Daftar isi

Daftar isi................................................................................................. 1
PENDAHULUAN....................................................................................... 2
1.1 Latar Belakang..........................................................................2
1.2 Rumusan Masalah.........................................................................2
1.3 Tujuan........................................................................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA................................................................................. 4
2.1 Penetapan Kadar DNA dan Kemurnian DNA..................................4
METODE KERJA....................................................................................... 6
3.1 Alat............................................................................................... 6
3.2 Bahan............................................................................................ 6
3.3 Prosedur Kerja............................................................................... 6
3.4 Kalkulasi........................................................................................ 6
HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................................8
4.1 HASIL PENGAMATAN......................................................................8
4.2 PEMBAHASAN................................................................................ 9
BAB V................................................................................................... 13
PENUTUP.............................................................................................. 13
1. Kesimpulan................................................................................. 13
2. Saran.......................................................................................... 13
Daftar Pustaka...................................................................................... 14

1
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Plasmid merupakan bagian yang penting dalam rekayasa genetika. Plasmid

adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan
terdapat di dalam sel hidup. Didalam satu sel dapat ditemukan lebih dri satu
plasmid dengan ukuran yang berbeda-beda. Umumnya plasmid mengkodekan
gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang
menguntungkan sehingga apabila keadaan sudah kembali norma, maka plasmid
akan dibunang. Plasmid telah diproduksi secara komersil oleh banyak perusahaan
besar untuk digunakan sebagai vektor kloning. Agar dapat digunakan sebagai
vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria diantaranya yaitu harus
berukuran kecil, memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor, serta memiliki
situs pemotongan enzim retriksi untuk memudahkan penyisipan DNA kedalam
vektor plasmid. Keberadaan DNA plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik
DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA
plasmid dari bakteri atau yeast.
Pemurnian DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai
pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa
protein. Untuk mengukur kemurnian atau menentukan kadar DNA plasmid
digunakan spektrofotometri.Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa
yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsisuatu zat terhadap radiasi sinar
elektromagnetik. DNA mampu menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260
nm karena adanya basa purin dan pirimidin.

1.2 Rumusan Masalah

1.1.1. Bagaimana cara untuk menentukan kadar DNA menggunakan
spektrofotometer ?
1.1.2. Bagaimana cara untuk menentukan kemurnaian DNA hasil isolasi ?

1.3 Tujuan
1.1.1 Untuk menentukan kadar DNA menggunakan spektrofotometer.
1.1.2 Untuk menentukan kemurnaian DNA hasil isolasi.

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

3
2.1 Penetapan Kadar DNA dan Kemurnian DNA
Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA
(deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul
utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya
terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh
karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam
sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru
bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme (Anonim,
2011).
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara
yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis
untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau
komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya
dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011).
Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode
spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible),
spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet
visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009).
Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur
konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009).

Pada praktikum kali ini digunakan spektrofotometri UV-VIS.

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV
tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini
terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna
dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa

4
meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat
jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah
sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi
suspensi.
Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya
UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling
populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011)
Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis, DNA murni dapat
menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.
Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan
protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm.

Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai

absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan
nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. Apabila nilai kemurniannya kurang
dari 1,8 maka mengalami kontaminasi fenol/protein, jika nilai kemurniannya lebih
dari 2,0 maka akan mengalami kontaminan RNA.
Rumus perhitungan konsentrasi DNA adalah sebagai berikut:

Abs 260nm larutan DNA

Abs 280 nm larutan DNA

BAB III

METODE KERJA

5
 3.1 Alat
a Kuvet kwarsa 1 mL
b Mikropipet
c Mikrotip

3.2 Bahan
a DNA hasil isolasi
b Buffer TE
c ddH2O

3.3 Prosedur Kerja

Mengukur blanko (kuvet diisi 1000 l aquabidest steril) pada panjang

gelombang 260 nm sampai A = 0.00

Memipet 5 l DNA dan 995 l aquabidest steril kemudian dicampur dengan

baik

Mengukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 260 nm

Mengulangi pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 280 nm

Menjumlah DNA yang ditentukan dengan asumsi 1 Abs260 nm = 50 ug DNA

3.4 Kalkulasi
a Perhitungan konsentrasi DNA:

DNA g/l = A260 nm x faktor pengenceran x 50 g/l

b Perhitungan kemurnian DNA:

Kemurnian: DNA = A260 / A280

Keterangan
A260 / A280 = 1,8 2,0
Apabila pada A260 / A280 < 1,8, maka kontaminan fenol /
protein
Apabila pada A260 / A280 > 1,8, maka kontaminan RNA

6
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENGAMATAN

1) Tabel Pengamatan
Sampel A260 A280 Kadar DNA Kemurnian
(g/ml) DNA

7
Isolat DNA 0,255 0,236 2.550 (g/ml) 1,08
Plasmid A1

2) Perhitungan
a. Kadar DNA
Kadar DNA = A260nm x faktor pengenceran x 50 (g/ml)
= 0,255 x 200 x50 (g/ml)
= 2.550 (g/ml)

b. Kemurnian DNA
Kemurnian DNA = A260 : A280
= 0,255 : 0,236
= 1,08

Keterangan:A260 = Absorbansi pada panjang gelombang 260nm

A280 = Absorbansi pada panjang gelombang 280nm

4.2 PEMBAHASAN
Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA
(deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul
utama penyusun berat kering setiap organisme. DNA terbagi menjadi dua yaitu
DNA kromosomal dan DNA ekstrakoromosomal. DNA Plasmid lasmid adalah
DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa
ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu
plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak
mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut. Umumnya,

8
plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan
yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA
plasmid dapat dibuang.

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara

yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuaniitatif DNA adalah analisis
untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau
komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya
dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Pengujian kuantitatif DNA dapat
dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara
yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultraviolet),
Spektrofotometri UV-Vis (ultravioletvisible) dan Spektrofotometri Infra Red
Dalam praktikum ini , menggunakan metode spektrofotometri UVVis untuk
analisis kuantitatif DNA.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur

konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi.

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan

Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV
tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini
terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun
tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih
dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah
sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi
suspensi.

9
 Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya
UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling

populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011)

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap

cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang
kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan
adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat
diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi
280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah,
2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung
kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA
plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang
diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati,
2011) Atau bisa juga DNA hasil isolasi terkontaminasi oleh fenol atau protein.

Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-
Vis antara lain : mikropipet, kuvet, spektrofotometer dan seperangkat komputer.
Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan aquadest steril sebagai blanko.
Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidupkan alat
spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest steril.
Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya
pada tempat kuvet sebanyak 5 mikroliter ditambah dengan 995 mikroliter
aquabidest steril. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian
DNA-nya.

Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :

[DNA] = 260 x 50 x Faktor pengenceran

10
 Keterangan :

260 = nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug

untai ganda DNA per ml (dsDNA)

Sedangkan untuk mengukur kemurnian DNA digunakan rumus

260 : 280

Keterangan :

260 = nilai absorbansi pada 260 nm

280 = nilai absorbansi pada 280 nm

Dari hasil percobaan dan peritungan yang kelompok kami lakukan,

didapatkan konsentrasi DNA plasmid adalah sebesar 2.550 (g/ml). Sementara
kemurnian dari DNA plasmid adalah 1,08. Berdasarkan hasil tersebut, dapat
dikatakan bahwa DNA plasmid hasil isolasi tidak murni karena memiliki nilai
>1,8. DNA dikatakan murni apabila nilai kemurniannya antara 1,8-2,0. Karena
memiliki nilai lebih kecil dari 1,8, kemungkinan besar DNA plasmid hasil isolasi
terkontaminasi oleh fenol.

Hal ini dapat terjadi karena tidak sempurnanya pada saat pengeringan pelet
DNA. Saat proses isolasi DNA, terdapat tahap pencucian pelet DNA hasil
presipitasi. Setelah proses presipitasi selama 1 jam, dilakukan sentrifugasi selama
2 menit. Kemudian supernatan dibuang, dan pelet yang dihasilkan dicuci dengan 1
ml metanol 70% kemudian disentrifus kembali. Pelet yang dihasilkan ini
kemudian dikeringkan menggunakan desikkator. Tetapi, kelompok kami
menggunakan pengeringan biasa yaitu didiamkan tanpa menggunakan desikkator.
Kemungkinan, proses pengeringan ini tidak sempurna sehingga DNA hasil isolasi
tidak murni dan terkontaminasi metanol 70%.

Adapun titik kritis dalam penetapan kadar DNA antara lain :

11
(a) Pemipetan
Pada saat memipet, baik pada saat memipet DNA plasmid dan aquabidest
harus tepat, karena akan berpengaruh pada nilai pengenceran/ faktor pengenceran
(b) Antara DNA plasmid dengan aquabidest harus homogen. Maka dari itu, proses
penghomogenan yaitu dengan cara membolak balik kuvet perlu diperhatikan.

BAB V

PENUTUP

1. Kesimpulan
Hasil percobaan didapatkan konsentrasi DNA plasmid adalah
sebesar 2.550 (g/ml). Sementara kemurnian dari DNA plasmid adalah
1,08. Berdasarkan hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa DNA plasmid
hasil isolasi tidak murni karena memiliki nilai <1,8. DNA dikatakan murni
apabila nilai kemurniannya antara 1,8-2,0. Karena memiliki nilai lebih
kecil dari 1,8, kemungkinan besar DNA plasmid hasil isolasi
terkontaminasi oleh fenol, hal ini dikarenakan ketidak sempurnaan pada
saat pengeringan pelet DNA.

12
 2. Saran
1. Sebelum penambahan bufer TE hendaknya pelet hasil
presipitasi dikeringkan terlebih dahulu dalam desikator
2. Bilas kuvet dengan sampel yang akan diukur absorbansinya
agar meminimalisir terjadinya kontaminan
3. Pastikan panjang gelombang pada spektrofotometri 260 nm /
280 nm

Daftar Pustaka
Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. Tersedia di
http://puspalarasati.wordpress.com. [Diakses tanggal 28 Maret 2017].
Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di
http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-
analisis/ [diakses tanggal 28 Maret 2017].

13