fakultatif. Kapang dan
khamir pada umumnya bersifat aerobik, sedangkan bakteri dapat bersifat aerobik
dan anaerobik. Dalam fermentasi menggunakan mikroba aerobik, aerasi selama
proses fermentasi sangat berpengaruh terhadap produk akhiryang dihasilkan.
Setiap bakteri mempunyai suatu enzim yang tergolong flavoprotein yang dapat
bereaksi dengan oksigen membentuk senyawa-senyawa beracun yaitu H2O2 dan
suatu radikal bebas yaitu O2-.
Flavoprotein + O2

H2O2 + O2-

Bakteri yang bersifat aerobik mempunyai enzim-enzim yaitusuperoksida

dismutase yang memecah radikal bebas tersebut, dan enzim katalase yang
memecah H2O2 sehingga menghasilkan senyawa-senyawa akhir yang tidak
beracun. Bakteri yang bersifat anaerobik fakultatif juga mempunyai enzim

superoksida dismutase, tetapi tidak mempunyai enzim katalase, melainkan

mempunyai enzim peroksidase yang mengkatalis reaksi antara H2O2 dengan
senyawa eorganik, menghasilkan senyawa yang tidak beracun. Bakteri yang
bersifat anaerobik tidak mempunyai enzim superoksida dismutase maupun
katalase, oleh karena itu oksigen merupakan racun bagi bakteri tersebut karena
terbentuknya H2O2 dan O2-.
VIII. Cara Isolasi dan Identifikasi Mikroba
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba.
Identifikasi mikroba yaitu untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka
bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi
bakteri ini perlu, untuk mengenal nama bakteri. Disamping itu juga perlu
pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan sifat-sifat fisiologis ini kebanyakan
merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Sedangkan
konfirmasi jenis bakteri yaitu tindakan untuk mengetahui apakah suatu bakteri
tertentu benar tumbuh pada media spesifik yang digunakan. Terutama jika
identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum memuaskan. (Lim,D.
1998).
Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau
menganalisis metabolisme suatu mikroba khusus. Media spesifik ini beraneka
ragam komposisinya tergantung nutrisi apa yang diperlukan oleh bakteri tersebut.
Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus dapat
menumbuhkan

bakteri

tersebut

di

dalam suatu

biakan

murni.

Untuk

melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh

bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi
yang optimum bagi pertumbuhannya tersbut (Pelczar, 1986).
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba
mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber
karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang
pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin). Suatu media yang memenuhi
kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara

normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap media
spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung
pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba
lainnya. Sebagai contoh Media MCA ( Mac Conkey Agar) mengandung zat warna
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram Positif, sedangkan bakteri
Gram Negatif tetap tumbuh.
Mikroorganisme yang penting dalam industri fermentasi dapat diperoleh
dari berbagai sumber dialam. Sebagai contoh, bakteri pembentuk spora yaitu
Bacillus dan Clostridium sering ditemukan dari tanah, bakteri asam laktat sering
ditemukan pada susu, bakteri asam asetat sering ditemukan pada sari buah, dan
sebagainya. Untuk mendapatkan isolat mikroba dari suatu bahan yang
mengandung campuran mikroba dapat dilakukan dengan beberapa cara tergantung
dari jenis mikroorganismenya. Beberapa jenis isolasi :
1. Isolasi pada agar cawan.
Cara untuk mengisolasi kultur pada agar cawan adalah dengan goresan
kuadran.Pada bagian agar tempat dimulainya goresan, populasi mikroba biasanya
terlalu pekat sehingga koloni akan berkumpul menjadi satu.Dengan semakin
banyaknya goresan atau penyebaran yang dilakukan akan semakin sedikit sel-sel
mikroba yang terbawa oleh loop, sehingga setelah

inkubasi akan terbentuk

koloni-koloni secara terpisah.

2. Isolasi dalam medium cair.
Cara termudah untuk mengisolasi mikroba dalam medium cair adalah
metode pengenceran. Dalam metode ini, inokulum diencerkan didalam medium
steril, dan sejumlah tabung yang berisi medium diinokulasi dengan suspensi
inokulum dari masing- masing pengenceran.
3. Isolasi Sel tunggal.
Untuk mengisolasi sel mikroba yang ukurannya besar dan tidak dapat
diisolasi dengan metode agar cawan atau pengenceran, ada suatu cara isolasi yang
disebut isolasi sel tunggal.Sel mikroba yang dapat dilihat dengan pembesaran 100
kali atau kurang, setiap selnya dapat dipisahkan dan diambil menggunakan pipet
kapiler yang sangat halus, kemudian dicuci beberapa kali didalam medium steril

yang jumlah relatif besar untuk menghilangkan mikroba kontaminan yang

ukurannya lebih kecil.
IX.

Cara Pemeliharaan Kultur Fermentasi

Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan

harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh mikroorganisme

tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan
baik (Buckle, 1987).
Pemeliharaan Kultur Cair

Gambar 1. Pertumbuhan Mikroorganisme pada Permukaan Media Cair

Sumber : (www.google.com 2014)
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak
dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada
kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial
pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar. Metode lain yang digunakan untuk memelihara kultur
mikroorganisme adalah dengan menggunakan media cair, yaitu NB ( Nutrient
Broth).
Pemeliharaan Kultur Padat
Pada pemeliharaan mikroorganisme dengan kultur padat digunakan media
NA (Nutrient Agar) yang dibuat dengan metode agar tegak dan agar miring.
Pemeliharaan

kultur padat dilakukan dua proses, yaitu agar tegak dan agar

miring.
A. Agar Miring

Gambar 2. Pertumbuhan Mikroorganisme pada Agar Miring

Sumber : (www.google.com 2014)
Agar miring merupakan bentuk medium yang digunakan untuk
membiakkan mikroorganisme yang bersifat aerobic dan anaerobic fakultatif.
Penggunaan agar miring bertujuan untuk mendapatkan permukaan media yang
lebih luas sehingga mikrobia yang tumbuh pada media ini semakin banyak dan
jumlahnya tersebar sesuai dengan luas permukaan media agar miring (Cappucino
& Sherman, 1983).
B. Agar Tegak

Gambar 26. Pola Pertumbuhan Mikroorganisme pada Agar Tegak

Sumber : (www.google.com 2014)
Agar

tegak

merupakan

bentuk

medium

yang

digunakan

untuk

membiakkan mikroorganisme yang bersifat anaerobic. Mikroorganisme dapat

dibedakan menjadi 3 bagian besar berdasarkan kebutuhan akan oksigen untuk
pertumbuhannya yaitu aerobic, anaerobic, anaerobic fakultatif, dan mikroerofilik.
Organisme aerobic adalah organisme dimana tersedianya oksigen dan
penggunaannya dibutuhkan untuk pertumbuhan. Pada umumnya kapang dan
khamir bersifat aerobic sedangkan pada bakteri dapat bersifat aerobic dan
anaerobik, itu berarti pada agar miring, mikroorganisme yang tumbuh adalah
kapang, khamir, dan bakteri yang bersifat aerobic contohnya Salmonella,
Shigella, Pseudomonas, dan sebagainya. Sedangkan pada agar tegak biasanya

ditumbuhi mikroorganisme anaerobic, yaitu organisme yang tidak dapat tumbuh

dengan adanya oksigen dan bahkan oksigen ini dapat merupakan racun bagi
organisme tersebut. Jenis mikroorganisme yang tumbuh pada keadaan ini salah
satunya adalah Clostridium.
X.

Fermentor
Fermentor adalah sebuah alat yang digunakan untuk memproduksi

mikrobia untuk melakukan fermentasi. Produk-produk berbasis mikroba seperti

biofertilizer, biokontrol, biopestisida, biodekomposer, ataupun produk biomassa
mikroba memerlukan fermentor untuk memproduksinya. Fermentor untuk
memproduksi mikroba ini tidak harus berteknologi tinggi. Fermentor dapat dibuat
dengan peralatan sederhana, namun fungsional. Bahkan bisa dibuat sendiri dengan
biaya yang terjangkau. Ada banyak pertimbangan untuk memilih fermentor,
antara lain:
a.

tingkat kesulitan dan kerumitan proses,

b.

nilai produk yang dihasilkan,

c.

biaya investasi

d.

biaya yang dibutuhkan untuk memproduksi mikroba tersebut.

Jenis-jenis Fermentor
1. Fermentor Sederhana untuk Produksi Mikroba. Fermentor terdiri dari
beberapa bagian, yaitu:
a. Tabung fermentor, yaitu tabung untuk menempatkan media.
Tabung ini bisa dibuat dari galon air mineral.
b. Penutup tabung, bisa dibuat dari penutup karet.
c. Pipa inlet. Pipa kaca kecil yang dihubungkan dengan pompa udara.
Pipa kaca ini berukuran panjang hingga hampir menyentuh dasar
tabung. Pipa ini terendam di dalam larutan media.
d. Pipa outlet. Pipa kaca kecil yang lebih pendek dari pipa inlet dan
ujung bagian dalam berada di atas permukaan media. Ujung selang
outlet direndam dalam larutan clorin/pemutih atau alcohol.
e. Selang karet. Selang untuk menhubungkan pipa-pipa kaca.
f. Millipore. Saringan udara berukuran 0.2 um untuk sterilisasi udara
yang masuk ke dalam fermentor.

g. Pompa udara. Pompa udara untuk memberikan aerasi pada media

kultur. Pompa udara bisa menggunakan pompa udara untuk
aquarium.
h. Botol. Botol yang diberi air dan larutan pemutih (clorin).
Fermentor ini memiliki beberapa keuntungan. Pertama harganya murah
dan terjangkau. Untuk membuat satu fermentor sederhana membutuhkan biaya
kurang dari Rp. 1 juta. Fermentor dari stainless steel bisa mencapai puluhan juta.
Biaya paling besar untuk saringan micron yang mencapai beberapa ratus ribu.
Bahan lain harganya sangat murah. Keuntungan kedua, volumenya cukup, tidak
banyak dan tidak sedikit. Jika terjadi kontaminasi, maka tidak banyak
bahan/media yang dibuang. Keuntungan ketiga, mudah dioperasionalkan.
Perawatan juga mudah. Jika terjadi kerusakan bisa diperbaiki sendiri.
Fermentor ini cocok untuk menumbuhkan bakteri, khamir, atau alga. Bisa
juga untuk menumbuhkan jamur, tetapi jamur umumnya lebih baik dengan
menggunakan fermentasi padat. Bakteri-bakteri untuk biofertilizer seperti
Pseudomonas sp, Bacillus sp, Rhizobium sp, Bacillus thuringiensis, dan bakteri
lain bisa ditumbuhkan dengan fermentor ini. Fermentor ini juga bisa untuk
memproduksi sel bakteri, metabolit, protein sel tunggal ataupun biomassa sel
(kristal protein).
2. Fermentor - Lambda Minifor
Minifor ini dikembangkan sebagai hasil dari kebutuhan untuk membangun
sebuah laboratorium kecil untuk volume fermentor dari 0,035 ke 4.5l.
Berdasarkan pengalaman praktis pribadi panjang dalam fermentasi kami ingin
menciptakan sebuah fermentor, yang mudah digunakan dan dengan kapasitas
untuk mengukur dan mengendalikan semua parameter penting dari budaya
biologis. Para fermentor harus mengambil ruang minimal di bangku tapi dengan
akses yang baik ke semua bagian.
XI.

Scale Up Hasil Fermentasi

Penggandaan skala (scale up) adalah kegiatan untuk mendapatkan hasil

produksi yang identik (jika memungkinkan) pada skala yang lebih besar
didasarkan dari skala produksi yang telah ditetapkan sebelumnya. Definisi scale
up diatas mengasumsikan bahwa peningkatan kapasitas produksi berhubungan

dengan peralatan atau teknologi yang lebih besar dari peralatan produksi
sebelumnya. Alat yang biasanya digunakan untuk proses penggandaan skala
adalah fermentor aerobic berpengaduk. Adapun tahapan dari proses penggandaan
skala adalah sebagai berikut :
1
2

Skala laboratorium (tahap peneleksian mikroba)

a ukuran : dari tabung reaksi ke tabung kocok 500 ml
b fungsi : seleksi dan pengembangan strain mikroba
skala pilot-plan (kondisi-kondisi operasi optimum mulai diterapkan)
a ukuran : 5 40 - 200 liter
b fungsi : optimasi faktor-faktor lingkungan Skala
Industri
(pelaksanaan

proses-proses

dengan

mempertimbangkan

perhitungan ekonomi industry fermentasi tersebut)

Skala Industri
a ukuran : 5.000 - 100.000 liter
b fungsi : membawa proses ke arah keuntunganperusahaan
Menurut Fahrefi (2012), beberapa fungsi dari penggandaan skala (scale

up)diantaranya adalah sebagai berikut :

Membuat sistem baru yang lebih besar

Mengidentifikasi dan mengontrol komponen penting dan variabel

lainnya
Identifikasi dan kontrol parameter penting and rentang pengoperasian
pengembangan dan validasi prosedur pengolahan

Kondisi Lingkungan Optimal dalam Penggandana Skala

1
2

Faktor kimia : konsentrasi subtrat , konsentrasi precursor, dll.

Faktor fisik : Kemampuan pindah panas dan pencampuran medium,
disipasi tenaga, gaya gunting, perpindahan medium.(Amani, dkk, 2012).
Proses penggandaan skala dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut

(Vallentas, et al., 1991):

1

Menentukan hasil proses produksi yang diinginkan yakni konsentrat

albumin protein dari ikan gabus yang dihasilkan dalam bentuk tepung

kering ukuran 100 mesh.

Menentukan kriteria scale up awal, sebagai parameter yang membuat hasil
proses yang diinginkan sesuai dengan skala sebelumnya. Adapun
parameter scale up didasarkan pada teknologi yang digunakan dalam
pengolahan, volume produksi dan metode pengolahan yang dilakukan
pada pembuatan konsentrat protein albumin ikan gabus.

Menentukan kriteria kedua (secondary criteria) untuk proses secara

mekanik dan fisik pada skala yang harus diketahui berdasarkan kriteria
utama scale up. Kriteria kedua merupakan pengembangan 66 Portfolio 66
skala dari scale up awal dengan cara meningkatkan volume produksi dan
menentukan teknologi dan metode pengolahan yang akan dilakukan pada
industri yang lebih besar.
Lanti (2014) berpendapat bahwa dasar-dasar metode penggandaan skala

terdiri dari :
1

Konstanta gaya gunting Fermentasi pada media yang mengandung miselia

yang padat (fermentasi kapang), dipengaruhi olehgaya gunting atau nilai

mutlak kecepatan pengadukannya.

Konstanta waktu pencampuran Apabila fermentor berukuran kecil (<500
liter) biasanya tidak tercampur dengan baik. Apabila fermentor berukuran

besar (>5000 liter) kurang tercampur dengan baik.

Bilangan Reynolds Hubungan antara hasil proses dari penggandaan skala

fermentasi (misalnya hasil antibiotic dengan bilangan reynold).

Faktor momentum Impeller dapat juga berfungsi sebagai sebuah pompa,
maka penggandaan skala dapat didasarkan pada laju pemompaan, atau

transfer momentum impeller

Efek Pengadukan Pengadukan mekanis di bawah kecepatan ND tertentu
ternyata mempunyai pengaruh yang kecil terhadap nilai ka di bawah nilai
kritis ka terutama ditentukan oleh efek aerasi, gelembung udara.

DAFTAR PUSTAKA
Buckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J.
Stuttard. 1989. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance.
4ed.. AIFST (NSW Branch), Australia.
Cappuccino, J. G. dan Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual.
Addison-Wesley Publishing Company. New York.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Umum, Jakarta.
Jarvis, B. 1978. Methods for Detecting Fungiin Foods and Beverages. In Food
and Beverage Mycology. Ed. Beuchat. L.R. pp. 471-504. CT: AVI Publ. Inc.
Wetsport.
Lim,D. 1998. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New york.
Pelczar, Jr. et al. 1986. DasarDasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas
Indonesia, Jakarta.

Realita, dan D. Sumanti. 2008. Teknologi Fermentasi. Penerbit : Widya

Padjajaran. Bandung

Winarno, F. G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Penerbit PT Gramedia

Pustaka Utama.