Analisis Keragaman DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu reaksi in vitro untuk menggandakan molekul DNA

pada target tertentu dengan cara mensintesa molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA tersebut dengan enzim polymerase dan oligonukleotida pendek sebagai primer dalam mesin Thermal Cycler. Teknik ini berjalan secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Proses yang terjadi dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu denaturasi (pemisahan untai ganda DNA),annealing (penempelan primer) dan ekstensi (pemanjangan primer). Proses dari mulai denaturasi, penempelan hingga pemanjangan disebut sebagai satu siklus. Produk PCR dapat langsung divisualisasikan melalui proses elektroforesis dan dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Muladno, 2002). Keragaman DNA amplikon atau produk PCR dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain RFLP, SSCP, TGGE dan sequencing.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR-RFLP merupakan teknik analsis lanjutan dari produk PCR. Teknik PCR memanfaatkan perbedaan pola pemotongan enzim restriksi atau enzim pemotong yang berbeda pada tiap-tiap mikroorganisme. Analisis RFLP sering digunakan untuk mendeteksi lokasi genetik dalam kromosom yang menyandikan penyakit yang diturunkan (Orita et al., 1989) ataupun untuk mendeteksi adanya keragaman gen yang berhubungan dengan sifat ekonomis, seperti produksi dan pertumbuhan.

Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperbanyak segmen DNA secara in vitro (Ausubel, 1995). Segmen DNA tersebut kemudian dapat diketahui runutan nukleotidanya, salah satunya yaitu dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi dapat memotong DNA secara spesifik dan terbatas pada situs yang dikenalinya (Lewin, 1994). Perbedaan pola pemotongan DNA dari jenis gen yang sama antara beberapa ternak disebut Restriction Fragment

Length Polymorphism (RFLP). Pada prinsipnya, RFLP merupakan semua mutasi yang menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (inersi), penghilangan (delesi), maupun subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola pemotogan DNA (Lewin, 1994).

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) merupakan salah satu metode analisis lebih lanjut yang memanfaatkan produk PCR. Metode ini didasarkan pada asumsi bahwa perubahan yang terjadi pada fragmen DNA akan mempengaruhi bentuk dari fragmen DNA untai tunggalnya yang terlihat dari perubahan pola migrasi pada gel poliakrilamidanon-denaturasi. Metode SSCP dapat mendeteksi adanya mutasi pada fragmen DNA, akan tetapi tidak dapat memberikan informasi tentang posisi dimana terjadinya mutasi pada fragmen DNA, dan memiliki keterbatasan dalam menentukan jumlah alel (Barroso et al., 1999).

Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) dan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Polymerase Chain Reaction-Temperature Gradient Gel Electrophoresis (PCR-TGGE) adalah suatu metode analisis keragaman yang mendeteksi adanya mutasi menggunakan gel yang memiliki perbedaan suhu (Jasik dan Reichert, 2006). Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) merupakan salah satu metode yang dapat membedakan adanya mutasi berdasarkan berat molekul fragmen DNA pada gel yang memiliki perbedaan konsentrasi bahan untuk menyamakan berat molekul (denaturing) (Liu et al., 2008). Sequencing Sequencing merupakan satu terobosan utama dalam genetika molekuler untuk menganalisis keragaman molekul DNA.Sequencing merupakan proses penentuan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA atau RNA. Sequencing menghasilkan penggambar linear simbolik yang disebut sekuen yang meringkas sebagian besar struktur tingkat atom atas molekul yang disekuensing. Sequencing DNA akan menghasilkan sekuen DNA yang digambarkan sebagai untaian abjad lambang nukleotida-nukleotida penyusun DNA (Muladno, 2002). Tipe polimorfisme yang dideteksi yaitu pertukaran satu basa dan menghasilkan informasi sekuen yang dibutuhkan. Proses Sequencing dapat dilakukan dengan secara cepat dan hasil yang diperoleh tinggi (akurat), akan tetapi biaya yang dibutuhkan cukup besar (Gupta et al., 2002).

Sumber: Barroso, A., S. Dunner, dan J. Canon. 199. Technical note: use PCR-single strand conformation polymorphism analysis for detection of Bovine -casein variants A1, A2, A3, and B.J. Anim. Sci. 77:2629-2632. Gupta, P.K., R.K. Varshney dan M. Prasad. 2002. Molecular Markers: Principles and Methodology. Dalam: Jain, S.M., D.S. Brar, dan B.S. Ahloowalia (Eds.). Molecular Techniques in Crop Inprovement. P.9-54. Liu, G., T. Amemiya, dan K. Itoh. 2008. Two-dimensional DNA gel electrophoresis mapping: a novel approach to diversity analysis of bacterial communities in environmental soil. J. of Bioscience and Bioengineering, 105:127-133. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor. Orita, M., H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi, dan T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as a single-strand conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2766-2770.