8.

6 Produksi Biofuel
Produk hidrolisis akhir dari dekonstruksi lignoselulosa adalah C5 (pentosa) fermentasi dan gula
C6 (heksosa). Sementara kebanyakan organisme mampu memfermentasi heksosa, hanya
sedikit yang bisa memfermentasi pentosa. Beberapa anaerob Gram-positif termofilik, termasuk
beberapa spesies Thermoanaerobacter, Clostridium, dan Geobacillus, sangat tertarik pada
produksi biofuel generasi kedua karena kemampuan mereka untuk memanfaatkan gula pentosa
dan heksosa, bersamaan dengan polisakarida yang lebih kompleks, dan untuk kemampuan
mereka. untuk mentoleransi pH dan fluktuasi suhu yang luas (Chang dan Yao, 2011; Demain
et al., 2005; Lin et al., 2011; Taylor et al., 2009).

8.6.1 Biobutanol dan Bioetanol

Bioetanol (C2H5OH) merupakan bahan bakar terbarukan yang paling umum digunakan saat
ini, dan penggunaannya dalam transportasi sudah mapan di Amerika Serikat, Brasil, dan
beberapa negara Eropa. Sampai saat ini, bioetanol untuk pasar bahan bakar sebagian besar
dihasilkan dari tebu di Brasil dan gandum di Amerika Serikat, terhitung 89% dari produksi
dunia pada tahun 2009 (Zambare et al., 2011). Ini juga merupakan negara dengan rencana
ekspansi produksi etanol terbesar. Etanol dapat digunakan sebagai campuran dengan bensin
atau alkohol murni di mesin khusus (Hahn-Hgerdal et al., 2006; Nigam and Singh, 2011).
Butanol (C4H9OH) memiliki karakteristik yang mirip dengan bensin, yang membuatnya lebih
mudah berbaur dengan produk hidrokarbon lainnya (Nigam and Singh, 2011). Biobutanol
mengandung 25% lebih banyak energi (per volume) (Barnard et al., 2010) dan kurang stabil
(Cai et al., 2013) dibandingkan bioetanol. Meskipun demikian, biaya produksi biobutanol
menjadikannya pilihan yang tidak tepat sebagai biofuel daripada bioetanol, terutama karena
penghambatan produk selama proses fermentasi (Barnard et al., 2010). Secara tradisional,
organisme mesofilik digunakan untuk produksi bioetanol.

Contohnya termasuk Saccharomyces cerevisiae dan Zymomonas mobilis, yang sebagian besar
menggunakan tebu tebu atau pati enzimatik terhidrolisis sebagai sumber karbon (Barnard et
al., 2010). Enzim utama yang terlibat dalam proses fermentasi adalah piruvat dekarboksilase,
untuk mengubah piruvat menjadi asetaldehid, dan alkohol dehidrogenase, untuk mengubah
asetaldehid menjadi etanol (Barnard et al., 2010). Kelemahan utama dari organisme ini adalah
bahwa mereka tidak dapat memfermentasi pentosa, salah satu produk utama hidrolisis
biomassa hemiselulosa, sehingga mengurangi efisiensi proses fermentasi (Barnard et al., 2010;
Taylor et al., 2009). Oleh karena itu, upaya yang cukup banyak dilakukan untuk
mengembangkan strain mesofilik yang direkayasa (mis., S. cerevisiae, E. coli, dan Z. mobilis)
dengan kemampuan untuk memfermentasi gula heksosa dan pentosa. Jalur homoethanol
direkayasa di E. Coli (piruvat asetilkoA asetaldehida etanol) dengan memanipulasi
ekspresi gen jalur asli, dan jalur fermentasi yang bersaing dieliminasi melalui inaktivasi
kromosom gen yang mengkodekan enzim kunci.

Untuk memfasilitasi pertumbuhan anaerob, kompleks piruvat dehidrogenase diekspresikan

secara anaerob secara anaerob menggunakan promoter asli. Strain yang dikembangkan secara
efisien memfermentasi glukosa dan xilosa menjadi etanol sebagai satu-satunya produk (Zhou
et al., 2008). Strategi serupa untuk thermophiles telah terhambat karena keterbatasan alat
molekuler untuk memperbaiki strain ini. Ekspresi berlebihan enzim heteropolimer piruvat
dekarboksilase (pdc) dan alkohol dehidrogenase pada host selulolitik Enterobacter cloacae JV,
Proteus mirabilis JV dan Erwinia chrysanthemi menunjukkan peningkatan produksi etanol
selulosa (Piriya et al., 2012; Taylor et al., 2009 ; Zhou et al., 2008). Namun, kekurangan gen
pdc termostabil saat ini berarti bahwa rute ini tidak tersedia untuk thermophiles (Talarico et al.,
2005). Kemampuan organisme termofilik tertentu untuk memfermentasi fraksi heksosa dan
pentosa biomassa, serta polikarbonat yang kompleks secara struktural, merupakan keuntungan
penting dari organisme mesofilik (Chang dan Yao, 2011; Maki et al., 2009; Yang et al., 2009b).
Mikroorganisme termofilik yang mampu menghasilkan etanol telah diisolasi dan dicirikan dari
berbagai lingkungan termasuk tanah pertanian, tanaman limbah, tepian sungai, mata air panas,
sedimen, dan limbah kompos (Fong et al., 2006).

Sebagian besar thermofil etanol adalah bakteri Gram positif, memiliki kandungan G + C yang
rendah, sangat anaerob dan sebagian besar berasal dari genus Clostridium (Chang dan Yao,
2011). Namun, thermophiles lainnya termasuk berbagai spesies dari Geobacillus dan
Thermoanaerobacter juga menunjukkan potensi sebagai produsen bioethanol (Taylor et al.,
2012), walaupun produksi hasil etanol rendah telah menjadi masalah utama. Selanjutnya,
semua anaerob saccharolytic thermophilic yang diketahui menghasilkan asam organik seperti
asetat dan laktat (Thompson et al., 2008; van der Veen et al., 2013), yang mengharuskan
terganggunya jalur metabolisme ini untuk menghilangkan produk samping yang tidak
diinginkan (van der Veen et al., 2013). Kelemahan utama lainnya dari banyak etanol etanol
adalah toleransi etanol rendahnya (biasanya <2%) (Georgieva et al., 2007b; Taylor et al., 2009),
dan telah ditunjukkan bahwa toleransi etanol menurun dengan kenaikan suhu (Piriya et al.,
2012).

Hal ini mungkin disebabkan oleh suhu tinggi yang mempengaruhi sifat fisik membran,
sehingga terjadi penurunan organisasi membran dan peningkatan fluiditas membran. Dua
mekanisme penghambatan etanol telah diusulkan; penyumbatan pada glikolisis yang terkait
dengan perubahan organisasi membran dan permeabilitas untuk mengetahui aktivitas enzim
glikolitik, dan pengurangan kolam nukleotida piridin seluler, yang menghambat glikolisis,
aktivitas gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase tertentu (Baskaran et al., 1995; Georgieva et al.,
., 2007a). Juga tampak bahwa kepekaan terhadap pelarut yang berbeda terkait dengan suhu,
karena pada umumnya thermophiles kurang toleran terhadap pelarut seperti etanol atau butanol
daripada mesofil (Timmons et al., 2009). Dua metode sedang dieksplorasi untuk mengatasi
toleransi etanol yang rendah pada organisme termofilik. Yang pertama adalah adaptasi jangka
panjang terhadap konsentrasi etanol yang tinggi sedangkan yang kedua adalah
mengembangkan mutan toleran etanol tinggi (Georgieva et al., 2007b). Namun, beberapa
upaya untuk meningkatkan toleransi pelarut pada mesofil melalui evolusi adaptif menunjukkan
korelasi negatif antara peningkatan toleransi etanol dan produktivitas etanol (Goodarzi et al.,
2010), dan ini mungkin berubah menjadi tidak berbeda pada thermophiles (Brown et al ., 2011).

8.6.1.1 Geobacillus
Genus Geobacillus terdiri dari bakteri gram positif, spora membentuk, aerobik atau fakultatif
anaerob dan bakteri termofilik wajib, dengan rentang pertumbuhan suhu yang lebar (sampai 75
C) dan optimum antara 55 C dan 65 C. Geobacilli memiliki metabolisme
chemoorganotrophic yang menunjukkan fleksibilitas katabolik tinggi (Barnard et al., 2010;
Nazina et al., 2001). Ketersediaan genom lengkap dan sebagian untuk beberapa strain,
termasuk G. kaustophilus, G. thermodenitrificans, dan G. Stearothermophilus (Taylor et al.,
2009), telah memberikan informasi berharga untuk manipulasi genetik strain ini (Couago dan
Shamoo, 2005 ; Cripps et al., 2009). Beberapa karakteristik umum organisme ini membuat
mereka menarik sebagai produsen bioethanol industri potensial. Pertama, mereka dapat
memfermentasi kedua pentosa (D-xylose atau L-arabinose) dan heksosa (misalnya, D-glukosa
dan D-galaktosa) pada suhu tinggi, dan menurunkan karbohidrat yang lebih kompleks lagi
seperti xilan untuk menghasilkan etanol hasil tinggi. Kedua, mereka dapat mentolerir
konsentrasi etanol yang relatif tinggi, misalnya, G. thermoglucosidasius mentolerir hingga 10%
v / v etanol (Fong et al., 2006; Taylor et al., 2012; Verma et al., 2013). G. stearothermophilus
menghasilkan laktat, formate, asetat, dan etanol dari glukosa pada suhu 70 C (Barnard et al.,
2010), dimana laktat sering merupakan produk dominan.

Hal ini telah mendorong berbagai penelitian mutasional yang bertujuan untuk menghilangkan
produksi laktat dan meningkatkan fluks karbon ke produksi etanol (Taylor et al., 2009).
Perkembangan strain awal G. stearothermophilus melalui mutagenesis klasik menghasilkan
mutan defisiensi laktat dehidrogenase yang tidak stabil, sedangkan gen yang menyebabkan
gangguan pada gen ldh menghasilkan mutan delesi stabil (Taylor et al., 2012). Inaktivasi ldh
pada G. thermoglucosidasius menghasilkan pergeseran metabolik terhadap produksi etanol
(Cripps et al., 2009). Strategi lain untuk meningkatkan produksi etanol di Geobacillus spp,
dengan mengalihkan fluks karbon dari jalur asam campuran menuju etanol sebagai produk
akhir utama, telah menghasilkan hasil yang signifikan. Ini melibatkan terganggunya jalur laktat
dehidrogenase dan piruvat formate lyase dan pengaturan-up dari piruvat dehidrogenase (Cripps
et al., 2009). Meskipun tidak ada homolog piruvat dekarboksilase (Pdc) pada organisme ini,
penelitian sebelumnya dengan mutan laktat dehidrogenase Geobacillus memberikan bukti kuat
bahwa piruvat dehidrogenase dapat mengarahkan reduksi karbon dari piruvat menjadi etanol
(Cripps et al., 2009).

Pendekatan lain untuk memperbaiki ethanologenesis pada G. thermoglucosidasius adalah

melalui ekspresi heterolog gen pdc dari Z. mobilis. Protein Pdc berhasil diekspresikan dalam
bentuk aktif dalam mutan G. Thermoglucosidasius L-lactate dehydrogenase pada suhu sampai
52 C. Hal ini menunjukkan kemungkinan untuk menciptakan jalur etanol dalam organisme
ini yang mirip dengan E. coli, di mana gen jalur yang bersaing dilumpuhkan melalui deletion,
dan ekspresi operon piruvat dehidrogenase dicapai sebagai fusi gen transkripsi (Zhou et al.,
2008) . Namun, di atas 54 C protein dilipat menjadi struktur yang tidak aktif dan kemudian
terdegradasi oleh protease. Oleh karena itu, perakitan Pdc yang lebih baik perlu memanfaatkan
sepenuhnya kisaran suhu penuh Geobacillus (Thompson et al., 2008).

8.6.1.2 Thermoanaerobacterium dan thermoanaerobacter

Ini adalah bakteri anaerob termofilik dengan suhu pertumbuhan optimal antara 60 dan 70 C,
walaupun beberapa anggota dapat tumbuh pada suhu sampai 80 C (Mai dan Wiegel, 2000).
Metabolisme fermentasi mereka umumnya melibatkan jalur Embden-Meyerhof, menghasilkan
asam campuran, alkohol dan hidrogen (Taylor et al., 2012). Spesies thermoanaerobacter secara
fisiologis mirip dengan Clostridia termofilik dan pada awalnya diklasifikasikan sebagai
anggota genus Clostridium. Mereka memfermentasi berbagai substrat yang luas (kebanyakan
gula) dan menghasilkan asam laktat dan etanol yang dominan, namun dengan beberapa asetat,
hidrogen dan karbon dioksida (Jessen dan Orlygsson, 2012). Beberapa spesies telah dipelajari
untuk kapasitas produksi etanol dan toleransi etanol, dengan model organisme menjadi
Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel dan Ljungdahl, 1981). T. ethanolicus mampu
memfermentasi D-glukosa, D-xilosa, selulosa dan pati untuk menghasilkan etanol dalam
jumlah tinggi, membuatnya menjadi kandidat yang menarik untuk digunakan dalam produksi
bioetanol (Peng et al., 2008). Keterbatasan utama adalah toleransi rendah terhadap etanol
(<1,5% (v / v)) (Burdette et al., 2002; Peng et al., 2008). Pada T. ethanolicus, produksi etanol
dan toleransi berhubungan erat dengan aktivitas alkohol dehidrogenase.

Dua alkohol dehidrogenase (Adh) telah diidentifikasi dalam organisme ini; Adh primer (adhA)
diperkirakan berfungsi terutama selama konsumsi etanol, dan Adh sekunder (adhB) terlibat
dalam sintesis etanol. Strain mutan yang tidak memiliki Adh primer (DadhA) menunjukkan
peningkatan yang signifikan dalam toleransi etanol (8% [v / v]) pada suhu 60 C) dibandingkan
dengan tipe liar. Strain ini juga mampu meningkatkan persentase asam lemak transmembran
sebagai respons terhadap peningkatan kadar etanol, sehingga mengkonfirmasikan hipotesis
bahwa fungsi Adh utama selama konsumsi etanol. Oleh karena itu, nampaknya layak dilakukan
dengan mengubah komposisi membran sel (meningkatkan asam lemak transmembran) dan
mesin metabolik (mengubah aktivitas Adh dan Ldh primer) memperbaiki fermentasi etanol
termofilik pada tingkat alkohol tinggi dapat dikembangkan (Burdette et al., 2002). Sebuah
aldehid / alkohol dehidrogenase bifungsional baru (AdhE) yang juga tampaknya terlibat dalam
produksi etanol organisme ini, telah dijelaskan (Peng et al., 2008). Thermoanaerobacter
mathranii adalah bakteri xylanolytic, anaerobic dan thermophilic (pertumbuhan optimum
antara 70 dan 75 C) yang menghasilkan etanol dengan menggunakan biomassa lignoselulosa.
Organisme ini dapat mentolerir etanol hingga 4% b / v (Larsen et al., 1997). Beberapa upaya
telah dilakukan untuk memperbaiki toleransi etanol pada organisme ini. Strain BG1L1 (Dldh)
dikultur dalam reaktor immobilisasi kontinu pada suhu 70 C, dengan meningkatnya
konsentrasi produk penghambatan.

Hal ini mengakibatkan toleransi etanol meningkat hingga 8,3%. (Georgieva et al., 2007a; Yao
dan Mikkelsen, 2010). T. mathranii BG1L1 mampu memfermentasi xilosa, menghasilkan
etanol hasil tinggi (0,40-0,42 g / g) (Georgieva et al., 2007a). Baru-baru ini,
Thermoanaerobacter pentosaceus J1, bakteri ketat dan anaerobik yang sangat erat kaitannya
dengan T. mathranii, telah digambarkan sebagai produsen etanol baru. Thermoanaerobacter
strain J1 menunjukkan pemanfaatan substrat yang luas, termasuk pentosa, heksosa, di dan tri-
sakarida dan substrat yang lebih kompleks seperti biomassa lignoselulosa selulosa dan
pretreated, dengan hasil etanol tinggi yang dihasilkan menggunakan glukosa dan xilosa (1,7
dan 1,25 mol / mol ) (Jessen dan Orlygsson, 2012). Produsen etanol lainnya yang terkenal
dalam genus adalah T. thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacterium yonseiensis,
Thermoanaerobacterium brockii dan Thermoanaerobacterium finnii (Fong et al., 2006; Jessen
dan Orlygsson, 2012; Kim et al., 2001). Thermoanaerobacterium saccharolyticum adalah
anaerob thermophilic hemicellulolytic yang menghasilkan etanol dengan menggunakan
heksoses dan pentoses (xylose), serta berbagai asam organik. Jalur fermentasi strain T.
saccharolyticum telah direkayasa untuk menghasilkan mutan dengan produksi etanol yang
lebih baik. Mutan Dldh, yang kekurangan gen L-laktat dehidrogenase (strain TD1), mampu
memanfaatkan xilosa lebih efisien daripada jenis liar, yang mengakibatkan pengurangan kadar
asam laktat ke bawah batas deteksi, peningkatan kadar asam asetat, dan peningkatan hasil
etanol (Desai et al., 2004).

Perkembangan regangan lebih lanjut melalui gen gen yang terlibat dalam pembentukan asam
organik (asetat kinase, laktat dehidrogenase dan asetat fosfat asetat) menghasilkan strain T.
saccharolyticum ALK1 yang mampu menghasilkan etanol sebagai produk organik akhir. Strain
ini selanjutnya dibudidayakan dalam kultur berkelanjutan dengan konsentrasi xilosa pakan
yang semakin tinggi untuk mendapatkan strain ALK2 yang mampu memanfaatkan xylose,
glukosa, mannose dan galactose, dan tetap stabil selama lebih dari 150 generasi, menghasilkan
titer etanol hingga 37 g / L (Shaw et al., 2008). Teknik regangan T. saccharolyticum untuk
menghidrolisis urea menyebabkan peningkatan produksi etanol. Hal ini dilakukan melalui
ekspresi gen urease ureABCDEFG dari C. Thermocellum pada strain baru T. saccharolyticum
(M1051). Peningkatan titer etanol yang diamati, 54 g / L, adalah salah satu yang tertinggi yang
pernah dilaporkan untuk Thermoanaerobacterium dan mungkin karena pengurangan pH,
garam, dan osmolaritas selama fermentasi (Shaw et al., 2012). Baru-baru ini, strain penghasil
etanol baru dari genus ini, Themoanaerobacterium calidifontis, telah dijelaskan (Shang et al.,
2013). T. calidifontis memiliki suhu pertumbuhan optimum antara 50 dan 55 C dan mampu
memfermentasi xilan serta berbagai macam mono dan polisakarida. Produk utama metabolit
fermentasi meliputi laktat, asetat, CO2, H2 dan hasil etanol yang tinggi, namun dengan
toleransi etanol yang relatif rendah (sampai 3%); (Shang et al., 2013).

8.6.1.3 Clostridium
Clostridia termofilik adalah mikroorganisme anaerob yang tumbuh optimal pada suhu sekitar
60-65 C. Mereka telah menarik banyak minat karena kemampuan mereka untuk mengubah
berbagai macam karbohidrat, termasuk selulosa, hemiselulosa, dan pati, hingga produk akhir
yang berharga. Etanol, asam asetat, dan CO2 adalah produk fermentasi utama, walaupun dalam
kondisi pertumbuhan tertentu, asam laktat dan H2 diproduksi (Ellis et al., 2012; Taylor et al.,
2012). Mayoritas clostridia selulolitik, ditandai oleh C. thermocellum, menghidrolisis substrat
ini melalui selulosom, yang berlabuh ke permukaan luar membran sel. Kompleks ini mampu
mengubah selulosa kristal secara langsung menjadi etanol, melalui penggunaan beberapa endo-
-glukanase, exoglucanases, fosforil selobiosa, fosforil selodleksin, dan -glukosidase (Taylor
et al., 2012). Ada dua rintangan utama dalam mengembangkan proses industri untuk produksi
etanol dengan menggunakan organisme ini; pertama, ketidakmampuan C. thermocellum untuk
memfermentasi gula pentosa, dan kedua, penghambatan pertumbuhan sel oleh konsentrasi
etanol yang relatif rendah (serendah 0,5% v / v) (Taylor et al., 2012). Beberapa upaya telah
dilakukan untuk mengembangkan strain Clostridium dengan produksi etanol yang lebih baik
dan toleransi yang tinggi, walaupun agak terhambat oleh kurangnya alat genetik yang sesuai
untuk manipulasi organisme ini (Argyros et al., 2011). Strain dengan ketahanan etanol secara
signifikan lebih tinggi (2,5% v / v dibandingkan dengan 0,5% v / v) diperoleh dengan prosedur
pengayaan (Herrero dan Gomez, 1980). Telah disarankan bahwa peningkatan ini terkait dengan
peningkatan asam lemak normal dan anteiso-bercabang di membran sel (Herrero et al., 1982).

Upaya awal untuk mendapatkan hasil etanol yang lebih tinggi melalui mutagenesis UV
menghasilkan strain mutan termokelamin dengan berat kering yang menghasilkan sekitar 12,5
g / L etanol dibandingkan dengan 5 g / L pada tipe liar. Toleransi etanol meningkat dari <2%
menjadi 4% (Tailliez et al., 1989). Alat genetika, termasuk teknik untuk transformasi elektro
(Tyurin et al., 2004) dan mutasi tanpa tanda, digunakan untuk menghilangkan gen laktat
dehidrogenase (ldh) dan fosfotransasetilase (pta). Hal ini menghasilkan strain mutan yang
stabil yang mampu menghasilkan 4,2 kali lipat dalam produksi etanol dan tidak ada asam asetat
atau asam laktat (Argyros et al., 2011). Baru-baru ini, dua strain rekombinan baru, yang
mengekspresikan gen piruvat kinase dari T. saccharolyticum dalam strain mutan karboksin
kinase fosfoenolpiruvat (YD01) dan pada strain mutan dehidrogenase malate (YD02),
menunjukkan hasil etanol etanol yang lebih tinggi dan 25 kali lipat dan peningkatan toleransi
etanol. kira-kira dua kali lipat dari strain wild type (Deng et al., 2013). Untuk lebih
meningkatkan hasil etanol, ko-kultur C. thermocellum dengan strain thermophilic lainnya,
termasuk C. thermosaccharolyticum, G. stearothermophilus, dan berbagai spesies
Thermoanaerobacterium dan Thermoanaerobacter telah diupayakan (Argyros et al., 2011; He
et al., 2011; ; Svetlitchnyi et al., 2013; Taylor et al., 2009). Ko-kultur strain rekayasa
kekurangan asam organik dari C. thermocellum dengan T. Saccharolyticum menghasilkan
etanol 38,1 g / L dari Avicel, titer etanol tertinggi yang diperoleh untuk ko-culture thermophilic
sampai saat ini (Argyros et al., 2011).
Kami tidak mengetahui adanya Clostridia termofilik yang mampu menghasilkan butanol.
Namun, beberapa strain mesofilik, termasuk Clostridium acetobutylicum (Jang et al., 2013),
Clostridium beijerinckii (Li et al., 2013a), dan Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Del
Cerro et al., 2013) telah terbukti bersifat butanologis. Strain ini menghasilkan butanol melalui
proses yang disebut fermentasi ABE (acetone-butanol-ethanol). Namun, organisme ini tidak
menurunkan selulosa kristal dan diperlukan langkah hidrolisis yang mahal. Kultivasi bersama
dengan strain selulolitik seperti C. Thermocellum dapat menghilangkan langkah hidrolisis
enzimatik yang mahal ini dan oleh karena itu menunjukkan beberapa potensi pengembangan
bioprocessing konsolidasi berbasis biaya (CBP) yang hemat biaya (Nakayama et al., 2011).