TUGAS

MATA KULIAH KULTUR

JARINGAN Kultur Teknik Fusi Protoplas

Oleh : Dewi Ma'rufah H0106006

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2008

KULTUR FUSI PROTOPLAST Pendahuluan Salah satu cara untuk mengatasi masalah dalam pengembangan tanaman unggul adalah dengan merakit varietas baru yang berproduksi tinggi dan tahan terhadap hama, penyakit serta cekaman abiotik. Beberapa cara yang dapat diterapkan untuk mendapatkan varietas baru antara lain melakukan persilangan dengan spesies tertentu, melakukan mutasi buatan, penerapan metode transformasi atau melakukan fusi protoplas (Sukmadjaja, 2007) Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun 1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah dikupas bagian diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Protoplas dapat dimanfaatkan untuk mendukung penelitian dasar biologi tanaman dan merupakan sarana penting di bidang rekayasa genetik, misalnya untuk hibridisasi somatik untuk meningkatkan kualitas tanaman (Anonim, 2007) Fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter-genus). Penggunaan fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibrida-hibrida dengan tingkat heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat ditentukan oleh genotipenya (Mollers et al. 1992). Teknologi fusi protoplas juga dapat dilakukan untuk mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan penyakit serta cekaman abiotik (Purwito 1999). Dengan demikian, tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman dengan sifatsifat gabungan dari kedua tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak diharapkan terutama berasal dari spesies liar. Oleh karena itu, untuk menghilangkan sifat-sifat yang tidak diinginkan tersebut maka perlu dilakukan silang balik (back cross) dengan tetua budi daya. Kemajuan pesat dalam penelitian produksi hibrida somatik dan sibrida dalam transfer DNA tidak terlepas dari teknik isolasi, kultur dan regenerasi protoplas menjadi tanaman. Untuk menunjang keberhasilan teknik

kultur dibutuhkan keahlian dan pengetahuan tentang teknik kultur protoplasma guna mendukung teknik pencarian varietas baru berbagai jenis tanaman. Isi Prosedur Kultur Protoplasma Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa mutagen ke dalam media tanam atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut. Silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur protoplasma secaraa umum adalah sebagai berikut: 1. Persiapan eksplan. Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam, umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder. 2. Sterilsasi eksplan. Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 -2 % selama 10 - 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3 - 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan. 3. Isolasi Protoplasma. Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun 1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah

dikupas bagian diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara: Metode mekanikal. Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Metode ini telah berhasil mengisolasi protoplasma dari daun Saintpaulia ionantha dan dikulturkan hingga tumbuh kalus. Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2) Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas protoplasma rendah, karena seng terjadi kerusakan protoplasma selama proses pengupasan dinding sel. Metode enzimatik Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat mengahancurkan dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya. Berikut dikemukanan perbandingan antara dinding sel primer dan sekunder pada sel tumbuhan. Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose, Pectinase untuk menghancurkan pektin. Sedangkan alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma adalah sebagai berikut : Laminar air flow cabinet Centrifuge Inverted microscope Gyratory shaker Magnetic stirrer + hot plate

pH meter Saringan stainless stell (lubang 60 - 70 urn) Bacterial filter Nalgene filter unit 0,22 urn Millex filter unit 0,45 um Spet dan jarum Piset dg ujung runcing + pisau kultur Pipet 5 ml berujung lebar Pipet pastur 2 ml Petri dish Gelas beker Parafilm/plastic wrapp Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai berikut: Eksplan Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti: daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena: Bentuk selnya relatif seragam, tidak perlu membunuh tanamannya, dinding sel mudah terkelupas oleh enzim. Ethanol 70 % Larutan isolasi protoplasma Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma a. Jaringan tanaman seperti disterilkan terlebih dahulu dengan cara merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detikm selanjutnya di rendam kedalam larutan pemutih (misalnya bayklin) 20% yang ditambah beberapa tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali.

b. Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih memudahkan isolasi protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti: 4. Medium enzim untuk jaringan Akar 2 % rhozyme 2 % meicellase 0,03 % macerozyme R10 5. Medium enzim untuk daun Serealia 2 % cellulysin 0,2 % macerozyme R10 0,5 % hemicellullase 11 % mannitol 0,5 % Onozuka R10 cellulase 0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10 13,0 Mannitol pH 5,8 Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditamhkan senyawa osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain: Mannitol, Sorbitol, Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol. Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut: CaCl2.H2O KH2PO4 1480,0 mg/l 27,2 mgl

6. Medium enzim untuk Daun Tembakau:

101,0 mg/l 246,0 mg/l 0,025 mg/l 0,16 mg/l 5,8 Eks plan dipindah larutam medium enzim (komposis i ini beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan ) daun tembakau komponen nya dapat dilihat di atas. untuk media juga

berbeda-

Eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 lalu tabung ditutup dengan aluminiu m foil steril dan diisolasi mengguna kan parafilm atau plastik wrap. Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan ml,

kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16 jam. nian protopl asma Pr ot op las ma dal am po in 5 dis ari ng de ng an g filt er ste ril, 4. Pemur

me ss 63 u m, ma su kk an ke dal am gel as pia la vo lu me 25 0 ml me ng gu na ka n pi pet pa

stu er. M edi u m pe nc uci (M IP dit am ba h + 10 %) se ba ny ak 3 ml dit am ba hk an ke dal

am ca wa n pet ri ya ng be ris i de bri s da ri da un, di go ya ng pe rla ha n da n ko m bi

na sik an de ng an pr ot op las / ca m pu ra n en zi m dal am gel as pia la vo l. 25 0 ml .

Pr ot op las ya ng di pe rol eh dic uci de ng an me di u m pe nc uci da n sar in g. Pr ot op las

ya ng ma sih ter ca m pu r de ng an lar uta n en zi m dis ent rif ug e de ng an ke ce pat an 50

xg sel am a 10 me nit . Pe let dir es us pe nsi dal am me di u m pe ng ap un g (m edi u m flo

tas i) 10 ml dit am ba h me di u m pe nc uci 1 ml sel anj ut ny a dis ent rif ug e, pr ot op las

ma ak an me lay an glay an g dia nta ra me di u m flo tas i (M IP + 20 %) da n me di u m

pe nc uci . Pr ot op las ma ya ng me lay an glay an g di pi nd ah ka n ke dal am tab un g dit

am ba h 10 ml me di u m pe nc uci , sel anj ut ny a dis ent rif ug e ma ka pr ot op las ma ak

an me ng en da p se ba gai pel et.

 Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar lagi. Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml. Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya 50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril.

Gambar protoplas padi setelah proses pemurnian dilakukan 7. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma. Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer: jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Protoplasma yang mati berwarna merah dan yang viable tercat hijau. 8. Kultur protoplasma Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi protoplas viable 100 - 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah disediakan dan dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28 oC selama semalam. Kultur protoplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 -20 umol.detik-1m-2) dengan cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode 16 jam, selama 2 hari. Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih tinggi (50 - 75 umol.detik-1m-2). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media cair yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat media

padat (dengan pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya, karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk: menghindari plasmolisis. Salah satu contoh media kultur protoplasma tembakau. Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan petri steril (5 - 10 tetes per petri). Cawan petri ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu 25C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut. Teknik Kultur Protoplasma Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam medium agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke media agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya agarose.

Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena mudah larut dan diserap, beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah dalam media agar, tekanan osmotik media direduksi secara efektif, kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan, kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal yang berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode 9. Metode liquid tetes Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 ul, suspensi protoplasma dalam media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes. Cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang telah mengalami pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesantetesan suspensi menyatu menjadi satu tetesan di pusat. 10. Metode tetes menggantung Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 ul, suspensi protoplasma diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri, ditutupdengan menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan petri tersebut.

H FjriJr. i. rr; = . ' F F

rj-i

rwn;: n-:-n

l-mlirLwlF. rJ- H in I F V.5O0 LT IhtG HlHO L.flKJ

Irfiml

"" " "i ns Ki)

zaJbir

. w-

ilpjih' I 1_ r*i

~ U K A | M I

'ill

t f f l w N i f l i r r -

Vn- kukriirvd :r#irMiy trrrtiyi

Diagram prosedur fusi protoplas dari mesofil daun tembakau dan daun plantlet kentang; A. Plantula kentang; B. Daun dari A dipotong-potong; C. Potongan daun C diinkubasikan dalam medium plasmolisis selama 1-8 jam selanjutnya diinkubasikan dalam medium enzym selama 4-16 jam; D1. Protoplasma dalam C disaring dengang filter steril, mess 63 mikron ; D2. Suspensi protoplasma disentrifuge; E. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (flotation) 10 ml ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan melayang-layang diantara medium flotasi dan medium pencuci; F. Protoplasma diresuspensi lagi dengan medium CPW 13 M dengan kerapatan 1x 106 per mililiter; G. 1. Protoplasma diteteskan pada tengah-tengah cawan petri steril ditambahkan dengan satu tetes minyak mineral; 2. Tetesan tersebut ditutup menggunakan gelas penutup steril; 3. Tambahkan 3 tetes dari setiap macam suspensi protoplasma; H. Protoplas difusikan secara bertahap menggunakan medium fusagen PEG 22,5 dengan cara meneteskannya sebanyak 6 tetes; I. Protoplasma dicuci dengan medium pencuci Ca+ . Medium pencuci dicampur dengan medium kultur; J. Protoplasma diinkubasikan di bawah sinar pada suhu 25o C; K. setelah 2-3 minggu koloni multiseluler diembeding dengan agarose; L. Koloni seluler pada K ditanam pada medium MS basal (sumber: Trigiano & Gray, 2000).

Proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan 1. Fusi protoplas Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan. a. Metode peleburan spontan Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus. Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman.

Gambar protoplast yang berhasil membentuk fusi b. Metode pemacuan peleburan Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda jenis tanamannya. Larutan fusagen contohnya: Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35o C selama 5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet disimpan dalam water bath bersuhu 35o C selama 30 menit. Pada beberapa saat protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat ditiangkan secara hati-hati pada medium kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3.

Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun. Perlakuan ion calsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya tabung sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit hingga protoplasma melebur. Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma. Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi,

sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion binukleat rendah. 11. Pembentukan Dinding Sel Perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau

terbentuknya dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis atau embryogenesis. 12. Regenerasi Protoplasma Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah

satu teknik yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain (sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik "Nurse Culture". Untuk kultur satu protoplasma, "nurse cells" diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Muir dkk. Tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi, disebut "protoclonal variation". Apabila dalam penanaman protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi akan berupa generasi baru. Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 uM BAP). Setelah tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat diakarkan. Salah satu contoh media pengakatran protoplasma adalah 1/2 MS + 3-aminopyridine (untuk tembakau) atau picloran (untuk tebu). Plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian ditanam di lapangan. Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di dalam sel kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya, protoplasma diletakkan diantara barisan elektrodeelektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma. Dalam metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan AC dari intensitas rendah untuk suspensi protoplasma. Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm efek sebuah elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur barisan elektrode. Tahap kedua injeksi aliran listrik DC dengan intensitas tinggi (750-1000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 udetik menyebabkan membran

protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang selanjutnya membran akan mengalami reorganisasi. Teknik fusielektro sangat sederhana, cepat dan efisien. Sel-sel yang telah di fusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon yang sitotoxit. Namun metode ini jarang digunakan.

Gambar protoplas yang sudah beregenerasi Penutup Kultur protoplasma atau bisa juga disebut kultur fusi protoplasma mempunyai tujuan akhir penyatuan dua jenis sel tanaman dari spesies maupun genus yang berbeda sehingga terbentuklah individu tanaman yang baru yang juga mempunyai ekspresi sifat yang baru. Dari dasar inilah terlihat adanya peluang untuk mendapatkan jenis-jenis / varietas-varietas yang unggul. Kultur protoplas ini harus dilakukan dengan teliti memenuhi prosedur yang berlaku. Urutan prosedur pada kultur protoplas ini adalah Persiapan eksplan, sterilsasi eksplan. isolasi protoplasma, pemurnian protoplasma, perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma, kultur protoplasma. Sedangkan proses yang terjadi pada saat protoplasma tersebut dikulturkan antara lain fusi protoplast (penggabungan dua protoplast) dilanjutkan dengan pembentukan dinding sel dan regenerasi sel sehingga dapat membentuk individu baru.

DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2007. Kultur Protoplasma Dan Fusi Protoplasma. http://www.elearning.unram.ac.id. Diakses tanggal 28 Oktober 2008. Hapsari, C. 2003. Pengaruh Jenis Gula Medium Terhadap Perkembangan Awal Protoplas Kacang Hijau (Vigna radiata (l.) Wilczek) Dengan Perlakuan Awal Preplasmolisis. http://www.digilib.bi.itb.ac.id. Diakses tanggal 28 Oktober 2008. Sukmadjaja, D., Novianti S., Endang G., Ika R., Tintin S. 2007. Teknik Isolasi dan Kultur Protoplas Tanaman Padi http://biogen.litbang-deptan.go.id Diakses tanggal 28 Oktober 2008. Purwito, A. 1999. Fusi Protoplas Intra Dan Interspesies Pada Tanaman Kentang. Disertasi Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor