BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

2.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan
rancangan penelitian analisis statistik one way ANOVA yang dilanjutkan dengan
LSD test untuk mengetahui adanya kebermaknaan dalam perbedaan hasil diameter
zona hambat tiap konsentrasi uji dengan kontrol negatif serta analisis eksploratif
deskriptif untuk menentukan KHM dan KBM. Penelitian dilakukan di Laboratorium
Mikrobiologi, Laboratorium Farmakognosi,Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Bakti
Tunas Husada Tasikmalaya.
2.2 Variabel dan Definisi Operasional
2.2.1 Variabel penelitian
a. Variabel bebas: berbagai kadar ekstrak kulit batang kayu manis 100; 50; 25; 20;
15; 10; 5; 3,5 dan 2,5%
b. Variabel tergantung: diameter zona hambat pertumbuhan S. mutans (cm), nilai
c.

KHM dan KBM (%).

Variabel pengacau terkendali, yaitu: media penanaman bakteri, suhu inkubasi (37
C) dan lama inkubasi (24 jam), diameter sumuran (6 mm), kepadatan suspensi
bakteri uji setara dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml), paparan
sinar pada saat proses destilasi, penyimpanan dengan memberikan alumunium foil
pada alat destilasi dan tempat minyak atsiri, dan asal simplisia ektrak bunga

melati.
d. Variabel pengacau tak terkendali: umur tanaman dan lingkungan tempat tumbuh
tumbuhan melati.
2.2.2 Definisi operasional

a. Melati merupakan tanaman hias yang menjadi lambang pesona bunga

Indonesia, berbunga putih mungil dengan aroma khas yang memberi kesan
romantis. Mahkota bunga bervariasi dari tunggal hingga yang bersusun seperti
bunga mawar kecil. diperoleh dari pasar Beringharjo Yogyakarta yang
diidentifikasi
b.

keasliannya secara makroskopik dan mikroskopik mengacu

pada Materia Medika Indonesia Jilid I (Departemen Kesehatan RI,1977).

Destilasi uap dan air adalah proses penyulingan untuk mendapatkan minyak
atsiri. Simplisia yang digunakan ditempatkan di atas penampang berlubang

dan tidak kontak dengan air yang berada di bawahnya.

c. Minyak atsiri adalah minyak yang dihasilkan dari proses destilasi uap dan air
yang berasal kulit batang kayu manis (C. burmanni Bl.) sesuai dengan
prosedur yang dilakukan dalam penelitian.
d. Streptococcus mutans merupakan biakan murni yang diperoleh dari
e.

Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta

Daya antibakteri adalah kekuatan minyak atsiri dalam menghambat dan
membunuh S.mutans yang memiliki perbedaan bermakna dibandingkan

dengan kontrol negatif.

f. Kontrol positif dalam penelitian ini adalah minyak atsiri 100% yang
digunakan sebagai pengontrol metode dan pembanding.
g. Zona hambat adalah zona jernih yang tidak tampak adanya pertumbuhan
koloni S.mutans.
h. Metode difusi dengan sumuran adalah metode yang digunakan untuk
mengukur daya hambat minyak atsiri terhadap S.mutans dengan cara
mengukur zona jernih (zona hambat) pada sekitar sumuran.
i. Metode dilusi padat adalah metode pengukuran aktivitas antibakteri dengan
cara mengencerkan minyak atsiri ekstrak bunga melati pada beberapa
konsentrasi, kemudian dicampurkan pada media padat untuk melihat daya
hambat minyak atsiri serta menentukan KHM dan KBM.
j. KHM adalah Konsentrasi minimum minyak atsiri ekstrak bunga melati untuk
menghambat pertumbuhan S. mutans.

k.

KBM adalah konsentrasi minimum minyak atsiri ekstrak bunga melati yang
dapat membunuh S. mutans.

l.
2.3 Bahan Penelitian
Ekstrak bunga melati (jasminum sambac ait.) diperoleh dari Pasar
Beringharjo, Yogyakarta, aquadest, vanillin asam sulfat, toluene, etil asetat, heksana,
larutan standar Mc Farland II, cinnamomi oil (teknis), standard cinnamaldehyde,
bakteri S. mutans diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan,Yogyakarta, Trypton
Soya Agar (TSA), Trypton Soya Broth (TSB), etanol absolut 99,9%.

2.4 Alat Penelitian

Microbiological Safety Cabinet, oven (Memmert), piknometer (Pyrex, Iwaki
Glass), hand refractometer (Atago) autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd.
Midorigouka Kamurashi, Tokyo, Japan), inkubator (Heraeus), pH meter, sentrifuge
(Heraeus Christ), vortex, oven, alat-alat gelas, ose, neraca analitik, mikropipet,
pelubang sumuran, seperangkat alat KLT dan seperangkat alat destilasi.

2.5 Tata Cara Penelitian

2.5.1 Pengumpulan bahan ekstrak bunga melati.
Ekstrak bunga melati diperoleh dari Pasar Beringharjo Yogyakarta. Kriteria bunga
yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga yang masih segar dan berwarna
putih segar. Bunga melati ini dicuci dan dipotong dalam ukuran kecil sekitar 2-3
cm.
2.5.2

Karakterisasi simplisia bunga melati.

Identifikasi simplisia ekstrak bunga melati dilakukan secara makroskopik dan

mikroskopik di Laboratorum Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi STIKes

BTH Tasikmalaya dengan mengacu pada Materi Medika Indonesia jilid I

(Departemen Kesehatan RI,1977) untuk memastikan bahwa simplisia yang
digunakan benar-benar bunga melati (jasminum sambac ait.). Identifikasi simplisia
bunga melati secara makroskopik dilakukan untuk melihat morfologi, ukuran dan
simplisia yang diteliti secara visual tanpa bantuan mikroskop, sedangkan
identifikasi secara mikroskopik dilakukan untuk melihat fragmen khas pada minyak
atsiri bunga melati dengan bantuan mikroskop. Pada Materia Medika Indonesia
Jilid I disebutkan fragmen pengenal bunga melati meliputi: sel minyak, serabut
sklerenkim, hablur oksalat dan periderm (Departemen Kesehatan RI,1997).
2.5.3 Destilasi minyak atsiri bunga melati dengan cara destilasi uap dan air
Destilasi uap dan air dilakukan dengan cara menimbang bunga melati
sebanyak 4 kg kemudian didestilasi menggunakan air sebanyak 250 mL selama 4 6 jam. Berdasarkan orientasi yang telah dilakukan, waktu 4 6 jam optimal untuk
dapat mengisolasi minyak atsiri dari bunga melati. Simplisia diletakkan di atas
bagian tatagan berlubang-lubang sedangkan air berada di bagian bawah. Kemudian
uap air dialirkan melalui pendingin. Setelah itu, hasil destilasi ditampung. Destilat
yang dihasilkan berupa minyak atsiri dan air. Pada destilasi ini, minyak dan air akan
terpisah dalam dua lapisan. Setelah itu bagian atas yang berupa minyak atsiri
diambil dan disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
2.5.4 Karakterisasi minyak atsiri bunga melati.
a. Pemeriksaan organoleptik
Pemeriksaan dilakukan terhadap warna, kejernihan, dan bau minyak
atsiri hasil destilasi uap dan air. Minyak atsiri bunga melati memiliki bau
aromatik dan memiliki warna kuning jernih (Guenther, 2006)
b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak atsiri
Piknometer dicuci dan dibersihkan dengan hati-hati. Kemudian dibilas
berturut-turut dengan etanol dan dietileter. Bagian dalam dikeringkan
dengan arus udara kering. Bagian luar diseka dengan kain kering dan
disisipkan tutupnya. Piknometer dibiarkan berdiri di dalam lemari

timbangan selama 30 menit kemudian ditimbang. Piknometer diisi dengan

air suling suhu 25o C yang baru saja

dididihkan. Gelembung udara

dihindari. Piknometer dicelupkan dalam penangas air pada suhu 25oC 0,2
oC selama 30 menit. Suhu penangas air diperiksa dengan termometer dan
air suling ditambahkan sampai garis tanda. Penutup disisipkan dan
dikeringkan dengan menggunakan kain kering.

Pikno dibiarkan berdiri

dalam lemari timbangan selama 30 menit dan ditimbang dengan beserta

isinya. Piknometer dikosongkan dan dicuci

dengan etanol, kemudian

dibilas dengan dietileter dan dikeringkan dengan

arus udara kering.

Piknometer diisi dengan minyak atsiri bersuhu 25o C pada suhu 25o C
0,2oC dan dibiarkan selama 30 menit. Piknometer dicelupkan dalam
penangas air pada suhu 25oC 0,2oC dan dibiarkan berdiri di timbangan
selama 30 menit. Permukaan minyak diatur hingga garis tanda (Departemen
c.

Kesehatan RI,1985).
Pengukuran nilai indeks bias
Penentuan indeks bias

dilakukan

menggunakan

alat

hand

refractometer. Cara kerjanya adalah penutup prisma dibuka dan tuang

sampel sebanyak 1 sampai 2 tetes pada prisma, lalu tutup penutup prisma
dengan lembut sampai menyentuh prisma utama. Skala di atur 1,2,dan 3
dengan memutar knop sampai tanda . Jarak jangkauan dari skala tersebut
adalah:
1 :1,333-1,404 (skala sebelah kiri)
2 : 1,404-1,468 (skala tengah)
3 : 1,468-1,520 (skala sebelah kanan)
Kemudian ujung refraktometer diarahkan ke cahaya terang dan dilihat
melalui lensa sambil memutar skala sampai terlihat garis batas gelap dan
terang dengan jelas. Akan tampak garis batas yang memisahkan sisi terang
pada bagian atas dan bawah. Jika garis batas berwarna sehingga tidak jelas,

ring diputar untuk menghilangkan warna hingga garis batas menjadi jelas
(jika indeks bias sampel sama sekali tidak dapat diamati,knop diatur pada
posisi 1,2,dan 3 dan cari pisisi yang menunjukan perbedaan yang jelas antar
bagian yang terang dan gelap). Kalibrasi yang ditunjukan oleh garis batas
tersebut memperlihatkan indeks bias (Departemen Kesehatan RI,1985).
2.5.5 Identifikasi kualitatif minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan
metode KLT
Fase diam yang digunakan adalah silica gel GF254 dan fase gerak
yang digunakan adalah toluene : ethyl asetat (93 : 7). Sebagai pembanding
digunakan

cinnamomum

oil

(teknis)

dan

cinnamaldehyde.

Deteksi

menggunakan sinar UV 254 dan 365 nm serta pereaksi semprot vanillin asam
sulfat. Pertama, sebanyak 50 l sampel diambil kemudian dilarutkan dengan 1
ml etanol. Sebanyak 5 l larutan minyak atsiri hasil destilasi uap dan air
ditotolkan pada plate silica gel 60 GF254. Dilakukan juga penotolan
pembanding cinnamaldehyde pada plat yang sama. Kemudian plate
dimasukkan ke dalam chamber jenuh dengan fase gerak toluene : etil asetat
(93 : 7) dan dieluasikan hingga batas, lalu diangkat dan dikeringkan. Setelah
kering disemprot dengan pereaksi vanillin asam sulfat dan dipanaskan pada
suhu 110 C selama 2 menit, kemudian hitung nilai Rf dan amati warna bercak
yang tampak.
2.5.6 Sterilisasi peralatan dan media
Peralatan yang digunakan dalam penelitian, terutama yang berhubungan
dengan bakteri uji seperti: tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, pipet ukur,
dan lain-lain disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC
selama 20 menit dengan tekanan 1 atm, sedangkan untuk media TSA dan TSB
disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit.
2.5.7 Penyiapan media uji

Pada penelitian ini media yang digunakan ada 2 macam yaitu Trypton
Soya Agar (TSA) dan Trypton Soya Broth (TSB). Pembuatan media TSA yaitu
dengan mencampurkan serbuk TSA sebanyak 10 gram dengan aquadest
sebanyak 250 ml. Pembuatan media TSB yaitu dengan mencampurkan serbuk
TSB sebanyak 7,5 gram dengan aquadest sebanyak 250 ml, lalu ke dua jenis
media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C dan tekanan 1 atm selama
15 menit. Untuk penyiapan media stok mikroba uji, setelah media TSA
disterilkan, media TSA dibiarkan memadat dalam kondisi miring untuk
reisolasi bakteri S.mutans.
2.6 Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan metode difusi
sumuran.
a. Penyiapan larutan uji
Dari hasil destilasi dibuat berbagai variasi pengenceran dengan cara
melarutkan destilat murni dengan etanol 99,9%. Dibuat beberapa variasi konsentrasi
destilat minyak atsiri, meliputi konsentrasi 100 % (sebagai kontrol positif), 50, 25,
dan 20%, kemudian diturunkan menjadi 10%,5% dan 2,5% dengan cara melarutkan
minyak atsiri ke dalam etanol 99,9% hingga mencapai konsentrasi yang diinginkan.
b. Pembuatan suspensi bakteri
Diambil 1-3 ose isolat murni bakteri S.mutans yang sudah dibiakkan,
diinokulasikan ke dalam 5 ml TSB dan divortex supaya tercampur merata, kemudian
diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Dibuat suspensi bakteri uji dan disetarakan
dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml) dengan cara menyetarakan
kekeruhan suspensi bakteri dengan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml), jika
kekeruhannya melebihi kekeruhan Mc Farland II, maka dilakukan penambahan media
TSB steril sampai didapat kekeruhan yang sama.
c. Penanaman isolat S.mutans secara pour plate.
Media yang akan digunakan dibagi menjadi 2 dengan perbandingan volume
1:3. Satu bagian berupa TSA steril tanpa inokulasi bakteri digunakan sebagai layer
bawah, dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat terlebih dahulu.

Tiga bagian digunakan sebagai layer atas, yang dituang setelah diinokulasi dengan
bakteri uji. Untuk layer atas, diambil 0,1 mL dari stok suspensi bakteri uji yang sudah
disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II, diinokulasikan ke media TSA
secara pour plate. Media TSA yang mengandung bakteri dibiarkan beberapa saat
supaya memadat.
d. Uji daya antibakteri minyak atsiri kulit batang kayu manis terhadap S.mutans dengan
difusi sumuran.
Dengan menggunakan pelubang sumuran, dibuat lubang-lubang pada media
TSA yang telah memadat dengan diameter 6 mm, sebagai tempat
minyak atsiri dengan berbagai variasi konsentrasi, kontrol negatif (etanol
99,9%) dan kontrol positif (minyak atsiri 100%). Pembuatan lubang hanya menembus
layer atas, layer bawah digunakan sebagai alas supaya destilat tidak menyebar pada
dasar cawan petri. Minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi (20 50%)
diinokulasikan pada lubang sumuran yang tersedia. dan kontrol negatif yang
digunakan adalah etanol 99,9% dan kontrol positif adalah minyak atsiri 100%.
Volume yang diinokulasikan adalah 30 l. Diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37o
C, kemudian diamati diameter zona jernih yang dihasilkan. Konsentrasi kemudian
diturunkan terus menerus hingga ditemukan konsentrasi di mana minyak atsiri kulit
batang kayu manis sudah tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. mutans
sebagai acuan konsentrasi pada KHM dan KBM. Daya antibakteri diamati
berdasarkan diameter zona hambat yang terbentuk dibandingkan dengan kontrol
negatif etanol 99,9%.
2.7 Penentuan nilai KHM dan KBM dengan dilusi padat
Pada uji ini menggunakan tiga macam kontrol, yaitu kontrol kontaminasi
media, kontrol pertumbuhan bakteri, dan kontrol negatif (kontrol pelarut). Kontrol
kontaminasi media dibuat dengan menuang media TSA pada cawan petri steril.
Kontrol pertumbuhan bakteri dibuat dengan menambahkan bakteri uji pada media

TSA kemudian dilakukan pour plate pada cawan petri steril. Kontrol pelarut dibuat
dengan menambahkan pelarut ekstrak, yaitu etanol pada media TSA kemudian
dilakukan pour plate pada cawan petri steril.
a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Diambil 1-3 ose bakteri uji, kemudian disuspensikan ke dalam 5 ml TSB,
divortex sampai rata dan diinkubasikan pada suhu 37C selama 24 jam. Hasil
suspensi dibandingkan dengan standar Mc Farland II hingga kekeruhannya sama,
lalu diambil suspensi bakteri 0,1 ml. Destilat dengan kadar tertentu, sesuai
dengan hasil pada uji sebelumnya, ditambahkan dalam suspensi tadi dan
dicampur rata dengan 10 ml TSA yang dicairkan (suhu 45-50C), kemudian
dituang dalam cawan petri secara pour plate. Diinkubasikan dalam suhu 37C,
dilakukan pengamatan setelah 24 jam diinkubasi. Pertumbuhan bakteri dapat
dilihat dari media yang menjadi keruh. Semakin subur pertumbuhan bakteri pada
media, maka semakin keruh media tersebut. Pembacaan hasil daya antibakteri
diberi penilaian menggunakan notasi (+++) untuk pertumbuhan yang tampak
sangat keruh, (++) keruh, (+) agak keruh dan (-) jernih. Kekeruhan masingmasing perlakuan dibandingkan

dengan kontrol sterilitas dan kontrol

pertumbuhan.
b. Penentuan nilai KHM dan KBM
Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan melakukan streak plate
dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah
semua media yang memberikan kejernihan media secara visual. KHM adalah
konsentrasi terkecil yang dapat menghambat bakteri, ditandai dengan S.mutans
masih dapat tumbuh pada hasil streak plate, sedangkan KBM adalah konsentrasi
terkecil yang dapat membunuh bakteri, ditandai dengan S.mutans sudah tidak
dapat tumbuh pada hasil streak plate yang menandakan bakteri uji mati karena

larutan uji dengan konsentrasi tersebut (McKane & Kandel, 1996; Koneman,
Allen & Schreckenbergerr, 1997).
2.8 Analisis Data
Data diameter zona hambat pada pertumbuhan bakteri diuji distribusi
normalnya dengan Kolmogorov-Smirnov, jika normal maka dianalisis kebermaknaan
beda tiap hasil dengan ANOVA satu arah pada taraf kepercayaan 95% dengan H1
yaitu terdapat perbedaan bermakna antar sampel, kemudian dilanjutkan dengan uji
LSD (Least Significant Different). Jika data terdistribusi tidak normal maka data
dianalisis menggunakan uji Kruskal Wallis yang kemudian dilanjutkan dengan uji
Mann Whitney.
Data uji antibakteri dengan dilusi padat didapat dengan melihat kekeruhan
media secara visual dan dianalisis secara dengan deskriptif. Nilai KHM dan KBM
didapat dari hasil penegasan dengan metode streak plate. Data hasil identifikasi bunga
melati berupa bobot jenis minyak atsiri, indeks bias minyak atsiri, KLT minyak atsiri
dianalisis secara deskriptif dengan disertai data pendukung berupa foto-foto dan
disajikan dalam bentuk tabel.