METODE INDIKASI STABILITAS REVERSE PHASE-HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (RP-HPLC) UNTUK

ESTIMASI BAHAN BAKU SALMETEROL XINAFOATE DALAM
FORMULASI FARMASETIK

diajukan untuk memenuhi tugas Validasi Metode Analisis

Oleh:

WILDHAN ALVIAN HAKIM

NURDIAWAN
DWIRAINITA RAMADHANIA

(3311141136/ D)
(3311141137/ D)
(3311141138/ D)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI
2016

1. Abstrak
Metode RP-HPLC yang lebih sederhana, presisi, akurat, dan selektif sedang
dikmbangkan dan divalidasi untuk estimasi salmeterol xinafoate di dalam
formulasi farmastik.Metode tersebut dilakukan dalam kolom Qualisil RP C-18
dengan fase gerak buffer fosfat : asetonitril : methanol (45:25:30), pH diatur
pada posisi 6 dengan diamonium hydrogen orthofosfat, dan laju alir 0.5 mL
per menit. Deteksi dilakukan pada panjang gelombang 250 nm. Waktu retensi
salmeterol xinafoate ditunjukkan pada 7.41 menit. Salmeterol xinafoate diikuti
linearitas dari rentang konsentrasi 1-6 mikrogram per milliliter (r 2 = 0.9984).
Jumlah dari obat yang diestimasi dengan metode ini sesuai dengan yang
tercantum di label obat. Metode ini divalidasi agar menunjukkan sensitivitas,
akurasi, presisi, ketegasan, dan ketahanan yang baik. LOD dan LOQ dari
percobaan ini adalah 0.10 dan 0.29 g. Salmeterol xinafoate disubjektifikasi
dengan hidrolisis asam dan basa, oksidasi, dan degradasi termal. Salmeterol
xinafoate mengalami degradasi dengan kondisi hidrolisis asam dan basa,
oksidasi, dan degradasi termal. Kondisi tersebut menunjukkan bahwa
Salmeterol xinafoate rentan terhadap asam, basa, oksidasi, dan kondisi termal.
Metode ini bisa digunakan untuk analisis rutin bahan baku salmeterol
xinafoate dan formulasi farmasetik.
2. Pendahuluan
Salmeterol
xinafoate
atau
asam
4-Hydroxy-1
-[[[6-(4phenylbutoxy)hexyl]amino]metil]-1,3-benzenedimethanol,
1-hidroxi-2naphthalenecarboxylat, adalah obat golongan agonis reseptor beta 2
adrenergik. Obat ini sering digunakan untuk pencegahan bronkospasme yang
disebabkan oleh aktivitas berat. Salmeterol xinafoate juga banyak diresepkan
untuk asma dan pulmonary obstruktif kronis. Literatur menunjukkan bahwa
salah satu metode HPLC digunakan dalam penentuan secara simultan dari
salmeterol xinafoate dan fluticasone propionate dalam bahan baku. Analisis
tersebut menggunakan HPLC dan Spektrofotomteri dan SP-HPLC. Oleh
karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode
agar lebih sederhana dan ekonomis, yaitu dengan metode RP-HPLC. Tujuan
kedua adalah untuk memvalidasi metode ini sesuai petunjuk ICH.
3. Metode Penelitian
a. Bahan kimia yang digunakan
Salmeterol xinafoate diperoleh dari Glaxo SmithKline, India. Metanol
(HPLC grade) diperoleh dari Merck Ltd, India. Konsentrasi sampel adalah
0.1 mg salmeterol xinafoate per 10 mL larutan.
b. Instrumentasi dan kondisi kromatografi
Alat dan Bahan yang digunakan terdiri atas :
1) G 1311A solvent delivery system.
2) G1315 diode array detector.
3) Detektor UV.
4) Rheodyne injector dengan loop 20 L.
5) Prosesor data EZ Chrome Elite.
6) Kolom Qualisil BDS C-18.

7) Fase gerak terdiri atas campuran buffer fosfat : asetonitril : methanol

(45:25:30), pH diatur pada posisi 6 dengan diamonium hydrogen
orthofosfat, dan laju alir 0.5 mL per menit dengan durasi 10 menit.
Sebelum analisis dimulai, fase gerak dan larutan sampel difilter dengan
membran filter berukuran 0.45m dan dihilangkan kandungan gas nya
dengan ultrasonicator selama 15 menit. Deteksi dilakukan pada panjang
gelombang 250 nm.

Gambar 1. Struktur Salmeterol Xinafoate

Gambar 2. Spektra UV Salmeterol Xinafoate

c. Preparasi larutan stok standar dan kalibrasi

2

Larutan standar stok disiapkan dengan melarutkan 0.1 mg EL dalam 10

mL methanol, sehingga didapat konsentrasi 10 g/mL. Dari larutan stok,
diambil variasi konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 L dan dimasukkan ke
dalam vial dengan bantuan mikropipet dan dilarutkan dengan fase gerak
untuk mendapatkan rentang konsentrasi EL antara 1-6 g/mL. 20 mL
sampel diinjeksikan dengan bantuan alat injeksi Hamilton. Semua
pengukuran diulangi sebanyak lima kali untuk setiap konsentrasi, dan
kurva kalibrasi ditentukan dengan memplot area peak dengan konsentrasi.
d. Analisis formulasi
Larutan salmeterol xinafoate mengandung 1 mL per mL dari salmeterol
xinafoate dari larutan 10 mL. Dari larutan dengan volume 0.1 mL diambil
dari 10 mL vial volumetric untuk mendapatkan konsentrasi 10 g/mL.
Sebanyak 60 L diambil dengan mikropipet dan dilarutkan dengan fase
gerak untuk mendapatkan konsentrasi 6 g/mL.
e. Metode validasi
Metode HPLC divalidasi dengan mengacu ke panduan ICH.
1) Presisi
Presisi dari metode dipelajari sebagai intra-day, inter-day, dan
repeatabilitas dari sampel yang diinjeksi. Presisi intra-day ditentukan
dengan analisis larutan selama tiga kali pada hari yang sama. Presisi
inter-day diuji dengan analisis larutan pada tiga hari yang berbeda pada
satu minggu yang sama. Uji repeatabilitas dari sampel yang diinjeksi
dilakukan dengan cara menginjeksikan konsentrasi yang sama selama
enam kali sampai didapatkan perubahan area peak.
2) Spesifisitas dan selektifitas
Spesifitas dari metode dipastikan dengan analisis obat standard an
sampel. Analit harus sudah terpisah dari pengotor yang ada.
Spesifisitas adalah prosedur untuk mendeteksi analit secara kuantitatif
dengan tujuan mengetahui keberadaan sampel di dalam matriks,
sementara selektifitas adalah prosedur untuk mendeteksi secara
kualitatif dengan tujuan mengetahui keberadaan sampel di dalam
matriks. Hasilnya metode ini cukup selektif, dengan tidak adanya peak
yang mengganggu waktu retensi salmeterol xinafoate, dan baseline
yang dihasilkan tidak menunjukkan adanya pengotor.
3) Akurasi
Akurasi metode ini diambil dari persentase recovery. Untuk sampel
yang belum dianalisis (2 g/mL dari EL) seperti yang diketahui,
jumlah EL yang ditambahkan pada level 80%, 100%, dan 120% dan
dianalisis dengan metode RP-HPLC.
4) Sensitifitas
Sensitifitas dari metode ini diestimasi dari Limit of Detection (LOD)
dan Limit of Quantification (LOQ). LOD = 3.3 X ASD/S dan LOQ =

10 X ASD/S, dimana ASD adalah standar deviasi rata-rata, dan S

adalah lereng dari garis yang dibentuk.
5) Robustness
Robustness dari metode ini didapat dari membuat perubahan yang
disengaja pada beberapa parameter seperti variasi laju alir, komposisi
fase gerak, dan perubahan pH. Perubahan efek didapat pada saat
injeksi larutan 2 g/mL dari EL.
6) Ruggedness
Dari larutan stok dan larutan sampel dengan konsentrasi 2 g/mL dari
EL kemudian dipreparasi dan dianalisis dengan dua analit yang
berbeda tetapi dengan kondisi dan prosedur yang sama. Area peak
diukur pada konsentrasi larutan yang sama sebanyak enam kali.
7) Degradasi salmeterol xinafoate
a. Degradasi yang disebabkan oleh asam dan basa
10 mg salmeterol xinafoate dilarutkan secara terpisah dalam 5 ml
campuran larutan metanol 1 N HCl dan 2 N NaOH. Larutan
campmuran ini disimpan selama 40 menit dan 20 menit pada suhu
70C dalam keadaan gelap untuk menghindari efek degradatif dari
adanya cahaya. Diambil 1ml larutan campuran kemudian
dinetralkan, kemudian diencerkan sampai 10 ml dengan fase gerak.
Larutan campuran yang sudah diencerkan kemudian dimasukkan
kedalam kolom HPLC.
b. Degradasi yang disebabkan Hidrogen peroksida
10 mg salmeterol xinafoate dilarutkan secara terpisah dalam 5 ml
larutan campuran metanol hidrogen peroksida (6%, v/v). Larutan
campuran tersebut kemudian disimpan selama 1 jam pada suhu
80C dalam keadaan gelap untuk menghindari efek degradatif
mungkin cahaya. Solusi yang dihasilkan telah menyuntikkan dalam
kolom HPLC.
c. Degradasi fotokimia
Stabilitas fotokimia obat juga dipelajari dengan mengekspos solusi
saham sinar matahari langsung selama 12 jam. Tidak ada degradasi
diamati. Larutan hasilnya diaplikasikan dalam kolom HPLC.
d. Degradasi panas kering produk
Obat bubuk disimpan pada suhu 90oC selama 24 jam di bawah
kondisi panas kering. Tidak ada degradasi yang teramati. Dalam
semua studi degradasi, daerah puncak rata-rata salmeterol
xinafoate diperoleh setelah tiga kali pengulangan.
4. Hasil dan Pembahasan
1) Seleksi kromatografi dan optimasi fase gerak

Setelah mencoba kolom yang berisi fasa diam yang berbeda, pilihan
terakhir memberikan resolusi yang memuaskan dan menjalankan waktu itu
Qualisil BDS RP C-18 kolom (250 mm x 4,6 mm nomor pembayar, 5 m).
Fase gerak dipilih setelah beberapa percobaan dengan larutan penyangga
dan asetonitril di berbagai konsentrasi. Sebuah fase gerak terdiri dari
buffer : asetonitril (40:60 v / v). Hal itu diatasi dengan mengatur pH fase
gerak untuk 6 dengan diamonium hidrogen phosphaphate. Sehingga
larutan buffer : methanol : asetonitril (45:25:30 v / v / v), pH 6 terpilih
untuk mencapai puncak simetris. Telah didapatkan efek dari laju aliran
dalam rentang 0,4-1,1 mL / min. Sebuah laju alir 0,5 mL / menit
memberikan hasil yang baik, parameter kesesuaian sistem yang baik dan
waktu retensi yang wajar. Waktu retensi EL diamati pada 7.41 menit pada
250 panjang gelombang nm. Total waktu analisis adalah kurang dari 10
menit.

Gambar 3. Kromatogram dari Salmeterol Xinafoate Standar

2) Linearitas
Linearitas ditentukan untuk salmeterol xinafoat. Larutan obat pada enam
konsentrasi yang berbeda dianalisis dan dibuat kurva kalibrasi dengan
memplot faktor respon berarti terhadap konsentrasi masing-masing.
Metode ini dievaluasi oleh penentuan koefisien korelasi dan nilai intersep.
Salmeterol xinafoat mengikuti linearitas dalam rentang konsentrasi
masing-masing 1 - 6 g / mL.

Tabel 1. Penentuan Linearitas Salmeterol Xinafoate

3) Presisi
Studi presisi dievaluasi atas dasar nilai % RSD. Dalam harian presisi untuk
salmeterol xinafoate ditemukan berada di kisaran 0,53-1,22 dan 0,742,08%.Nilai-nilai %RSD yang rendah menunjukkan presisi yang tinggi
pada metode ini.

Tabel 2. Penentuan Presisi Salmeterol Xinafoate

4) Spesifitas dan selektivitas
Spesifisitas metode ini ditentukan dengan membandingkan kromatogram
yang diperoleh dari formulasi obatdan obat standar. Karena waktu retensi
dari obat standar dan obat dari formulasi adalah sama, maka metode ini
adalah spesifik. Metode ini juga spesifik dan selektif karena tidak ada
gangguan dari eksipien dalam formulasi. Metode ini cukup selektif
ditunjukkan dari tidak adanya puncak campur lain di sekitar waktu retensi
dari salmeterol xinafoat; juga garis dasar tidak menunjukkan adanya
gangguan yang signifikan.
5) Akurasi
Akurasi metode ini ditentukan pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda
yaitu 80%, 100% dan 120%. Hasil menunjukkan % recovery berada di
kisaran 98-100,31% untuk salmeterol xinafoat. Nilai % R.S.D yang
rendah menunjukkan akurasi metode ini.

Tabel 3. Penentuan Akurasi

6) Sensitivitas
LOD untuk salmeterol xinafoate ditemukan berada 0,10 mg dan LOQ
untuk salmeterol xinafoate ditemukan 0,29 ug. Nilai-nilai yang rendah
LOD dan LOQ menunjukkan sensitivitas yang memadai dari metode ini.
7) Robustness dan Ruggedness
Robustness dari metode ini dipelajari dengan membuat perubahan yang
disengaja dalam kondisi kromatografi dan kemudian efek dari hasilnya
diperiksa. Isi dari obat yang tidak terpengaruh oleh perubahan ini terlihat
dari nilai-nilai rendah % RSD (kurang dari 2%) menunjukkan ketahanan
dari metode ini. Ketika metode ini dilakukan oleh dua analis yang berbeda
di bawah kondisi percobaan dan lingkungan yang sama itu ditemukan
ketegasan dari metode ini.
8) Analisis formulasi
Enam ulangan dari larutan sampel (20 L) disuntik untuk analisis
kuantitatif. Jumlah salmeterol ksinafoat diperkirakan ditemukan menjadi
masing-masing 99,60%. Sebuah pemisahan yang baik dan resolusi obat
menunjukkan bahwa tidak ada gangguan dari eksipien biasa terdeteksi
dalam formulasi farmasi.
9) Uji kesesuaian sistem
Menurut USP, uji kesesuaian sistem digunakan untuk memverifikasi
bahwa resolusi dan reproduktifitas dari sistem kromatografi memadai
untuk analisis yang akan dilakukan. Hasil yang diperoleh dari validasi
metode dan kesesuaian sistem penelitian dirangkum dalam tabel
Sr. No
1

Parameter
Flow rate

Asymmetry
0.4
0.6

Mobile
phase
volume
(buffer:
ACN:
Methanol)

55:20:
35
65:15:
40

S.D
61731.
10
64307.
69
69314.
45
51936.
34

%RSD
2.17
2.27
2.48
1.86

Sr. No
3

Parameter
Mobile
phase =PH

Asymmetry
6.3

S.D
%RSD
78838.
2.76
60
5.3
83885.
2.76
38
4
Column
25
60755.
2.10
79
temp
35
64302. 2.27
22
Tabel 4. Robustness dari metode yang Digunakan

10) Uji degradasi

Kromatogram sampel asam yang terdegradasi untuk salmeterol xinafoate
menunjukkan puncak tambahan pada waktu retensi 7,41 menit , zat yang
terdegradasi dalam basa menunjukkan di 4.3 menit, hidrogen peroksida
menunjukkan di 7.41 menit. Kromatogram dari obat yang dipanaskan
tidak menunjukkan adanya degradasi. Konsentrasi obat itu berubah dari
konsentrasi awal, menunjukkan bahwa salmeterol xinafoate mengalami
degradasi di bawah asam, basa dan kondisi oksidatif.
Parameter

Salmeterol
xinofoate
1 6 g/mL

Linearity range
[g/mL]
Correlation
0.9980
coefficient
LOD [g]
0.10
LOQ [g]
0.29
% Recovery [n = 9]
98.12
Analyst I [ n = 6 ]
98.34
Analyst II [ n =6 ]
98.56
Precision [%
1.86
R.S.D.]
Repeatability of
0.51
Injection [n = 6]
Intra-day [n = 3]
0.15 1.56
Inter-day [n = 3]
0.51 1.99
Robustness
Robust
Specificity
Specific
Retention time [tR]
7.41
Theoretical plates
9650
[N]
Capacity factor [k]
0.61
Asymmetry [T]
1.04
Tabel 5. Rangkuman Parameter Validasi dan Uji Kesesuaian Sistem

5. Kesimpulan
1. Metode yang dikembangkan adalah sederhana, tepat, akurat, selektif dan
reproducible.
2. Metode ini memiliki nilai robustness dan ruggedness yang baik dan dapat
digunakan untuk penentuan salmeterol xinofoate dalam formulasi farmasi.
3. Metode ini dapat digunakan untuk menentukan kemurnian obat yang
tersedia dari berbagai sumber dengan mendeteksi pengotor terkait.
4. Dapat digunakan untuk mengindikasikan stabilitas.
5. Metode ini divalidasi sesuai pedoman ICH.

DAFTAR PUSTAKA
Jain, P.S. et al. 2015. Stability-Indicating RP-HPLC Method for Estimation of
Salmeterol Xinafoate in Bulk in Pharmaceutical Formulation.
International Journal of Pharmaceutical Chemistry and Analysis,
January-March 2015;2(1):28-33.

10