MAKALAH BIOTEKNOLOGI

PERAKITAN TANAMAN CABAI TRANSGENIK TAHAN

TERHADAP CUCUMBER MOSAIC VIRUS (CMV)

Oleh:
Eni Puspitaningrum 134140020
Admir Arhif Fayuns Fabanyo 134140024
Miftakhul Muflikhah 134140
Dwitya Rachmaningtiyas 134140

PROGAM STUDI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL VETERAN
YOGYAKARTA
2016
 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman cabai (Capsicum annum Var.) merupakan salah
satu komoditas hortikultura yang memiliki nilai ekonomi
penting di Indonesia. Cabai merupakan tanaman perdu dari
famili terongterongan yang memiliki nama ilmiah Capsicum
sp. Cabai berasal dari benua Amerika tepatnya daerah Peru
dan menyebar ke negaranegara benua Amerika, Eropa dan Asia
termasuk Negara Indonesia.
Tanaman cabai mempunyai banyak ragam tipe
pertumbuhan dan bentuk buahnya. Diperkirakan terdapat 20
spesies yang sebagian besar hidup di Negara asalnya.
Masyarakat pada umumnya hanya mengenal beberapa jenis
saja, yakni cabai besar, cabai keriting, cabai rawit dan
paprika. Secara umum cabai memiliki banyak kandungan gizi
dan vitamin. Diantaranya Kalori, Protein, Lemak, Kabohidarat,
Kalsium, Vitamin A, B1 dan Vitamin C. Selain digunakan untuk
keperluan rumah tangga, cabai juga dapat digunakan untuk
keperluan industri diantaranya, Industri bumbu masakan,
industry makanan dan industri obatobatan atau jamu. Buah
cabai ini selain dijadikan sayuran atau bumbu masak juga
mempunyai kapasitas menaikkan pendapatan petani.
Disamping itu tanaman ini juga berfungsi sebagai bahan
baku industri, yang memiliki peluang eksport, membuka
kesempatan kerja.
Tanaman cabai (Capsicum annum Var.) merupakan tanaman
sayuran yang tergolong taaman setahun, berbentuk perdu, dari
suku (famili) terong terongan (Solanaceae) (Aripin & Lubis 2003).
Berdasarkan data statistik, pada tahun 2008 total areal
pertanaman sayuran Indonesia sebesar 990,915 ha dan 20.46%
di antaranya ditanami komoditas cabai. Meskipun demikian, rata-
rata produktivitas cabai di Indonesia tahun 2008 baru mencapai
5.36 ton per hektar, sedangkan potensi hasil yang dapat dicapai
adalah 1721 ton per hektar (Daryanto 2010).
Upaya peningkatan produktifitas tanaman cabai telah
banyak dilakukan mulai dari modifikasi dalam teknik budidaya,
pengelolaan hama dan penyakit, hingga teknologi genetika.
Hama dan penyakit tanaman masih menjadi faktor pembatas
yang sangat berpengaruh dalam proses budidaya tanaman
cabai.Penyakit yang menyerang tanaman dapat disebabkan oleh
beberapa patogen diantaranya yaitu virus, bakteri, cendawan,
dan nematoda. Salah satu tanaman yang terserang adalah
tanaman cabai.
Penyakit yang disebabkan oleh virus, diantaranya cucumber
mosaic virus (CMV), tobacco etch virus (TEV), tobacco mosaic
virus (TMV), potato virus Y (PVY), dan chilli veinal mosaic virus
(CVMV). Penyakit yang disebabkan oleh virus cukup sulit
dikendalikan. Upaya pengendalian penyakit oleh virus
menggunakan insektisida untuk rnenekan populasi serangga
vektor ternyata kurang efektif dan berdampak negatif terhadap
lingkungan dan konsumen rnelalui pencemaran dan residu pada
hasil panen.
Penyakit cucumber mosaic virus (CMV) merupakan penyakit
yang sering menyerang dan penting pada tanaman cabai.
Pengendaliannya cukup sulit karena keragaman genetika CMV
yang tinggi sehingga sulit menemukan jenis cabai yang tahan;
kisaran tanaman inang CMV yang luas; dan CMV dapat ditularkan
oleh berbagai jenis kutu daun secara nirpersisten. Sifat CMV yang
demikian rnerupakan kendala bagi penerapan pengendalian baik
secara kultur teknik maupun kimiawi (Akin 2005).
Penggunaan bioteknologi bukan untuk menggantikan
metode konvensional tetapi bersama-sama menghasilkan
keuntungan secara ekonomi. Penggunaan metode konvensional
dengan teknologi tinggi memaksimumkan keberhasilan program
perbaikan pertanian. Bioteknologi harus diintegrasikan ke dalam
pendekatan-pendekatan konvensional yang sudah mapan.
Bioteknologi berkembang dengan cepat di berbagai sektor dan
meningkatkan keefektifan cara-cara menghasilkan produk dan
jasa (Sunarlim & Sutrisno 2003).
Bentuk rekayasa genetika dimanfaatkan dalam pembuatan
tanaman transgenik yang tahan terhadap hama ataupun
penyakit tanaman. Tanaman transgenik adalah tanaman yang
ditransfer atau disisipkan sebuah gen dari spesies lain secara
sengaja, sehingga memperoleh tanaman yang diinginkan,
khususnya tanaman yang tahan terhadap hama atau penyakit.
Upaya perakitan tanaman cabai transgenikmerupakan salah satu
alternatif solusi pengendalian yang ramah lingkungan serta lebih
efektif dalam menangani penyakit CMV.

Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah untuk
mengetahui cara pembuatan tanaman cabai transgenik tahan
CMV dengan metode transformasi gen melalui bantuan vektor
plasmid Agrobacterium tumefaciens.
 ISI
Cucumber mosaic virus (CMV) adalah penyebab penyakit
yang kompleks pada tanaman cabai. Berbagai usaha telah
dilakukan untuk dapat mengendalikan penyakit akibat CMV ini,
akan tetapi usaha tersebut kurang memberikan hasil yang
efektif. Untuk itu, diperlukan tanaman yang resisten terhadap
infeksi virus. Pembuatan tanaman transgenik dengan rekayasa
genetika memerlukan beberapa komponen rekayasa genetika
diantaranya: 1) tersedianya gen spesifik yaitu gen antivirus (gen
coat protein CMV), 2) tersedianya teknik indroduksi gen CP ke
dalam genom tanaman cabai dan regenerasi cabai transgenik
yang diperoleh, dan 3) ekspresi gen CP pada tanaman
transforman.
Pembuatan tanaman cabai resisten CMV yaitu dengan
membuat tanaman transgenik cabai dengan metode
transformasi gen melalui bantuan vektor bakteri Agrobacterium
tumefaciens. Proses pembuatan tanaman transgenik dilakukan
dalam beberapa tahapan diantaranya isolasi, kloning, dan
kontruksi gen ketahanan terhadap CMV. Setelah konstruksi gen
ketahanan terhadap CMV diperoleh maka dilakukan beberapa
tahapan yaitu menginduksikan gen ketahanan terhadap CMV
(gen CP CMV) ke dalam tanaman cabai, analisis molekuler
tanaman transgenik, dan uji ketahanan tanaman transgenik, juga
pewarisan sifat gen CP CMV pada regenerasi tanaman cabai.

Konstruksi Gen CP CMV pada Agrobacterium

Teknik rekayasa genetika merupakan salah satu teknik yang
menjanjikan untuk mendapatkan tanaman yang resisten
terhadap penyakit virus. Tanaman cabai transgenik yang tahan
terhadap CMV merupakan tanaman cabai yang mengandung gen
ketahanan virus (coat protein PVY/CP PVY) (Siregar, Khardinata
2005). Untuk memperoleh gen ketahanan terhadap CMV (gen CP
CMV) yang siap diintroduksikan ke dalam genom tanaman cabai,
diperlukan pekerjaan yang meliputi isolasi, kloning, dan
konstruksi gen ketahanan.
Alat dan bahan yang digunakan dalam mengonstruksi gen
ketahanan ini antara lain primer spesifik berdasarkan urutan
nukleotida spesifik CP CMV, vector plasmid, vector transformasi,
enzim restriksi, enzim ligase, E. coli DH5, primer M13, pCAMBIA
1301, pCAMBIA 1304, Agrobacterium EHA101, Agrobacterium
EHA105, antibiotik tetracycline, rifampicin, kanamycin, dan alat-
alat untuk pekerjaan molekuler.
Metode-metode yang dilakukan dalam merakit gen
ketahanan CP CMV meliputi disain primer oligonukleotida gen CP
CMV, ekstraksi RNA total dari sampel tanaman, proses RT-PCR
(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) CP CMV,
kloning dan konstruksi gen CP CMV pada plasmid vektor,
transformasi plasmid rekombinan, seleksi klon positif, dan
kontruksi vektor transformasi.
Dalam perakitan gen ketahanan CMV, disain primer
oligonukleotida gen CP CMV digunakan untuk menentukan
sekuen yang spesifik untuk CP CMV. Kemudian proses RT-PCR
dilakukan untuk pembentukan cDNA CP CMV. Selanjutnya,
dilakukan kloning untuk memperoleh klon bakteri yang
mengandung plasmid rekombinan antara cDNA CP CMV dengan
plasmid vektor. Kloning cDNA CP CMV dilakukan dengan
meligasikannya ke dalam plasmid vektor pGEM-T Easy (Promega)
sehingga akan diperoleh plasmid rekombinan yang terdiri dari
DNA plasmid dan cDNA CP CMV. Plasmid rekombinan kemudian
ditransformasikan ke dalam Escherichia coli DH5 yang
kompeten dan bakteri tersebut dikulturkan pada media seleksi LB
yang mengandung ampisilin dan X-gal.Klon bakteri yang tumbuh
(klon positif) merupakan klon hasil seleksi yang mengandung
DNA CP CMV. Klon positif ini selanjutnya diambil untuk
diamplifikasi dan dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa
untuk melihat adanya insersi dan ukuran DNA. Pemotongan
dilakukan menggunakan enzim Ncol.Untuk konstruksi vektor
transformasi, DNA CP CMV dari bakteri klon diinsersikan ke dalam
plasmid pCAMBIA 1301 yang mengandung promoter kuat 35S
untuk tanaman. Plasmid pCAMBIA 1301 yang mengandung gen
CP CMV ini kemudian dipindahkan ke dalam Agrobacterium
tumefaciens strain EHA101 dan EHA105 dengan sistem tri
parental mating menggunakan bakteri penolong HB101
(pRK2013). Selanjutnya, bakteri A. tumefaciens diseleksi dengan
menggunakan antibiotik penyeleksi.

Introduksi Gen CP CMV

Introduksi gen CP CMV ke dalam genom tanaman cabai
dilakukan pada eksplan daun tanaman cabai berumur 21 hari
yang dikokultivasi dengan kultur bakteri Agrobacterium dengan
cara merendam eksplan di dalam suspensi bakteri selama 5
menit. Eksplan yang telah diberi perlakuan perendaman
suspensi bakteri akan dikulturkan pada media regenerasi, yaitu
media dasar MS (Murashige & Skoog) yang ditambahkan zat
pengatur tumbuh BAP dan IAA, antibiotik penyeleksi (Kanamycin)
dan antibiotik cefotaxime untuk membunuh Agrobacterium.
Eksplan disubkultur ke dalam media seleksi dan semua kultur
diinkubasikan dalam ruangan kultur dengan intensitas
penyinaran 1000-1500 lux selama 24 jam dengan suhu ruang
diatur sehingga berkisar antara 26-28 C. Hasil kultur eksplan
yang berhasil tumbuh pada media seleksi akan dilanjutkan ke
tahapan analisis molekuler tanaman transgenik. Tanaman yang
berhasil tumbuh pada media seleksi merupakan tanaman yang
berhasil direkayasa atau sudah menjadi calon tanaman
transgenik.
Analisis molekuler tanaman transgenik dilakukan untuk
membuktikan adanya integrasi gen CP CMV yang diintroduksikan
ke dalam tanaman cabai. Deteksi integrasi gen nptll dan gen CP
CMV dilakukan dengan teknik PCR. Gen nptll ini adalah gen
tahan antibiotik sehingga eksplan dapat tumbuh dalam media
seleksi.

Uji Tanaman Transgenik

Tahap terakhir dari perakitan tanaman transgenik ini yaitu
dengan uji ketahanan dan pola pewarisan sifat dari tanaman
transgenik. Uji ketahanan ini bertujuan untuk mengetahui
ketahanan tanaman transgenik yang diperoleh terhadap strain
virus CMV. Tanaman transgenik yang berhasil menjadi tanaman
sempurna di media seleksi (R0) akan diaklimatisasi pada pot di
rumah kasa tertutup. Kemudian benih yang diperoleh dari
tanaman R0 merupakan benih R1 atau generasi F1.Tanaman R1
digunakan sebagai tanaman pengujian.Tanaman R1
diinokulasikan CMV secara mekanik, kemudian tiga minggu
setelah inokulasi daun pucuk tanaman cabai dianalisis dengan
teknik ELISA (Enzym Link Immunosorbant Assay). Tanaman yang
telah teruji ketahananya selanjutnya harus diketahui pola
pewarisan dari gen CP CMV pada tanaman transgenik cabai. Pola
pewarisan sifat pada tanaman cabai transgenik yang diperoleh
dilakukan pengujian sampai keturunan R2 (generasi F2).
Kegiatan pemuliaan hingga R2 akan dapat mengetahui
kestabilan integrasi gen CP CMV yang diinsersikan pada genom
cabai.
Teknik rekayasa genetik merupakan salah satu cara yang
menjanjikan untuk mendapatkan tanaman yang resisten
terhadap penyakit virus. Gen ketahanan tersebut berasal dari
virus sendiri, yaitu gen CP CMV dan gen tersebut dimasukkan ke
dalam genom tanaman cabai (Siregar 2005). Tiga komponen
kunci rekayasa genetik untuk mendapatkan tanaman cabai
transgenik tahan virus adalah tersedianya gen antivirus (gen CP
CMV), tersedianya cara introduksi gen CP ke dalam genom
tanaman cabai dan regenerasi cabai transgenik, serta ekspresi
gen CP pada tanaman transforman (Siregar 2005).
 PENUTUP
Kesimpulan
Perakitan tanaman cabai transgenik tahan terhadap
penyakit Cucumber Mosaic Virus (CMV) dilakukan melalui
konstruksi gen ketahanan CP CMV, kemudian transformasi gen ke
dalam gen Agrobacterium tumefaciens, lalu introduksi gen ke
dalam genom tanaman cabai. Tanaman cabai yang telah
diitroduksi genom, kemudian diuji ketahanannya terhadap CMV
dan pewarisan sifat gen CP CMV-nya.
 DAFTAR PUSTAKA

Akin HM. 2005. Kepatogenan satelit RNA yang berasosiasi

dengan Cucumber Mosaic Virus (CMV-satRNA) pada
tanaman cabai. HPT Tropika 5(1): 37-41.
Aripin K, Lubis L. 2003. Teknik pengelolaan hama terpadu (PHT)
pada tanaman cabai (Capsicum annum) di dataran rendah.
Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara.
Daryanto A , Sujiprihati S, Syukur M. 2010. Heterosis dan daya
gabung karakter agronomi cabai (Capsicum annuum L.) hasil
persilangan half diallel. J. Agron 38 (2): 113-121.
Siregar EBM. 2004. Uji virus mosaik ketimun-satelit RNA-5
dalam memproteksi tanaman cabai merah (Capsicum
annum L.) terhadap virus mosaik ketimun patogenik (Siregar
2004).
Siregar EBM. 2005. Kontruksi gen CP CMV pada Agrobacterium.
Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara.
Siregar EBM, Khardinata EH. 2005. Rekayasa Genetika Tanaman
Cabai (Capsicum annum L.) Tahan Virus Mosaik Ketimun
(CMV). Jurnal Komunikasi Penelitian 17 (2): 30-36.
Sunarlim N, Sutrisno. 2003. Perkembangan penelitian
bioteknologi pertanian di Indonesia. Tinjauan Ilmiah Riset
Biologi dan Bioteknologi Pertanian 6 (1).