Rantai Respirasi dan Fosforilasi Oksidatif

Pendahuluan
Mitokondria dijuluki pusat tenaga sel
karena di dalam organel ini
berlangsung sebagian dari proses
penangkapan energo yg berasal dari
oksidasi repiratorik. Sistem dalam
mitokondria memasangkan respirasi
dengan proses pembentukan
intermediet berenergi tinggi (ATP) yg
dikenal dengan istilah fosforilasi
oksidatif. Fosoforilasi Oksidatif
memungkinkan organisme aerob
menangkap energi bebas dari substrat
respiratorik dalam proporsi yg lebih
besar dibandingkan dengan organisme
anaerob.
Struktur Mitokondria
Mitokondria memiliki membran
eksterna yang bersifat permeable
terhadap sebagian besar metabolit;
membran interna yang
permeabilitasnya selektif serta
tersusun atas lipatan (krista), serta
matrik di dalam membran interna
tersebut.
Proses
Katabolisme suatu zat (glukosa)
akan menghasilkan elektron,
elektron tersebut kemudain akan
ditangkap oleh universal electron
acceptor (NAD+, NADP+, FMN,
FAD+). NADH + H+ yang terbentuk
merupakan senyawa larut air yang
kemudian akan masuk ke
mitokondria untuk memasuki jalur
fosforiasi oksidatif. Komponen
rantai respirasi disusun dengan
potensial reduksi yang meningkat.
Komponen tersebut adalah kompleks I, II, III, IV.
Kompleks I
NADH dehidrogenase mendehidrogensai NADH+H+ sehingga didapatkan 2
elektron. Elektron ini kemudian ditransfer ke koenzim Q dan terbentuklah
ubiquinol (QH2). QH2 merupakan senyawa yang larut lipid sehingga dapat
bergerak dalam membran dalam mitokondria membawa elektron tersebut ke

1
 Di kompleks I juga dihasilkan 4H+ yang dikeluarkan ke spasium intermembran.
Kompleks II
Melibatkan enzim succinate dehidrogenase yang mengubah succinat menjadi
fumarat dan menghasilkan FADH2 yang akan transfer elektronnya ke koenzim Q
untuk mengasilkan QH2. Kompleks II tidak memompa H+ ke spasium
intermembran.
Kompleks III
Terjadi transfer elektron dari QH2 ke sitokrom c yang disertai pemindahan 4H+
menuju spasium intermembran.
Kompleks IV
Terjadi transfer elektron dari sitokrom c ke oksigen dan menghasilkan H2O.
Sebenarnya pada kompleks 4 terbentuk 4H+, tetapi 2H+ digunakan dalam
pembuatan molekul H2O dan hanya 2H+ yang ditanspor keluar ke spasium
intermembran. Adanya transpor H+ menuju spasium intermembran menyebabkan
munculnya proton motive force. Proton motive force disebabkan karena adanya
perbedaan potensial kimia dan potensial elektron antara matrix dan spasium
intermembran.
Kompleks V
Kompleks V melibatkan enzim ATP synthase. ATP synthase terdiri atas 2 domain
yaitu F0 dan F1. Di F1 terjadi reaksi pembentukan ATP dari ADP dan pospat.
Sedangkan F0 merupakan proton pore yang menyebabkan H+ dapat masuk ke
matrix mitokondria dan melepaskan ATP yang terbentuk di permukaan F1. Total
H+ yang ditanspor ke spasium intermembran untuk 1 NADH adalah 10,
sedangkan 1 FADH adalah 6. Untuk membentuk 1 ATP dibutuhkan 3-4 H+. Oleh
karena itu, NADH dapat membentuk 3 ATP dan FADH hanya 2 ATP.

2
Aspek klinis

Contoh kelaianan mitokondria (biasanya disebabkan mutasi gen) :

Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Stroke (MELAS) merupakan
kelainan herediter yang disebabkan oleh NADH : defisiensi ubikuinon oksidoreduktase
(kompleks I) atau defisiensi sitokrom oksidase.
Sindrom Kearns-Sayre (KSS) : delesi, duplikasi gen mitokondria.
Neuropati Optik Heredier Leber (LHON) : mutasi pada titik NADH-ubikuinon reduktase.

Zat pengganggu fosforilasi oksidatif :

3
A. Praktikum
1. Phosphate Estimation
Tujuan : Memperkirakan jumlah fosfat
Prinsip :
Fosforilasi Oksidatif terjadi bila terbentuk gradien proton diluar membran
dalam mitokondria dan membran dalam mitokondria utuh.
Penambahan agen uncoupler akan meningkatkan permeabilitas membran
dalam mitokondria sehingga gradien proton tidak terbentuk.
Fungsi Reagen :
1. Media inkubasi
a. Glukosa, ATP, dan crude hexokinase : mensuplai ADP dan Pi
b. KH3PO4 : buffer
c. EDTA : mengikat logam-logam berat
d. NAD : sumber NAD
e. Bovin serum albumin : menghilangkan agen uncoupler yang mungkin
terakumulasi pada isolat mitokindria
2. Natrium Hidrogen Glutamat : Sumber glutamat yang akan mengubah NAD+
menjadi NADH
3. 2,4 dinitrofenol : agen uncoupler
4. Sukrosa : sumber monosakarida
5. Suspensi mitokondria : sumber mitokondria
6. Trichloro acetic acid (TCA) : mendeproteinasikan campuran
7. Reagen Neumann :
a. HNO3: Mengubah fosfat organik menjadi fosfat inorgaik (Pi)
b. Amonium molibdate : bereaksi dengan Pi membentuk kompleks
berwarna kuning.
Fungsi Perlakuan :
1. Water bath 37oC : menyesuaikan suhu tubuh
2. Sentrifugasi : memisahkan camopuran berdasarkan berat molekul
3. Pemeriksaan pada
t = 0 menit : kontrol warna pada awal reaksi
t = 15 menit : memberikan waktu agar reaksi berjalan
Prosedur
1. Menyiapkan 5 tabung inkubasi : tabung nomer 1 dan 2 dipanaskan dan
tabung 3, 4, dan 5 tidak.
2. Mencampurkan reagen ke tabung 1 dan 2
Reagen Tabung 1 Tabung 2
(ml) (ml)
Media inkubasi 1 1
Na-H-Glutamat 0.2 0.2
2,4-dinitrofenol - 0.1
Air 0.3 0.2

4
 Sukrosa 0.6 0.6
o
Masukan water bath 37 CTambahan
suspensi mitokondria dan hitung sebgai
t=0 menit
Suspensi
0.5 0.5
mitokondria

3. Perlakuaan saat t=0 menit

Memasukan 0,2 ml sample kedalam 2,8 ml TCA, kemudain sentrifugasi dan
ambil supernatan. Mambahkan reagen neumann. Bila mengandung fosfat,
akan timbul endapan dan larutan berwarna kuning jeruk.
4. Perlakuan saat t=15 menit
Sentrifugasi dan menambahkan 0,2 ml supernatan kedalam tabung reaksi
berisi 2,8 ml TCA. Mengecek adanya fosfat dengan mereaksikannya dengan
reagen neumann
Pembahasan
Tabung 1 : Warna larutan pada t=15 menit jernih. Hal ini menunjukan
kadar fosfat rendah. Dengan kata lain, reaksi sintesis ATP berjalan dan
fosfat dalam larutan dipakai dalam proses pembentukan ATP.
Tabung 2 : Warna larutan pada t=15 menit kuning. Hal ini menandakan
jumlah fosfat dalam larutan tinggi dan tidak dipakai untuk pembuatan ATP
(sintesis ATP tidak berjalan)

5
2. Oxygen Uptake
Prinsip :
Pada fosforilasi oksidatif terjadi transpor elektron dan oksigen berperan sebagai
akseptor elektron terakhir. Sianida merupakan inhibitor enzim sitokrom reduktase
di kompleks IV sehingga dapat menghentikan proses transfer elektron. Potensial
reduksi methylene blue setara dengan ubiquinon sehingga dapat berkompetisi
menerima reducing equivalent.
Fungsi Reagen :
Methylene blue (MB) : indikator warna (MB: biru tua, MB tereduksi :tidak
berwarna) dan berkompetisi dengan ubiqinon dalam menerima reducing
equivalent.
KCN : donor CN- , menginhibisi enzim sitokrom oksidase di kompleks IV
Parafin cari : mencegah keluar-masuknyanya oksigen
Fungsi Perlakukan:
Inkubasi dalam water bath 370C: memberikan suasana sesuai keadaan fisiologis
tubuh manusia.
Prosedur
1. Menyiapkan reagen yang diperlukan
Reagen Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5
Medium inkubasi 1 1 1
NA-H-Glutamat 0.2 0.2 0.2
2,4 dinitrofenol - 0.1 -
Methylene blue 0.2 0.2 0.2
(MB)
KCN 0.1 - -
Air - - 0.1
Sukrosa 0.6 0.6 0.6
Suspensi 0.5 0.5 0.5
mitokondria
2. Menambahkan parafin 2 ml ke tabung 3,4, dan 5.
3. Menginkubasi pada 37oC, amati perubahan warna.
4. Menginterpretasikan hasil
Hasil dan Pembahasan
Tabung 3
Setelah 15 menit warna larutan jernih. Penambahan KCN menyebabkan
terganggunya kompleks IV sehingga proses pembentukan H2O tidak terjadi dan
Methelene Blue tetap dalam kedaan tereduksi (MBH2) yang tidak berwarna.
Tabung 4
Setelah 15 menit larutan berwarna biru kehijauan. 2,4 dinitrofenol meningkatkan
permeabilitas membran terhadap H+, tetapi tidak mengganggu kompleks protein
yang lain, utamanya kompleks IV. Kerja O2 sebagai akseptor elektron terakhir di
kompleks IV tidak terganggu. MBH2 memberikan elektronnya untuk reaksi
pemebntukan H2O dan kembali menjadi MB yang berwarna biru.

6
 Tabung 5
Warna larutan biru muda. Tidak terjadi gangguan proses fosforilasi iksidatif pada
tabung ini, hanya saja karena adanya penambahan air, methelene blue yang
berwarna biru terencerkan sehingga warna akhir larutan adalah biru muda.