BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

1. Alat dan Bahan

1.1 Alat
 beakerglass
 bunsen dan kaki tiga
 corong gelas
 cawan penguap
 mortir
 spatula
 batang pengaduk
 labu ukur
 corong pisah
 pelat KLT
 chamber glass
 botol/vial kaca
 kolom kromatografi
 spektrofotometri UV Visible
 spektrofotometri Infra merah
 drigen
1.2 Bahan
 simplisia herba sereh
 aquadest
 N-heksana
 silika gel
 etilasetat
 etanol
 reagen NaOH 2M
 reagen AlCl3 5%
 serbuk NaOAc
  serbuk H3BO3
2. Prosedur
2.1 Preparasi sampel
a. persiapan sampel herba sereh yang telah mengalami proses pengeringan
hingga menjadi bentuk simplisa kering.
2.2 Penafisan fitokimia
a. Identifikasi Alkaloid
Sebanyak 1 gram serbuk dibasakan dalam 5ml amonia 30%. dikocok kuat
kemudian ditambahkan kloroform 20 mldan dikocok kuat kembali. (larutan A).
setengah larutan A tersebut diekstraksi dengan 10 ml HCl (1:10), sehingga
diperoleh larutan B. larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi , ditambahkan
masing-masing pereaksi Dragendorff dan Mayer. bila terbentuk endapan
merah bata dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi
Mayer menunjukkan adanya senyawa alkaloid. (Farnsworth, 1996).
b. Identifikasi Flavonoid
sebanyak 0,5 gram ektrak dilarutkan dengan 2 ml etanol 70% dan
ditambahkan 3 tetes larutan NaOH. terjadinya perubahan intensitas warna
pada penambahan H2SO4 mengindikasikan adanya senyawa flavonoid
(Tiwari, et al, 2011).
c. Identifikasi Steroid dan Triterpenoid
sebanyak 1 gra ekstrak kental dimasukkan dengan 20 ml eter selama 2 jam
dalam wadah tertutup rapat. Disaring dan diambil filtratnya. kemudian 5 ml
dari filtrat diuapkan di dalam cawan penguap sehingga diperoleh residu atau
sisa. kedalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 2 tetes
H2SO4 pekat. terbentuknya warna hijau atau merah menunjukkan adanya
golomgan senyawa steroid dan triterpenoid (Fransworth, 1996).
d. Identifikasi Saponin
sebanyak 0,5 gram ekstrak kental ditambahkan 2 ml aquadestilata, kemudian
dikocok selama 10 detik. hasil positif ditunnjukkan dengan terbentuknya buih
yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit (Tiwari, et al, 2011).
e. Identifikasi Tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak kental diekstraksi dengan etanol, diuapkan sampai
kering diatas penangas air. setelah kering dilarutkan dengan 20 ml air panas
dan didinginkan. ditambahkan 10 tetes NaCl 10% dan disaring. larutan yang
 diperoleh merupakan larutan percobaan. pada larutan percobaan ditambahkan
3 tetes FeCl3 1%. bila terjadi perubahan warna biru hitam atau hijau cokelat
menunjukkan adanya senyawa golongan tanin (Fransworth, 1996).
2.3 Ekstraksi dengan Metode Refluks (Etanol (1:5))
a. dibilas labu destilasi yang akan digunakan dengan menggunakan etanol,
lalu dimasukkan batu didih.
b. dimasukkan sejumlah sampel yang telah dihaluskan lalu dimasukkan
kedalam labu destilasi.
c. ditambhkan pelarut, dibandingkan antara simplisia dengan pelarut yaitu
maksimal 1:5.
d. dididihkan campuran menggunakan pemanas selama lebuh kurang 3 jam
kemudian didinginkan.
e. disaring filtrat menggunakan kertas saring, disimpan dalam wadah
penampung.
f. diuapkan filtrat sehingga didapatkan ekstrak kental.
3. Ekstraksi Cair-cair
a. diperoleh 5 gram ekstrak kental dari hasil ekstraksi dilarutkan dalam 100
ml etanol.
b. dimasukkan dalam corong pisah dan ditambahkan n-heksan dengan jumlah
yang sama banyak dengan jumlah yang sama banyak.
c. dikocok dan sesekali udara didalam corong pisah dikeluarkan.
d. didiamkan didalam corong pisah hingga kedua pelarut terpisah sempurna.
e. pemisahan diulang hingga diperoleh fraksi n-heksan yang hampir tidak
berwarna , minimal 3 kali.
f. fraksi n-heksan dan fraksi air dipisahkan. fraksi n-heksan dikumpulkan,
diuapkan dan dipekatkan hingga diperoleh fraksi kental n-heksan.
g. pemisahan fraksi air dilanjutkan fraksi etilasetat dengan prosedur yang
sama dengan pemisahan pada fraksi n-heksan.
h. dihitung rendemen masing-masing fraksi.
4. Kromatografi Lapis Tipis
a. disiapkan chamber dan campuran pelarut n-heksan dan etilasetat (6:4)
yang digunakan sebagai fase gerak.
b. dimasukkan 10 ml campuran pelarut kedalam chamber.
c. dibiarkan selama 1-2 jam ebagai proses penjenuhan.
 d. ekstrak yang aka dipisahkan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai.
e. ditotolkan beberapa bercak pada lapisan pelat silika menggunakan pipa
kapiler kaca.
f. dibiarkan pelarut pada bercak menguap.
g. dimasukkan pelat kedalam chamber berisi pelarut yang telah dijenuhkan
sebelumnya.
h. dibiarkan proses elusi berlangsung hingga batas atas lapisan.
i. diangkat pelat setelah proses elusi mencapai batas atas dan dibiarkan
mengering.
j. dihitung Nilai Rf pada lapisan secara visual UV 254nm, UV 365nm dan
penampak bercak.

5. Kromatografi Kolom
a. ditimbang silika gel 60 dengan pembanding 1:10 dengan sampel.
b. kolom kromatografi dikemas dengan cara basah dengan
mensuspensikan silika dengan pelarut non-polar.
c. dimasukkan suspensi silika kedalam kolom yang bagian bawahnya
terlebih dahulu disumbat menggunakan kapas.
d. perhatikan dan dijaga kebersamaaan silika disemua tempat dalam
kolom, karena adanya rongga-rongga udara akan berpengaruh pada
buruk pada pemisahan.
e. pelarut dibiarkan kaluar hingga permukaanya tepat pada permukaan
silika dan dilapisi permukaan dengan kertas saring.
f. ekstrak yang dipisahkan ditempatkan diatas silika dalam bentuk lapisan
tipisyang rata diatas permukaan.
g. kolom dielusi dengan eluen yang cocok. dimulai dari eluen dengan
kepolaran yang rendah kemudian kepolaran ditingkatkan perlahan-
lahan.
h. hasil kolom dikumpulkan per sub-fraksinya dan dianalisis
menggunakan silika gel.
6. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
a. dibersihkan plat kaca dengan aseton dan ditempatkan pada alat desaga.
 b. dibuat bubur silika gel dengan cara mencampurka silika gel 60 sebanyak
20 gram dengan 50 ml aquadest, dikocok kuat-kuat dalam erlenmayer
berpenutup selama 90 detik hingga homogen.
c. dituang semua bubur silika kedalam alat, kemudian segera diratakan pada
kaca.
d. didiamkan silika pada suhu ruang selama 24 jam.
e. sebelum pemakaian, pelat di oven pada suhu 106 derajat celcius selama
30-60 menit.
f. disiapkan chamber dan campuran pelarut n-heksan dan etilasetat (6:4)
yang digunakan sebagai fase gerak.
g. dimasukkan 20-30 ml campuran pelarut kedalam chamber.
h. dibiarkan selama 60 menit sebagai proses penjenuhan.
i. sejumlah fraksi dilarutkan dalam pelarut yang cocok dan ditotolkan sampel
secara berderet sehingga membentuk pita sebagai garis awal
pemgembangan.
j. ditunggu kering beberapa saat.
k. dimasukkan pelat kedalam chamber yang telah jenuh dengan larutan
pengembang.
l. dibiarkan hingga proses elusi mencapai batas atas pelat.
m. dikeluarkan dari chamber dan dibiarkan mengering.
n. dikerok pita yang terbentuk dan hasil kerokan dilarutkan dengan pelarut
yang cocok atau eluen yang digunakan.
o. disaring, filtrat diuapkan dan dianalisis menggunakan pelat silika GF254.
7. Metode identifikasi Spektrofotometri UV Visible
a. sampel dilarutkan dalam pelarut etanol yang tidak memberikan serapan
pada UV-Vis.
b. dilakukan uji blangko pada spektrofotometri Uv- visdengan 2 kuvet berisi
etanol, diamati pada panjang gelombang 200-600nm
c. lalu kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan sampel yang telah dilarutkan.
kuvet tersebut diisikan sampel tidak melewati tanda batas da bagian luar
kuvet harus dalam keadaan bersih dan kering.
d. dimasukkan kuvet dalam spektrofotometri UV vis, diukur panjang
gelombang serapan maksimumnya. direkam dan dicatat hasilnya.
e. kemudian sampel dibagi menjdi 3 bagian :
  bagian 1, sampel ditambahkan 3 tetes NaOH 2 M kemudian
dikocok hingga homogen dan diamati hasilnya.
 bagian 2, sampel ditambahkan 6 tetes reagen AlCl3 5 % dalam
metanol kemudian dicampur hingga homogen dan diamatai
hasilnya.
 bagian 3, sampel ditambahkan serbuk NaOac ebanyak 250 mg,
dicampurkan lalu dikocok hingga homogen dan diamati
spektrumnya. selanjutnya ditambahkan serbuk H3B03 sebanyak
159 mg dikocock hingga homogen dan diamati spektrumnya.

8. Metode Identifikasi Spektrofotometri Infra Merah

a. sampel yang telah berbentuk cair dengan pelarut etanol diletakan
diantara 2 lempeng NaCl dengan konsentrasi 1-5 %.
b. lalu diletakkan dalam kisi pelat KBr, sampel dicampur dengan KBr
dalam konsentrasi sampel 0,1-2 % berat campuran. kemudian digerus
dalam mortir dan di press sehingga tidak ada udara yang terjebak pada
campuran.
c. diamatai spektrum yang terbentuk, dicatat hasilnya.