CARA STERILISASI DALAM KULTUR JARINGAN

Disusun untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Kultur Jaringan Tumbuhan

DISUSUN OLEH:

KELOMPOK 2

MONITA YOLANDA (1610211052)

NOVI RAHMADONA (1610211053)
RIDA ILASRI (1610211068)
KHAIRUN NISAK (1610212045)

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS ANDALAS
2017
 BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Syarat utama dari kultur jaringan adalah kondisi yang aseptik, bebas dari
jamur dan bakteri. Hambatan utama dari kultur jaringan adalah adanya
kontaminan yang timbul akibat kesalahan prosedur pengerjaan. Kontaminan
tersebut akan mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur. Adanya
kontaminan ini mengakibatkan sel dan jaringan tanaman kultur akan mati,
matinya eksplan disebabkan karena dibebaskannya senyawa-senyawa toksik
sebagai hasil metabolism daro mikroba kontamina, dapat juga karena eksplannya
dimakan oleh mikrobia kontaminan tersebut. Oleh karena itu diperlukan
prosedur aseptic seperti: sterilisasi ruang kerja, sterilisasi medium dan alat-alat
dan sterilisasi eksplan.

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana prosedur sterilisasi ruang kerja?
2. Bagaimana prosedur sterilisasi medium dan alat-alat?
3. Bagaimana prosedur sterilisasi eksplan?

C. Tujuan Penulisan
Penulisan makalah ini bertujuan agar pembaca mengetahui bagaimana
prosedur sterilisasi yang baik dan benar, agar medium kultur tidan terkontaminasi
baik itu jamur atau bakteri.
 BAB II PEMBAHASAN

Perbanyakan tanaman secara in vitro bertujuan untuk memperoleh bahan

tanaman steril yang akan digunakan untuk perbanyakan benih. Oleh karena itu,
diperlukan proses sterilisasi yang tepat untuk mematikan mikroorganisme yang
terdapat pada eksplan sehingga tidak mengganggu pertumbuhan tanaman.
Keberhasilan sterilisasi dipengaruhi oleh sumber eksplan (tanaman), seperti
tanaman herba atau berkayu, dan kondisi lingkungan (musim hujan atau kemarau)
(Deden dkk, 2003).
Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan
dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya yang
nyata dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis dari mikroorganisme sangat
berbeda dalam kelemahannya. Terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan
lebih banyak lagi, afek yang praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyata yang
sangat besar dipengaruhi oleh keadaan sekitar. Banyak yang akan bertahan,
contohnya, pada cuaca tertentu organisme memiliki kulit, pada beberapa tubuh zat
cair atau pada udara, Air, makanan, kotoran, atau ruangan berdebu. Caranya
harus dirubah, oleh karena itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak mungkin,
bagaimanapun pada garis besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada
umumnya digunakan cara untuk memusnahkan dan mengontrol kehidupan
mikroba ( Inforedia 2009).

A. Sterilisasi Ruang Kerja

Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril
ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi
dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan
lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan
yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus
dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi
manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat
mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu
rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan
sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat menghasilkan ozon
sehingga peneliti yang akan bekerja harus menunggu 15-30 menit setelah UV
dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup.
Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini harus memakai jas
lab.masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik,
kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat
alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain
Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).

B. Sterilisasi Media dan Alat-Alat

Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya
dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoklaf,
bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada
temperatur 121C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit
tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam
tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan dengan
tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan
yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.
Pada praktikum ini digunakan sterilisasi uap bertekanan, sterilisasi uap
bertekanan menggunakan autoklaf. Autoklaf adalah sterilisasi untuk alat dan
medium kultur jaringan. Alat-alat yang berupa glass ukur maupun cawan petri
sebelum digunakan harus disterilkan dahulu. Demikian juga medium yang sudah
dimasukkan ke dalam botol medium harus disterilkan juga. Dengan pemanasan di
dalam autoklaf maka bakteri dan mikrobia dapat mati akibat suhu yang tinggi
(120C) dan tekanan uap air yang besar (1,5 kg/cm) selama 1 menit. Autoklaf
mempunyai cara kerja yang hampir sama dengan alat masak pressure cooker ,
sebab alat ini merupakan sebuah bejana yang diisi air dan ditutup rapat-rapat.
Autoklaf ada yang model listrik tetapi ada pula yang harus diletakkan diatas
kompor gas. Jika alat ini dipanaskan, maka akan terjadi uap air yang tidak dapat
keluar karena bejana tertutup rapat, sehingga tekanan di dalam autoklaf naik
sampai melebihi tekanan normal (Erna Pali dkk, 2015). Media yang digunakan
juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya menggunakan autoklaf
dengan suhu 121oC kurang lebih selama 15 menit.
Autoklaf yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling
sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoklaf sederhana
pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan
dan waktunya dilakukan secara manual. Sterilisasi medium kultur dengan
menggunakan autoklaf mempunyai banyak kelemahan, antara lain:
1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa
2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan
terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun
didalam medium kultur
3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami
perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.

Sterilisasi media yang mengandung bahan kimia tidak mudah rusak

dilakukan sterilisasi dengan menggunakan aoutoklaf pada temperrtur 121 "C
dengan tekanan anatara 15 - 17,5 psi dengan waktu antara 20 - 25 menit
tergantung dari volume wadah dan media.
Bahan-bahan yang bersifat heat labile dalam bentuk larutan, sterilisasi
dilakukan dengan cara rnenyaring dengan menggunakan filter yang berukuran 0,2
- 0,22 1tM, contoh bahan kimia yang bersifat heat labile arrtara lain GA3, thiamin
HCI dan beberapa antibiotik seperti cqnaftnis ine, carbenocillin.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa sterilan streptomisin 20% dengan
konsentrasi 0,2% dan waktu sterilisasi 90 menit paling efektif mengurangi tingkat
kontaminasi media tanam, dengan tingkat kontaminasi 35%, diikuti karbosulfan
11 g/l, waktu sterilisasi 90 menit (40%) dan propineb 70% waktu sterilisasi 90
menit (45%). Penggunaan karbosulfan 11 g/1 dengan konsentrasi 0,02% dengan
waktu sterilisasi 20 dan 110 menit, serta propineb 70% konsentrasi 0,2% dengan
waktu sterilisasi 100 menit, serta streptomisin 20% waktu sterilisasi 110 menit
tidak efektif menekan tingkat kontaminasi media (Siti Aisyah, dkk; 2011).
 C. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi bahan tanaman (eksplan) merupakan langkah awal yangcukup
penting dan dapat menentukan keberhasilan penanaman secara in vitro. Eksplan
yang akan ditanam pada media tumbuh harus bebas dari mikroorganisme
kontaminan. Tahap sterilisasi sering menjadi kendala utama keberhasilan
perbanyakan tanaman secara in vitro. Terlebih iklim tropis seperti Indonesia yang
memungkinkan kontaminan seperti cendawan dan bakteri terus tumbuh sepanjang
tahun. Untuk tanaman tertentu, sterilisasi sulit dilakukan karena kontaminan
berada pada bagian internal dari jaringan tanaman (Deden dkk, 2003)..
Sterilisasi eksplan biasanya dilakukan dengan cara merendam bahan
tanaman dalam larutan kimia sistemik pada konsentrasi dan waktu perendaman
tertentu, baik dengan menggunakan satu macam maupun dengan macam-macam
sterilan. Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain
alkohol, natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium hipoklorit atau kaporit (CaOCl),
sublimat (HgCl2), dan hidrogen peroksida (H2O2) (Deden dkk, 2003).. Jenis
bahan, konsentrasi, dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bahan tanaman
secara umum disajikan pada Tabel 1.

Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent dan

dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30 menit
juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka terhadap
bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa
kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk sterilisasi eksplan
kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril, misalnya direndam
didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan
dengan perendaman didalam larutan sublimate dan pembilasan dengan air steril.

Contohnya pada sterilisasi biji jeruk, autoklaf pada suhu 121, tekanan
15 psi selama 15-20 menit. Eksplan diperoleh dari biji jeruk keprok/siam. Biji
jeruk yang akan ditanam dalam media dikupas dan disterilkan. Sterilisasi eksplan
dilakukan tiga tahap, yakni: 1) disterilkan dengan alkohol 70% selama 2-3 menit;
2) disterilkan 2 kali dengan 50 : 50 bayclin (sodium hipoklorit 5.25%) + Tween
selama minimal 5 menit; 3) dibilas dengan aquadest steril sebanyak tiga kali.
Setelah sterilisasi, biji jeruk tersebut dikeringanginkan dan ditanam dalam media
(MS atau WPM, sesuai percobaan), yang diberi pemadat bubuk agar 8 g.L-1,
keasaman media sekitar pH 5,7. Dalam penelitian juga dicobakan penambahan
malt extract, BA, maupun amoxycillin untuk menekan kontaminasi. Media
dituang ke dalam botol kultur sebanyak 20 mL dan selanjutnya disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Media dibiarkan
selama 3 hari di rak kultur untuk memastikan ada tidaknya kontaminasi.
Penanaman eksplan dilakukan dalam laminair air flow cabinet yang sudah
disterilkan. Botol yang telah diisi eksplan diletakkan pada rak kultur. Ruang
penanaman dan ruang kultur diupayakan bersuhu sekitar 250C. Lampu fluorescent
biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Parameter yang
diamati meliputi : persentase tumbuh (%), tinggi tanaman, jumlah daun, dan
panjang akar (Teguh Wijayanto, 2011).
Ada tiga kategori strelisasi, yaitu sterilisasi ringan, sedang, dan berat. Pada
sterilisasi ringan, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10
menit, lalu dibilas dengan air steril. Selanjutnya, eksplan direndam dalam cairan
pemutih pakaian 15% selama 10 menit dan dibilas dengan air steril. Terakhir,
eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu
dibilas dengan air steril tiga kali. Untuk sterilisasi sedang, eksplan direndam
dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril. Setelah
itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu
dibilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih
pakaian 10% selama 10 menit, kemudian dibilas dengan air steril tiga kali. Pada
sterilisasi keras, eksplan direndam dalam larutan HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10
menit, lalu dibilas dengan air steril. Selanjutnya, eksplan direndam dalam alkohol
90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam
dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air
steril tiga kali (Siti Aisyah dkk, 2011).
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan
bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi
berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten
dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan sterilisasi dapat dilakukan dengan
berbagai cara yaitu panas, penyaringan, radiasi, dan penambahan bahan kimia.
Sedangkan sterilisasi dengan cara panas dapat dilakukan dengan panas basah,
panas kering, pemanasan bertahap dan perebusan.
 BAB III PENUTUP

A. Kesimpulan
Sebelum melakukan kegiatan kultur jaringan ruangan yang digunakan
harus disterilkan, pensterilannya dengan cara menyinari ruangan dengan sinar UV
saat kita tidak bekerja dalam ruangan, atau kita dapat bekerja dalam laminar air
flow. Setiap alat-alat yang akan digunakan dalam mengkultur perlu disterilisasi,
salah satunya dengan autoklaf, dengan temperatur 121oC, tekanan 15-17 psi
dengan waktu 15-40 menit tergantung banyak alat yang di autoklaf. Untuk
mensterilkan eksplan dapat digunakan bahan pensteril, bahan pensteril yang
umum digunakan adalah calcium hypochlorite , sodium hypochlorite,
sublimat/mercuric chloride (HgCl2), alkohol dsb.

B. Saran
Saran penulis, supaya pembaca dapat lebih teliti lagi dalam melakukan
kultur jaringan, buat semua alat yang digunakan dalam kultur jaringan dalam
kondisi aseptic degan cara mensterilisasinya.
 Daftar Pustaka

Aisyah, Siti dan Surachman, Dedi. 2011. Teknik Sterilisasi Rimpang Jahe sebagai
Bahan Perbanyakan Tanaman Jahe Sehat secara In Vitro. Bulletin Teknik
Pertanian Vol. 16, No.1 Hal: 34-36
Inforedia 2009.www.cara-cara-pembuatan-medium-kultur.html.Diakses pada
tanggal 20 Agustus 2017.
Pali, Elma dkk. 2015. Perkenalan Alat dan Sterilisasi. Jurnal Pratikum
Mikrobiologi Dasar.
Sukmadjaja, Deden dan Mariska, Ika. 2003. Perbanyakan Bibit Jati Melalui
Kultur Jaringan. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi Dan Sumberdaya
Genetik.
Wijayanto, Teguh. 2011. Produksi Bibit Jeruk Keprok (Citrus reticulate) dan
Jeruk Siam (Citrus sinensis) secara In Vitro yang Bebas Penyakit CVPD di
Sulawesi Tenggara. AGRIPLUS, Vol. 21 No. 02