Laporan Praktikum Farmakokinetika

Analisis Obat dalam Darah

Disusun oleh:
Kelompok 1 Siang
Ayu Intansari R. Putri 1206225201
Binerta Bai Agfa 1206222805
Fikry Dwi Anjani 1206211083
Rosita Kurniawan 1206260053
Sarah 1206228670
Tahmida Diazputri Utami 1206230422

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2014
I. TUJUAN
a Mahasiswa diharapkan mampu menganalisis obat dalam darah secara in vitro.
b Mahasiswa diharapkan mampu menggunakan data yang diperoleh untuk
mendapatkan persamaan farmakokinetiknya.

II. PRINSIP KERJA

Darah dipisahkan dari proteinnya dengan menggunakan TCA. Plasma darah
diasamkan dengan HCl dan ditambahkan Natrium Nitrit. Lalu diberikan asam sulfamat
dan terakhir larutan NaOH. Senyawa diazo yang terbentuk diukur dengan
spektrofotometer. Data yang diperoleh digunakan untuk menyusun persamaan
farmakokinetika dan memprediksi cara pemberian tersebut.

III. TEORI DASAR

Untuk memberikan efek biologis, obat dalam bentuk aktifnya harus berinteraksi
dengan reseptor, tempat aksi atau sel target dengan kadar yang cukup tinggi. Sebelum
mencapai reseptor, obat terlebih dahulu harus melalui proses farmakokinetik. Fasa
farmakokinetik meliputi proses fasa II dan fasa III. Fasa II adalah proses absorbsi
molekul obat yang menghasilkan ketersediaan biologis obat, yaitu senyawa aktif dalam
cairan darah yang akan didistribusikan ke jaringan atau organ tubuh. Fasa III adalah fasa
yang melibatkan proses distribusi, metabolism dan ekskresi obat, yang menentukan
kadar senyawa aktif pada kompartemen tempat reseptor berada.
Faktor-faktor penentu dalam proses farmakokinetik adalah:
1. Sistem kompartemen dalam cairan tubuh, seperti: cairan intrasel, eksternal
(plasma darah, cairan interstisial, cairan cerebrospinal) dan berbagai fasa lipofil
dalam tubuh.
2. Protein plasma, protein jaringan dan berbagai senyawa biologis yang mungkin
dapat mengikat obat.
3. Distribusi obat dalam berbagai sistem kompartemen biologis, terutama
hubungan waktu dan kadar obat dalam berbagai sistem tersebut, yang sangat
menentukan kinetika obat.
 4. Dosis sediaan obat, transport antar kompartemen seperti proses absorbs,
bioaktivasi, biodegradasi dan ekskresi yang menentukan lama obat dalam tubuh
(Siswandono, 1998)
Konsentrasi obat adalah elemen penting untuk menentukan farmakokinetik suatu
individu maupun populasi, konsentrasi obat diukur dalam sampel biologi seperti air
susu, saliva, plasma dan urin. Sensitivitas, akurasi, dan presisi dari metode analisis
harus ada untuk pengukuran Secara langsung obat dalam matriks biologis. Untuk itu
metode penetapan kadar Secara umum perlu divalidasi sehingga informaasi yang akurat
didapatkan untuk monitoring farmakokinetik dan klinik (Shargel, 1999).
Pengukuran konsentrasi obat di darah, serum atau plasma adalah pendekatan
secara langsung yang paling baik untuk menilai farmakokinetik obat tubuh. Darah
mengandung elemen seluler mencakup sel darah merah, sel darah putih, keeping darah
dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum atau plasma digunakan
untuk pengukuran obat. Untukmendapatkan serum, darah dibekukan dan serum diambil
dari supernatant setelah disentrifugasi. Plasma diperoleh dari supernatant darah yang
disentrifugasi dengan ditambahkan heparin. Oleh karena ituserum dan plasma tidak
sama. Plasma mengalir keseluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen seluler darah.
Dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium dengan
jaringan, perubahan konsentrasi obat akan merefleksikan perubahan konsentrasi obat di
jaringan (Shergel, 1999).
Dalam sebuah analisis obat dalam cairan hayati, ada hal-hal penting dalam
farmakokinetik yang digunakan sebagai parameter-parameter, antara lain yaitu:
1. Tetapan laju invasi atau tetapan absorpsi.
2. Volume distribusi menghubungkan jumlah obat di dalam tubuh dengan
konsentrasi obat (C) di dalam darah atau plasma.
3. Ikatan protein.
4. Laju eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t ½ ).
5. Bersihan (Clearance) renal, ekstrarenal dan total.
6. Luas di bawah kurva dalam plasma (AUC), dan
7. Ketersediaan hayati.
IV. ALAT DAN BAHAN
A. ALAT B. BAHAN
1. Alat Sentrifugasi 1. Asam triklorasetat (TCA) 50%
2. Vortex 2. Natrium nitrit 10% (dibuat
3. Stopwatch baru)
4. Spektrofotometer UV-Vis 3. Asam sulfamat 15%
5. Tabung reaksi 4. Asam klorida 6 N
6. Pipet volume 5. Sampel darah
7. Pipet ukur 6. Antikoagulan
8. Labu takar 10,0 ml 7. Parasetamol baku
9. Balon karet 8. NaOH 10%

V. PROSEDUR KERJA
a. Prosedur Penetapan Kadar
1. Sampel darah diambil sebanyak 2,0 ml pada jam ke 0,25; 0,5; 1,0; 2,0;
4,0; 6,0; 9,0; dan 12,0.
2. Dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge darah, lalu ditambahkan 2,0
ml TCA 50% kemudian di sentrifuge selama 7 menit dengan kecepatan
4000 rpm.
3. Dipipet 1,0 ml bagian supernatan yang jernih, lalu dimasukkan ke
dalam tabung reaksi lain. Ditambahkan 0,5 ml HCl 6N serta 1,0 ml
NaNO2 10%. Diamkan selama 5 menit.
4. Ditambahkan dengan hati-hati larutan asam sulfamat 15% sebanyak
1,0 ml, kemudian ditambahkan larutan NaOH 10% sebanyak 2,5 ml.
Didiamkan selama 3 menit di dalam beaker berisi es.
5. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada λ maksimum 435 nm.

b. Uji Perolehan Kembali

Buat campuran plasma dengan larutan baku parasetamol sehingga
diperoleh kadar parasetamol dengan konsentrasi 10,052 ppm, 100,52 ppm,
dan 502,6 ppm. Tetapkan kadar masing-masing sampel terhadap baku
 parasetamol, nilai UPK, serta kesalahan sistematik untuk tiap besaran
kadar.

VI. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

A. Data Kurva Kalibrasi

Tabel 1. Data kurva kalibrasi pada λmax 435 nm

Konsentrasi (ppm) Serapan (A)

100 0,233
200 0,312
300 0,488
400 0,522
500 0,613
600 0,718

Kurva Kalibrasi pada max 436 nm

0.6
0.554
0.5

0.4
Serapan (A)

0.39

0.3 0.294

0.2
0.15
0.1 0.123

0
0 200 400 600 800 1000 1200
Konsentrasi (ppm)

Gambar 1. Kurva kalibrasi sampel darah pada max 436 nm

Dengan data tersebut didapatkan:
a = 0, b = x 10-4 r = 0,
Persamaan linear kurva kalibrasi:
y = a + bx
y=+x
Keterangan :
a = intersep b = slope x = konsentrasi (ppm) y = serapan (A)

B. Data Serapan Sampel

Tabel 2. Data serapan sampel pada λmax 435 nm
Jam ke- Serapan (A) Cp (ppm) Cp’ (ppm) Cp - Cp’ (ppm)
0,25 1,452 1360 1175 185
0,50 1,300 1202 1145 57
1,0 1,281 1182 1095 87
2,0 0,964 852 - -
4,0 0,925 812 - -
6,0 0,765 645 - -
9,0 0,715 593 - -
12,0 0,494 363 - -

Perhitungan Analisis
Kurva hubungan antara konsentrasi obat dalam plasma terhadap waktu dapat
dilihat pada lampiran (kertas semilog). Dari hasil ektrapolasi, didapatkan:
A = 1192 µg/ml B = 240 µg/ml
Kdistribusi = a Keliminasi = b

 Konstanta Eliminasi
b = ln C1 - ln C2
t2 - t1
= ln 645 – ln 363
12 - 9
b = 0,1916 jam -1
 Konstanta Distribusi
a = ln C1 - ln C2
t2 – t1
= ln 1360 - ln 1182
1 – 0,25
a = 0,1870 jam -1

 Waktu Paruh
t ½ = 0,693 = 0,693 = 3,6169 jam.
b 0,1916

 Persamaan Farmakokinetik
Cp = A e-at + B e-bt
Cp = e-0,1870t + e -0,1916t
Cp = e-0,1870x3,6169+ e -0,1916x3,6169
= µg/ml

 AUC (Area Under Curve)

AUC = A + B = 1192 + 240 = 7626,9412 µg.jam/ml
a b 0,1870 0,1916

 Volume Distribusi
Diketahui dosis tunggal 500 mg

 VdArea = Db0 = 500000 µg = 405,1747 ml

AUC.b 6440,6867 µg.jam/ml x 0,1916 /jam

 Vd Ekstrapolasi = Db0 = 500000 µg = 2083,3333 ml

B 240 µg/ml
 Klirens
Cl = b x Vd area
= 0,1916 jam x 405,1747 ml
= 77,6315 ml/jam
Perhitungan UPK (Uji Perolehan Kembali)
Tabel 4. Hasil Perhitungan UPK dan Kesalahan Sistematik
Konsentrasi Serapan (A) Kadar UPK (%) Kesalahan
terukur sistematik
(ppm)
(ppm) (%)
250 1,004 89.446,89 6,32 93,68

500 1,050 94.235,71 12,78 87,22

1000 1,327 123.072,76 29,87 70,13

Perolehan Kembali = x 100% = R%

Kesalahan sistematik = 100% - R%

 Konsentrasi 10 ppm = 0,137 - 0,0606 = 158,83 ppm

4,81 . 10-4

UPK = x 100%

= 10,052 x 100% = 6,32%

158,83
Kesalahan sistematik = 100% - 6,32% = 93,68%

 Konsentrasi 100 ppm = 0,439 – 0,0606 = 786,89 ppm

4,81 . 10-4

UPK = 100,52 x 100% = 12,78%

786,69
Kesalahan sistematik = 100% - 12,78% = 87,22%

 Konsentrasi 500 ppm = 0,870 – 0,0606 = 1682,74 ppm

4,81 . 10-4

UPK = 502,6 x 100% = 29,87%

1682,74
Kesalahan sistematik = 100% - 29,87% =70,13%
VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini praktikan melakukan percobaan mengenai analisa
obat dalam darah. Tujuan dari praktikum ini adalah menetapkan kadar
parasetamol dalam darah yang terdapat sejumlah parasetamol yang dibuat dalam
konsentrasi tertentu, dan disiapkan dalam waktu sekitar 12 jam. Sampel darah
yang di ukur ada 7 buah yaitu untuk analisa pada jam ke 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0;
6,0; 9,0 dan 12,0.
Obat yang akan dianalisa adalah parasetamol. Prinsip yang digunakan dalam
menetapkan kadar parasetamol dalam darah yaitu pembentukan garam diazonium
dari gugus amin aromatis sekunder yang terdapat pada parasetamol. Pembentukan
garam diazonium dilakukan dengan terlebih dulu gugus amin sekunder ini
dihidrolisis menjadi amin aromatis primer. Pembentukan garam diazonium terjadi
apabila suhu percobaan, baik itu suhu sampel dan reagen, berkisar antara 5-15°C.
Pada percobaan kali ini dibutuhkan reagen berupa TCA, HCl, NaNO2, Asam
Sulfamat, dan NaOH. Sampel darah harus dipisahkan terlebih dahulu dari protein-
protein darah dengan menggunakan TCA. TCA berfungsi untuk mengendapkan
protein darah sehingga didapatkan cairan jernih/supernatan yang digunakan untuk
proses selanjutnya. Supernatan yang diperoleh, ditambahkan HCl untuk
menghidrolisis gugus amin sekunder menjadi amin aromatis primer pada
parasetamol. Gugus tersebut akan bereaksi dengan NaNO2 membentuk garam
diazonium. Penambahan asam sulfamat pada reaksi selanjutnya akan membentuk
banyak busa. Asam sulfamat ini berguna untuk memberikan suasana asam kuat
pada reaksi diazotasi sehingga garam diazonium bisa terbentuk sempurna.
Penambahan NaOH 10% bertujuan untuk menetralkan asam. Berdasarkan
perhitungan analisis dan grafik yang diperoleh, menunjukkan kadar parasetamol
yang semakin menurun membentuk garis yang tidak linear sehingga dapat
disimpulkan bahwa pemberian obat ini adalah secara intravena bolus (dua
kompartemen). Dari grafik inilah dapat ditentukan nilai Vd, Cp, ke, kd, t1/2, AUC
dan Cl.
 Selain menetapkan kadar parasetamol dalam darah, praktikan juga
melakukan uji perolehan kembali (UPK) dan menghitung nilai kesalahan
sistematik dengan konsentrasi 10,052 ppm; 100,52 ppm; dan 502,6 ppm. Nilai
UPK dan kesalahan sistematik yang kami dapatkan menunjukkan nilai kesalahan
sistematik yang begitu besar. Kesalahan ini kemungkinan disebabkan oleh
beberapa hal yaitu:

1. Kurang hati-hatinya praktikan dalam menambahkan reagen.

2. Kesalahan dalam prosedur pembacaan spektrometer Uv vis dimana masih
terdapatnya gelembung udara di dalam larutan supernatan.
3. Kurang jernihnya cairan supernatan yang dipipet, yang dapat mengganggu
pengukuran absorbansi.
4. Suhu yang kurang optimal untuk pembentukan garam diazonium.
VII. KESIMPULAN
a. ke = 0,0345 jam -1
b. kd = 0,9511 jam -1
c. A = 1610 µg/ml
d. B = 720 µg/ml
e. Cp = 360,139 µg/ml
f. t ½ = 20,08 jam.
g. Vd area = 642,342 ml
h. Vd ekstrapolasi = 694,44 ml
i. AUC = 22562,342 µg.jam/ml
j. Cl = 22,161 ml/jam

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Mansur, Umar., dkk. 2011. Penuntun Praktikum Farmakokinetika. Depok:
Universitas Indonesia.
Shargel, Leon, et. al. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan,
edisi kedua. Surabaya: Aquadestlangga University Press.
IX. LAMPIRAN