2.

2 PCR
PCR

(Polymerase

Chain

Reaction)

merupakan

proses

untuk

memperbanyak DNA dalam kondisi in vitro, dimana suatu segmen spesifik

dari DNA molekul tertentu akan diamplifikasi dalam jumlah jutaan kali hanya
dalam waktu yang singkat. Teknik PCR pertama kali dikembangkan pada
tahun 1985 oleh Karry Mullis. Dengan ditemukannya teknik PCR telah
menunjukkan bahwa bidang sains dan teknologi telah berkembang,
khususnya dalam kasus diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik, dan
evolusi molekular. Komponen yang diperlukan dalam proses PCR adalah
template DNA, sepasang primer yang merupakan suatu oligonukleotida
pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan
urutan nukleotida DNA template, dNTPs (deoxynucleotide triphosphates),
buffer PCR, MgCl2, dan enzim polimerase DNA.
Proses PCR terdiri dari 3 tahap utama yaitu denaturasi, annealing, dan
elongasi. Pada tahap denaturasi terjadi pemisahan DNA untai ganda menjadi
komponen untai tunggal sehingga akan terjadi hibridisasi primer PCR untai
tunggal pada sekuen targetnya. Selanjutnya pada tahap annealing primer PCR
akan berhibridisasi dengan sekuens targetnya. Primer akan berikatan dengan
target komplementernya dan jika sudah terhibridiasi tidak mudah mengalami
disosiasi.

Tahap

elongasi

merupakan

tahap

yang

penting

untuk

memperbanyak daerah yang sudah dihibridisasi oleh primer dimana waktu

inkubasi harus diperhatikan agar cukup lama bagi polimerase DNA untuk
mengamplifikasi sekuens target secara komplit tetapi cukup sebentar untuk
mencegah amplifikasi produk non-spesifik yang lebih panjang daripada
sekuens target (Yuwono, 2006).
Jika terdapat kontaminasi fragmen DNA maka dapat menyebabkan
terjadinya kesalahan yaitu didapatkannya produk amplifikasi yang tidak
spesifik. Selain itu, konsentrasi dan kualitas DNA harus diperhatikan dan
harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat
purifikasi. Lalu ukuran dan komposisi primer akan mempengaruhi temperatur

penempelan primer terhadap untaian DNA target, dan konsentrasi MgCl 2 haus
diperhatikan karena mempengaruhi spesifikasi produk PCR, aktivitas serta
kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya, dan
penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan rantai nukleotida
(Gelfand dan White, 1990).
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis adalah proses ion-ion bermigrasi dibawah pengaruh medan
listrik dimana molekul DNA atau RNA berdasarkan ukuran akan berpisah
menggunakan bantuan arus listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Prinsip kerja elektroforesis adalah suatu
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium yang
biasanya merupakan gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari kutub ke
kutub yang berlawanan sehingga DNA akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif melalui membran gel agarosa tersebut. Pita DNA hasil
elektroforesis dapat diidentifikasi dengan menggunakan gel staining etidium
bromide (EtBr) yang kemudian divisualisasi dengan UV transilluminator. Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen
DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan
basanya (Klug dan Cummings, 1994).
Menurut Wolfe (1993), proses elektroforesis memiliki beberapa faktor
yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA yaitu ukuran molekul
DNA, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase,
dan larutan buffer elektroforesis. Molekul yang berukuran kecil akan lebih
mudah bergerak melewati gel karena hambatan yang dihadapi tidak lebih
banyak dibandingkan dengan molekul berukuran besar, lalu semakin tinggi
konsentrasi agarosa maka semkain kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk
dilewati molekul-molekul DNA. Molekul yang berbentuk elips atau fibril akan
lebih cepat bergerak dibandingkan dengan molekul yang berbentuk bulat,
kemudian molekul dengan densitas muatan yang rendah akan bergerak lebih

lambat dibandingkan dengan molekul yang memiliki densitas muatan yang

tinggi. Pori-pori gel akan berpengaruh terhadap laju pergerakan dimana
semakin kecil pori-pori yang digunakan maka akan semakin lambat pergerakan
molekul DNA. Ketika tegangan listrik yang diberikan saat elektroforesis
semakin tinggi, maka pergerakan molekul DNA akan semakin cepat dan buffer
dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis instruk

Gambar 4.2 Hasil elektroforesis instruk

timur (100v/20 menit)

(Dokumen Pribadi, 2016)

barat (100v/30 menit)

(Dokumen Pribadi, 2016)

Gambar 4.4 Hasil elektroforesis DNA

4.2
Pembahasan
4.2.1

hasil PCR asisten

(Dokumen Pribadi, 2016)
Gambar 4.3 Hasil elektroforesis DNA
genom
(Dokumen Pribadi, 2016)

Metode isolasi dengan CTAB

Metode isolasi DNA dengan CTAB memiliki beberapa
tahap yaitu proses ekstraksi buffer, proses ekstraksi fenol-

kloroform, proses presipitasi DNA, proses resuspensi DNA, dan

proses purifikasi DNA. Dalam metode isolasi dengan CTAB,
terdapat beberapa reagen dan salah satunya dalah extraction buffer
yang tersusun atas 2% CTAB (Heksadesil Trimetil-amoium
bromida), 100 mM TrisHCl (pH=8), 20 mM EDTA (Asam
Etilendiamin tetrasetik), 1.4 M NaCl, 0.2% -mersaptoetanol, dan

0.1

mg
ml

proteinase K (Warden dan Alexandra, 2015).

Komponen EDTA yang digunakan pada extraction buffer

memiliki afinitas yang tinggi terhadap unsur Mg karena merupakan
DNAse

cofactors

yang

berfungsi

sebagai

enzim

untuk

mendegradasi DNA. Selain itu, terdapat senyawa NaCl yang juga

merupakan salah satu komponen larutan CTAB extraction buffer,
dimana ion Na+ berfungsi untuk membentuk ikatan fosfat dan
menetralisir muatan negatif yang menyebabkan DNA dapat
berkumpul (Martinez dan Dita, 2014).
Reagen lain yang digunakan dalam metode ini adalah PVP,
-mersaptoetanol, larutan kloroform : isoamil alkohol, etanol
absolut, isopropanol, etanol 70 %, buffer TE, CH3COONa 3 M, dan
TE-RNAse. PVP atau polivinilpirolidon adalah senyawa yang
dapat berikatan dengan polifenol sehingga membantu dalam proses
penghilangan dinding sel. Kemudian, -mersaptoetanol berfungsi
sebagai komponen untuk melakukan denaturasi protein (Martinez
dan Dita, 2014). Campuran klofororm : isoamil alkohol berfungsi
untuk menghilangkan kontaminan protein dari sel tumbuhan yang
akan diambil alih dengan reagen etanol absolut. Selanjutnya,
reagen absolut serta isopropanol akan membantu proses presipitasi
dan etanol 70% berguna untuk menghilangkan garam dan molekul
organik kecil. Reagen selanjutnya dalam isolasi DNA adalah
reagen buffer TE yang terdiri dari 10 mM Tris : 1 mM EDTA yaitu

untuk meresuspensi campuran dan menyediakan keadaan yang

cocok. Lalu reagen TE-RNAse akan menginkubasi larutan DNA
pada proses pemurnian DNA (Dellaporta, Wood, dan Hicks, 1983).
4.2.2

Amplifikasi PCR
Pada tahap amplifikasi PCR, terdapat reagen PCR mix yang
terdiri dari Enzim Taq polymerase, MgCl2, dNTPs mix, dan buffer.
Enzim Taq polymerase berfungsi sebagai biokatalisator
yang akan mengkatalis penambahan nukleotida. Enzim ini berasal
dari bakterti Thermus aquaticus dan tetap stabil dalam proses
amplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu
mendekati titik didih pada tahap elongasi. Selanjutnya, reagen
MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor pelekatan dan menstimulasi
aktivitas DNA polymerase. Selain itu, MgCl 2 akan meningkatkan
interaksi primer dengan template yang membentuk komplek larut
dengan dNTPs. Reagen dNTPs akan bertindak sebagai building
block DNA yang diperlukan dalam proses elongasi, dimana
reagen ini terdiri dari dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP. dNTPs
kemudian akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari
primer untuk membentuk untai baru yang komplementer dengan
untai DNA template. Buffer adalah komponen yang mengandung
ion Mg2+, serta kation monovalen seperti Na+, dan beberapa
cosolvent untuk menstabilisasi enzim DNA polymerase. Buffer
akan menunjang reaksi in vitro (Nicholl, 2002).
Pada amplifikasi PCR terdapat tiga siklus yaitu denaturasi,
annealing, dan elongasi dimana pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Pada tahap denaturasi,
sampel DNA akan berpisah dari double stranded menjadi single
stranded dimana masing-masing strand akan menjadi DNA
template. Suhu disetting pada tahap denaturasi inisiasi ke 90-94C
selama 5 menit dan pada denaturasi siklus ke 95 C selama 30
detik. Selanjutnya, untai DNA akan didinginkan hingga mencapai
suhu 50-56C yaitu pada proses annealing untuk memberi waktu

pada primer menempel pada daerah tertentu dari target DNA.

DNA polimerase digunakan untuk memperpanjang fragmen DNA
(elongasi) dari primer yang telah menempel menggunakan enzim
Taq polimerase pada suhu 72C. Saat siklus usai, PCR akan
menuju suhu 4C untuk proses penyimpanan. Produk PCR atau
amplikon dapat diestimasikan sebanyak 2n. N menyatakan jumlah
siklus yang dilakukan. Target DNA yang diinginkan akan
meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat terjadi lalu
DNA non-target akan meningkat secara linier.
4.2.3

Elektroforesis
Pada praktikum ini, DNA ladder yang digunakan adalah
DNA ladder generuler 1kb yang rentang pengukurannya adalah
250-10.000 bp (Thermo Fisher Scientific, 2016). Panjang gen ITS
yang didapat dari hasil praktikum adalah 500bp, berbeda dengan
literatur yaitu 200bp (National Centre for Biotechnology
Information). Hal ini dapat disebabkan karena terjadinya
kontaminasi saat elektroforesis terjadi atau kesalahan pada
praktikan.
Elektroforesis

pada

DNA

genom

menghasilkan

elektroferogram yang polos tidak ada band, dimana hal ini

menunjukkan bahwa elektroforesis DNA genom tidak akan
menghasilkan band karena tidak ada DNA spesifik yang dipilih
sehingga DNA tidak berkumpul pada suatu titik tertentu (Corkill,
2008). Nomor sumur 16 terlihat lebih tebal dibandingkan sumur
lainnya karena kemungkinan tidak terjadi kebocoran sehingga
DNA template yang didapat masih banyak.
Hasil elektroforesis di Laboratorium Instruksional Barat
menunjukkan bahwa band muncul di bagian bawah agarosa
karena waktu elektroforesisnya selama 30 menit sedangkan
elektroforesis DNA untuk template Laboratorium Instruksional
Timur dilakukan selama 20 menit. Hal ini menunjukkan bahwa
semakin lama DNA template dielektroforesis maka perjalanan

band agarosa akan semakin jauh sehingga resolusi band yang

terbentuk menjadi rendah (Fatchiyah, 2006).

BAB V
KESIMPULAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan

dari

percobaan

Isolasi

DNA

Tumbuhan

dan

Amplifikasi Gen ITS Fabaceae adalah:

1. DNA tumbuhan dari famili Fabaceae yang diambil dari sampel
daun dapat berhasil diisolasi dengan menggunakan metode
CTAB.
2. Hasil isolasi DNA tumbuhan diambil DNA template dengan cara
diamplifikasi pada PCR.
3. Pengujian hasil isolasi dan PCR dari DNA template tumbuhan
famili Fabaceae dikonfirmasi dengan metode elektroforesis
sehingga didapatkan DNA sepanjang 200bp.

DAFTAR PUSTAKA
Bettelheim, F.A, Landesberg, J.M. 2007. Laboratory Experiments for General,
Organic, and Biochemistry, 6th edition. Chaput, J.C. ISBN-13:
9780495015048.
Corkill, G. R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. New
Jersey: Humana Press.
Dellaporta, S.L., J. Wood, dan J.B. Hicks. 1983. A Plant DNA Mini Preparation:
Version II. Plant Molecular Biology Reporter.
Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press .
Gelfand, D. H and White, T. J. 1990. Thermostable DNA Polymerase for PCR
Protocols: A Guide to Methods and Aplications. San Diego: Academic Press
Inc.
Kaidah, S., dan Suprapto. 2003. Penentuan Metode Isolasi DNA Tanaman Salak
Komersial. Bulletin Penelitian 7 : 55-56.
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics, 4th ed. Prentice
Hall, Englewood Cliffs.
Martinez, Einar, dan Miguel Dita. 2014. Basics Aspects of Molecular Biology and
DNA Extraction.
Milligan, B. G. 1992. Plant DNA Isolation. In M. G. Murray and W.F. Thomspon.
Molecular Genetic Analysis of Population
Murray, M.G., W.F. Thompson. 1980. Rapid Isolation of High Molecular Weight
Plant DNA. Carnegie Institution of Washington. Department of Plant
Biology. Stanford, USA.

National
Center
for
Biotechnology
Information.
Diakses
dari
http://www.ncbi.nlm.nih.gov pada 16 November 2016.
Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers Limited,
Oxford.
Nicholl, D. S. T. 2002. An Introduction to Genetic Engineering. Ed ke-2.
Cambridge University Press, Edinburgh: 306 hlm.
Shmaefsky, B.R. 2006. Biotechnology 101. Westport: Greenwood.
Sudarsono. 1996. Retricsion Fragmen Length Polymorphism (RFLP). Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.
Thermo Fischer Scientific. 2016. GeneRuler DNA Ladder 1kb. Diakses dari
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/SM0312 pada 16
November
Wolfe, S.L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing
Company. California.
Warden dan Alexandra. 2015. DNA Extraction - CTAB Method. CTAB DNA
Extract Genome Sequence Quality.
Wyatt, S.D. and J.K. Brown, 1996. Detection of subgroup III geminivirus isolates
in leaf extracts by degenerate primers and polymerase chain reaction.
Phytopathology, 86: 1288-1293.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Jogjakarta:
Penerbit ANDI. Hal: 17-23.