TUGAS : BIOFARMASETIKA

DOSEN : Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt.

BIOAVAILABILITY, BIODISTRIBUTION, AND CNS

TOXICITY OF CLINICAL-GRADE PARVOVIRUS H1 AFTER
INTRAVENOUS AND INTRACEREBRAL INJECTION IN
RATS

OLEH

MASYUDI ZULKIFLI IMANSYAH

N012181010

PROGRAM PASCASARJANA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR
2019
 Kata Pengantar

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha

Panyayang, Kami panjatkan puja dan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah

melimpahkan rahmat, hidayah, dan inayah-Nya kepada kami, sehingga kami dapat

menyelesaikan makalah Biofarmasetika dengan judul Bioavailability,

Biodistribution, And Cns Toxicity Of Clinical-Grade Parvovirus H1 After

Intravenous And Intracerebral Injection In Rats

Terlepas dari semua itu, Kami menyadari sepenuhnya bahwa masih ada

kekurangan baik dari segi susunan kalimat maupun tata bahasanya. Oleh karena

itu dengan tangan terbuka kami menerima segala saran dan kritik dari pembaca

agar kami dapat memperbaiki makalah ilmiah ini.

Akhir kata kami berharap semoga makalah ini dapat memberikan manfaat

maupun inpirasi terhadap pembaca.

Makassar, April 2019

Penulis

ii
 Daftar Isi

Kata Pengantar ............................................................................................................... ii

Daftar Isi .......................................................................................................................... iii
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................................ 1
A. Latar Belakang ............................................................................................... 1
B. Rumusan Masalah ......................................................................................... 3
C. Tujuan ............................................................................................................. 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..................................................................................... 4
A. Pengertian HPV .............................................................................................. 4
B. Klasifikasi ........................................................................................................ 4
C. Morfologi ......................................................................................................... 4
D. Penyakit Yang Ditimbulkan .......................................................................... 7
E. Rute-rute Injeksi ............................................................................................. 8
F. Keuntungan Injeksi ........................................................................................ 11
G. Kekurangan Injeksi ........................................................................................ 13
H. Syarat-syarat Injeksi ...................................................................................... 14
BAB III METODE KERJA............................................................................................ 15
A. Bahan ............................................................................................................... 15
B. Metode ............................................................................................................. 15
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 25
A. Hasil ................................................................................................................. 25
B. Pembahasan .................................................................................................... 33
BAB V PENUTUP ........................................................................................................... 39
A. Kesimpulan ..................................................................................................... 39
B. Saran ................................................................................................................ 39
Daftar Pustaka ................................................................................................................. 40

iii
 BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Parvovirus H1 (H1PV) adalah virus DNA single-stranded single-stranded

dari 5,1 kb milik keluarga Parvoviridae. Tuan rumah alami adalah tikus tetapi,

mirip dengan parvovirus terkait lainnya, H1PV dapat menginfeksi dan mereplikasi

dalam sel dari berbagai spesies lain, termasuk manusia.24 Namun, penyaringan

sistematis spesies yang rentan terhadap infeksi H1PV belum dilakukan. host

alami, H1PV hanya patogen pada bayi baru lahir dan bersifat embriotoksik. Efek

merugikan pada keturunan tergantung pada usia saat infeksi: sedangkan tikus

diinokulasi dengan H1PV selama periode preimplantasi ovular tidak

mengungkapkan adanya gangguan reproduksi, infeksi bendungan di tengah

periode kehamilan biasanya mengakibatkan kematian janin. Ketika terinfeksi

selama kehamilan terlambat atau dalam beberapa hari pertama setelah kelahiran,

keturunannya sering mengembangkan apa yang disebut 'sindrom osteolitik,' yang

ditandai oleh dwarfisme dan berbagai fitur seperti mongoloid.

Karena H1PV mudah ditransmisikan dalam populasi hewan pengerat

dengan tidak adanya kekebalan alami, hewan laboratorium secara rutin diuji untuk

keberadaan antibodi anti H1PV. Antibodi terhadap H1PV ditemukan pada 10,4%

tikus yang ditangkap dari populasi liar.8 Sepengetahuan kami, saat ini tidak ada

informasi terperinci tentang bioavailabilitas dan distribusi jaringan H1PV setelah

1
infeksi alami atau eksperimental in vivo, meskipun rute ekskresi virus diketahui.

untuk mengikuti rute fecal dan oronasal.18

Selain menjadi virus yang terjadi secara alami pada populasi hewan

pengerat, H1PV memiliki sifat onkosupresif, menghambat pembentukan tumor

yang diinduksi secara spontan maupun secara kimiawi pada hewan

percobaan.6,25,26 Investigasi terbaru menunjukkan potensi oncolytic langsung

dari virus dalam sejumlah kanker.1, 2, 2, 2, 22 infeksi H1PV dari kultur sel tumor,

termasuk sel tumor manusia, dan tumor eksperimental in vivo menyebabkan

pembunuhan sel yang efisien dan regresi tumor.14 Sitotoksisitas parvoviral

dikaitkan, setidaknya sebagian, pada NS1 protein pengatur viral, dan NS2 protein

nonstruktural yang lebih kecil dapat memodulasi sitotoksisitas NS1. Satu entitas

tumor yang menjanjikan di mana H1PV menunjukkan efek oncolytic yang kuat

adalah tumor otak ganas (khususnya, glioblastoma) .13 Tingkat dorongan remisi

lengkap setelah injeksi H1PV intratumoral atau intravena tikus yang membawa

glioma intrakranial besar memberikan alasan untuk percobaan klinis pada pasien

dengan glioblastoma berulang.

Untuk penggunaan klinis, stok virus H1 yang sesuai dengan standar Good

Manufacturing Practice (GMP) harus tersedia. Untuk memenuhi persyaratan

GMP, kemurnian, infektivitas, dan stabilitas persiapan virus harus ditunjukkan

oleh produsen. Selain itu, sebelum injeksi pada pasien, persiapan virus GMP ini

harus menjalani pengujian keamanan nonklinis yang ekstensif. Untuk mendukung

protokol klinis fase I, yang mencakup infus intravena serta injeksi langsung H1PV

ke dalam tumor otak, kedua rute pemberian dimasukkan dalam protokol uji.

2
Karena permisif untuk infeksi dan replikasi H1PV, tikus didefinisikan sebagai

spesies yang sesuai dan cukup untuk menyelidiki profil toksisitas potensial dari

H1PV. Pemilihan spesies ini telah disetujui oleh otoritas pengawas (Paul-Ehrlich

Institut, Langen, Jerman).

B. RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimana Bioavailabilitas clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal ?

2. Bagaimana Biodistribusi clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal ?

3. Bagaimana SNS Toksisitas clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal ?

C. TUJUAN

1. Mengetahui Bioavailabilitas clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal

2. Mengetahui Biodistribusi clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal

3. Mengetahui SNS Toksisitas clinical-grade parvovirus H1 setelah

penyuntikan secara intavena dan intraceberal

3
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian HPV

Human Papilloma Virus (HPV) adalah jenis virus yang cukup lazim. Jenis

yang berbedadapat menyebabkan kutil atau pertumbuhan sel yang tidak normal

(displasia) dalam atau disekitar leher rahim atau dubur yang dapat menyebabkan

kanker leher rahim atau dubur. Kutil-kutil ini pada umumnya tumbuh di

permukaan kulit yang lembab dan di daerah sekitar alatkelamin sehingga disebut

kutil kulit dan kutil kelamin. Infeksi HPV pada alat kelamin dapatdisebarkan

melalui hubungan seks, sedangkan penularan kutil kulit pada tangan atau kaki

dapatterjadi tanpa hubungan seks (penularannya dapat melalui sentuhan atau

penggunaan barangsecara bersama).

B. Klasifikasi

HPV merupakan virus DNA dengan klasifikasi

Familia : PapovaviridaeGenus : PapillomavirusSpesies : Human Papillomavirus

C. Morfologi

Papovavirus merupakan virus kecil ( diameter 45-55 nm ) yang

mempunyai genom beruntaiganda yang sirkuler diliputi oleh kapsid (kapsid ini

berperan pada tempat infeksi pada sel) yangtidak berpembungkus menunjukkan

bentuk simetri ikosahedral. Berkembang biak pada inti selmenyebabkan infeksi

laten dan kronis pada pejamu alamiahnya dan dapat menyebabkan tumor pada

4
beberapa binatang (Contoh : Virus Papilloma manusia (kutil), Virus BK

(diasingkan dari airkemih penderita yang mendapat obat-obat imunosupresif)).

Mekanisme infeksi virus diawali dengan protein menempel pada dinding

sel danmengekstraksi semua protein sel kemudian protein sel itu ditandai (berupa

garis-garis) berdasarkan polaritasnya. Jika polaritasnya sama denagn polaritas

virus maka, dapat dikatakan bahwa sel yang bersangkutan terinfeksi virus. Setelah

itu, virus menginfeksikan materigenetiknya ke dalam sel yang dapat menyebabkan

terjadinya mutasi gen jika materi genetik virusini bertemu dengan materi genetik

sel. Setelah terjadi mutasi, DNA virus akan bertambah banyakseiring pertambahan

jumlah DNA sel yang sedang bereplikasi. Ini menyebabkan

displasia(pertumbuhan sel yang tidak normal) jadi bertambah banyak dan tak

terkendali sehinggamenyebabkan kanker.

“Papova” berasal dari tiga nama yang sering dipelajari ( Papilloma, Polyoma,

Vacoulating ).

Yang akan dibahas termasuk virus Papilloma yaitu yang menyebabkan

tumor jinak dan ganas pada banyak tipe mamalia. Virus ini merupakan salah satu

dari virus DNA yang diketahuimenyebabkan tumor alamiah pada tuan rumah

aslinya. Virus Papilloma menyebabkan beberapa jenis kutil yang berbeda pada

manusia, meliputi kutil kulit, kondiloma genital/ kondilomaakuminata(KA) atau

kutil kelamin/ atau genital wart (di masyarakat dikenal sebagai jenggerayam

dengan masa inkubasi :1-6 bulan rata-rata 3 bulan, tampak benjolan seperti

jengger ayamdi sekitar kemaluan dan anus serta kebanyakan tanpa keluhan ), dan

papilloma larings.Papillomavirus sangat tropik terhadap sel-sel epitel kulit dan

5
membran mukosa. Tahap-tahapdalam siklus replikasi virus tergantung pada

faktor-faktor spesifik yang terdapat dalam statusdiferensiasi berikutnya dari sel

epitel. Ketergantungan kuat replikasi virus pada statusdiferensiasi sel inang ini,

meyebabkan sulitnya perkembangbiakan Papillomavirus in vitro.Dengan

mikroskop elektron virus, HPV berbentuk icosahedral dengan ukuran 55

nm,memiliki 72 kapsomer dan 2 protein kapsid , yaitu L1 dan L2. Virus DNA ini

dapat bersifatmutagen. Infeksi HPV telah dibuktikan menjadi penyebab lesi

prakanker,kondilomaakuminatum, dan kanker. Terdapat 138 strain HPV yang

sudah diidentifikasi, 30 di antaranyadapat ditularkan lewat hubungan seksual.

Ada lebih dari seratus virus yang dikenal sebagai virus papilloma manusia

(human papilloma virus/HPV). HPV dapat menyebabkan kanker leher rahim

karena dapat membuat pertumbuhan sel menjadi tidak normal (dengan cara virus

masuk ke dalam inti sel di leher rahimdan mengubah bentuk sel sehingga sel

menjadi mudah rapuh dan pertumbuhannya menjadi tidak beraturan).Satu

penelitian menemukan 11.000 perempuan terdeteksi HPV-positif di AS dan

sekitar4000 orang meninggal karenanya. HPV menular dengan mudah melalui

hubungan seks.Diperkirakan 75 persen orang yang aktif secara seksual terutama

berusia 15-49 tahun di ASmengalami sedikitnya satu jenis infeksi HPV. Virus ini

terdiri dari puluhan genotype, dan dapatmenyerang berbagai bagian tubuh seperti

jari dan tangan, telapak kaki, wajah, genital. Tipe Human papillomavirus cukup

beragam. Dari 100 tipe HPV, hanya 30 di antaranya yang berisikokanker

serviks.Adapun tipe yang paling berisiko adalah HPV 16, 18, 31, dan 45.

Sedangkan tipe 33, 35, 39,51, 52, 56, 58, 59, dan 68 merupakan tipe berisiko

6
sedang. Dan yang berisiko rendah adalah tipe6,11, 26, 42, 43, 44, 53, 54, 55, dan

56. Dari tipe-tipe ini, HPV tipe 16 dan 18 merupakan penyebab 70% kanker rahim

yang terjadi, sedangkan HPV tipe 1 dan 11 merupakan penyebab90% kandiloma

akuminata jinak dan Papilloma laring pada anak-anak. Infeksi HPV

memilikiketerkaitan dengan lebih dari 99% kasus kanker serviks di seluruh dunia.

D. Penyakit Yang Ditimbulkan

Berbagai jenis HPV menyebabkan kutil umum pada tangan atau kaki.

HPV juga dapatmengakibatkan masalah pada mulut atau pada lidah dan bibir.

Beberapa jenis HPV dapatmenyebabkan kutil kelamin pada penis, vagina dan

dubur. Jenis HPV lain dapat menyebabkan pertumbuhan sel yang tidak normal

yang disebut displasia. Displasia dapat berkembang menjadikanker dubur pada

laki-laki dan perempuan, dan kanker leher rahim (cervical cancer ), atau kanker

penis dan bias juga terjadi kanker otak. Displasia di sekitar dubur disebut

neoplasia intraepitelial anal (anal intraepithelialneoplasia/AIN). Epitel adalah

lapisan sel yang meliputi organ atau menutupi permukaan tubuhyang terbuka.

Neoplasia berarti perkembangan baru sel yang tidak normal. AIN

adalah perkembangan sel baru yang tidak normal pada lapisan dubur. Displasia

pada daerah leher Rahim disebut neoplasia intraepitelial serviks (cervical

intraepithelial neoplasia/CIN).

7
E. Rute-rute Injeksi

1. Parenteral Volume Kecil

a. Intradermal

Istilah intradermal (ID) berasal dari kata "intra" yang berarti lipis

dan "dermis" yang berarti sensitif, lapisan pembuluh darah dalam kulit.

Ketika sisi anatominya mempunyai derajat pembuluh darah tinggi,

pembuluh darah betul-betul kecil. Makanya penyerapan dari injeksi

disini lambat dan dibatasi dengan efek sistemik yang dapat

dibandingkan karena absorpsinya terbatas, maka penggunaannya biasa

untuk aksi lokal dalam kulit untuk obat yang sensitif atau untuk

menentukan sensitivitas terhadap mikroorganisme.

b.Intramuskular

Istilah intramuskular (IM) digunakan untuk injeksi ke dalam obat.

Rute intramuskular menyiapkan kecepatan aksi onset sedikit lebih

normal daripada rute intravena, tetapi lebih besar daripada rute

subkutan.

c. Intravena

Istilah intravena (IV) berarti injeksi ke dalam vena. Ketika tidak

ada absorpsi, puncak konsentrasi dalam darah terjadi dengan segera,

dan efek yang diinginkan dari obat diperoleh hampir sekejap.

8
d.Subkutan

Subkutan (SC) atau injeksi hipodermik diberikan di bawah kulit.

Parenteral diberikan dengan rute ini mempunyai perbandingan aksi

onset lambat dengan absorpsi sedikit daripada yang diberikan dengan

IV atau IM.

e. Rute intra-arterial; disuntikkan langsung ke dalam arteri, digunakan

untuk rute intravena ketika aksi segera diinginkan dalam daerah perifer

tubuh.

f. Intrakardial; disuntikkan langsung ke dalam jantung, digunakan ketika

kehidupan terancam dalam keadaan darurat seperti gagal jantung.

g. Intraserebral; injeksi ke dalam serebrum, digunakan khusus untuk aksi

lokal sebagaimana penggunaan fenol dalam pengobatan trigeminal

neuroligia.

h. Intraspinal; injeksi ke dalam kanal spinal menghasilkan konsentrasi

tinggi dari obat dalam daerah lokal. Untuk pengobatan penyakit

neoplastik seperti leukemia.

i. Intraperitoneal dan intrapleural ; Merupakan rute yang digunakan

untuk pemberian berupa vaksin rabies. Rute ini juga digunakan untuk

pemberian larutan dialisis ginjal.

j. Intra-artikular

Injeksi yang digunakan untuk memasukkan bahan-bahan seperti obat

antiinflamasi secara langsung ke dalam sendi yang rusak atau teriritasi.

9
 k.Intrasisternal dan peridual ; Injeksi ke dalam sisterna intracranial dan

durameter pada urat spinal. Keduanya merupakan cara yang sulit

dilakukan, dengan keadaan kritis untuk injeksi.

l. Intrakutan (i.c)

Injeksi yang dimasukkan secara langsung ke dalam epidermis di

bawah stratum corneum. Rute ini digunakan untuk memberi volume

kecil (0,1-0,5 ml) bahan-bahan diagnostik atau vaksin.

m. Intratekal

Larutan yang digunakan untuk menginduksi spinal atau anestesi

lumbar oleh larutan injeksi ke dalam ruang subarachnoid. Cairan

serebrospinal biasanya diam pada mulanya untuk mencegah

peningkatan volume cairan dan pengaruh tekanan dalam serabut saraf

spinal. Volume 1-2 ml biasa digunakan. Berat jenis dari larutan dapat

diatur untuk membuat anestesi untuk bergerak atau turun dalam kanal

spinal, sesuai keadaan tubuh pasien.

2. Parenteral Volume Besar

Untuk pemberian larutan volume besar, hanya rute intravena dan

subkutan yang secara normal digunakan.

a. Intravena

Keuntungan rute ini adalah (1) jenis-jenis cairan yang disuntikkan

lebih banyak dan bahkan bahan tambahan banyak digunakan IV

daripada melalui SC, (2) cairan volume besar dapat disuntikkan relatif

10
 lebih cepat; (3) efek sistemik dapat segera dicapai; (4) level darah dari

obat yang terus-menerus disiapkan, dan (5) kebangkitan secara

langsung untuk membuka vena untuk pemberian obat rutin dan

menggunakan dalam situasi darurat disiapkan.

Kerugiannya adalah meliputi : (1) gangguan kardiovaskuler dan

pulmonar dari peningkatan volume cairan dalam sistem sirkulasi

mengikuti pemberian cepat volume cairan dalam jumlah besar; (2)

perkembangan potensial trombophlebitis; (3) kemungkinan infeksi

lokal atau sistemik dari kontaminasi larutan atau teknik injeksi septik,

dan (4) pembatasan cairan berair.

b.Subkutan

Penyuntikan subkutan (hipodermolisis) menyiapkan sebuah

alternatif ketika rute intravena tidak dapat digunakan. Cairan volume

besar secara relatif dapat digunakan tetapi injeksi harus diberikan

secara lambat. Dibandingkan dengan rute intravena, absorpsinya lebih

lambat, lebih nyeri dan tidak menyenangkan, jenis cairan yang

digunakan lebih kecil (biasanya dibatasi untuk larutan isotonis) dan

lebih terbatas zat tambahannya.

F. Keuntungan Injeksi

a) Respon fisiologis yang cepat dapat dicapai segera bila diperlukan, yang

menjadi pertimbangan utama dalam kondisi klinik seperti gagal jantung,

asma, shok.

11
b) Terapi parenteral diperlukan untukobat-obat yang tidak efektif secara

oral atau yang dapat dirusak oleh saluran pencernaan, seperti insulin,

hormon dan antibiotik.

c) Obat-obat untuk pasien yang tidak kooperatif, mual atau tidak sadar

harus diberikan secara injeksi.

d) Bila memungkinkan, terapi parenteral memberikan kontrol obat dari ahli

karena pasien harus kembali untuk pengobatan selanjutnya. Juga dalam

beberapa kasus, pasien tidak dapat menerima obat secara oral.

e) Penggunaan parenteral dapat menghasilkan efek lokal untuk obat bila

diinginkan seperti pada gigi dan anestesi.

f) Dalam kasus simana dinginkan aksi obat yang diperpanjang, bentuk

parenteral tersedia, termasuk injeksi steroid periode panjang secara intra-

artikular dan penggunaan penisilin periode panjang secara i.m.

g) Terapi parenteral dapat memperbaiki kerusakan serius pada

keseimbangan cairan dan elektrolit.

h) Bila makanan tidak dapat diberikan melalui mulut, nutrisi total

diharapkan dapat dipenuhi melalui rute parenteral.

i) Aksi obat biasanya lebih cepat.

j) Seluruh dosis obat digunakan.

k) Beberapa obat, seperti insulin dan heparin, secara lengkap tidak aktif

ketika diberikan secara oral, dan harus diberikan secara parenteral.

12
 l) Beberapa obat mengiritasi ketika diberikan secara oral, tetapi dapat

ditoleransi ketika diberikan secara intravena, misalnya larutan kuat

dektrosa.

m) Jika pasien dalam keadaan hidrasi atau shok, pemberian intravena dapat

menyelamatkan hidupnya.

G. Kekurangan Injeksi

a) Bentuk sediaan harus diberikan oleh orang yang terlatih dan

membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan pemberian

rute lain.

b) Pada pemberian parenteral dibutuhkan ketelitian yang cukup untuk

pengerjaan secara aseptik dari beberapa rasa sakit tidak dapat dihindari.

c) Obat yang diberikan secara parenteral menjadi sulit untuk

mengembalikan efek fisiologisnya.

d) Yang terakhir, karena pada pemberian dan pengemasan, bentuk sediaan

parenteral lebih mahal dibandingkan metode rute yang lain.

e) Beberapa rasa sakit dapat terjadi seringkali tidak disukai oleh pasien,

terutama bila sulit untuk mendapatkan vena yang cocok untuk

pemakaian i.v.

f) Dalam beberapa kasus, dokter dan perawat dibutuhkan untuk mengatur

dosis.

g) Sekali digunakan, obat dengan segera menuju ke organ targetnya. Jika

pasien hipersensitivitas terhadap obat atau overdosis setelah

penggunaan, efeknya sulit untuk dikembalikan lagi.

13
 h) Pemberian beberapa bahan melalui kulit membutuhkan perhatian sebab

udara atau mikroorganisme dapat masuk ke dalam tubuh. Efek

sampingnya dapat berupa reaksi phlebitis, pada bagian yang

diinjeksikan.

H. Syarat-syarat Injeksi

1. Bebas dari mikroorganisme, steril atau dibuat dari bahan-bahan steril di

bawah kondisi yang kurang akan adanya kombinasi mikroorganisme

(proses aseptik).

2. Bahan-bahan bebas dari endotoksin bakteri dan bahan pirogenik

lainnya.

3. Bahan-bahan yang bebas dari bahan asing dari luar yang tidak larut.

4. Sterilitas

5. Bebas dari bahan partikulat

6. Bebas dari Pirogen

7. Kestabilan

8. Injeksi sedapat mungkin isotonis dengan darah.

14
 BAB III

METODE KERJA

A. BAHAN

Replikasi-kompeten tipe liar H1PV diproduksi untuk tingkat GMP oleh

IDT Biologika (Dessau, Jerman, Angkatan No. 0090810). Produksi H1PV

dilakukan sesuai dengan protokol standar yang dimodifikasi yang disesuaikan

dengan persyaratan GMP dan produksi skala besar. Singkatnya, H1PV

diperbanyak dalam sel-sel ginjal bayi baru lahir manusia (NB324K) dan

dimurnikan dengan sentrifugasi kepadatan-gradien iodixanol.27 Partikel-partikel

infektif dikuantifikasi dengan uji pembentukan plak. Titer virus H1PV dalam

kelompok uji yang digunakan untuk semua percobaan hewan adalah 7,96 × 109

pfu / mL. Semua formulasi soal-uji disiapkan sebagai larutan stok dan disimpan

sebagai alikuot pada sekitar −80 ° C sampai digunakan. Pembekuan dan pencairan

alikuot yang berulang-ulang dihindari. Formulasi H1PV diuji untuk konsentrasi

genom virus (VG) oleh PCR dan untuk pfu dengan uji plak. Semua dosis injeksi

sepenuhnya infektif pada saat injeksi. Rasio VG ke pfu adalah sekitar 1 × 103.

Formulasi item tes yang tersisa setelah administrasi in vivo individu dibuang.

B. Cara Kerja

1. Formulasi Virus Untuk Pengujian Ketersediaan Hayati

Semua tikus menerima dosis yang sama 7,96 × 107 pfu. Untuk pemberian

intravena, 650 μL H1PV stok diencerkan dengan 5850 μL 48% iodixanol dalam

15
larutan Ringer (batch 290410; indeks refraksi, 1,41 ± 0,01). Untuk administrasi

intraserebral, alikuot dari stok virus yang tidak dilarutkan digunakan

2. Formulasi Virus Untuk Penyelidikan Efek SSP Yang Merugikan

Injeksi Intracerebral H1PV dilakukan pada 3 tingkat dosis: 7.96 × 107 pfu

(dosis tinggi), 7.96 × 106 pfu (dosis menengah), dan 7.96 × 105 pfu (dosis

rendah). Untuk kelompok dosis tinggi, alikuot dari H1PV murni disiapkan. Untuk

kelompok dosis menengah, 40 μL H1PV ditambahkan ke 360 μL 48% iodixanol

dalam larutan Ringer. Untuk kelompok dosis rendah, 40 μL larutan H1PV dosis

menengah diencerkan dengan 360 μL 48% iodixanol dalam larutan Ringer. Tikus

pada kelompok kontrol diinjeksi dengan kendaraan saja (48% iodixanol dalam

larutan Ringer)

3. Persiapan Klorpromazin dan d-amfetamin

Klorpromazin (60 mg; batch 097K2503, Sigma, Taufkirchen, Jerman)

diencerkan dalam volume akhir 30 mL air steril (batch 04002D, Delta Select,

Munich, Jerman). d-Amphetamine (54 mg; batch 058K3350, Sigma) diencerkan

dalam volume akhir 27 mL air steril (batch 04002D, Delta Select). Konsentrasi

akhir bahan aktif dalam formulasi untuk setiap zat adalah 2 mg / mL. Senyawa ini

digunakan sebagai kontrol positif dalam prosedur penyaringan IRWIN yang

dimodifikasi

4. Eksperimen Hewan

Untuk pengujian ketersediaan jaringan, digunakan tikus nisteri nulipara

SPF jantan dan tidak hamil betina (Crl: WI [Han]). Studi keamanan pada efek SSP

potensial dilakukan sesuai dengan ICH Guidance Document M3 (R2) 9 dengan

16
menggunakan tikus Wistar jantan yang sehat. Semua hewan diperoleh dari sistem

pemuliaan dengan penghalang penuh yang terkontrol (Charles River, Sulzfeld,

Jerman) dan diuji terhadap virus, termasuk H1 parvovirus, bakteri, dan parasit

(daftar lengkap agen yang diuji tersedia di http://www.criver.com

/HealthData/de/H64W090R.pdf). Pada awal penelitian, tikus berusia 8 hingga 12

minggu. Semua hewan dibiakkan untuk tujuan eksperimental sesuai dengan Pasal

9.2, Nomor 7 Undang-Undang Jerman tentang Kesejahteraan Hewan.5 Studi

dilakukan oleh BSL Bioservice (Munich, Jerman). Semua percobaan mematuhi

Undang-Undang Jerman tentang Kesejahteraan Hewan (Tierschutzgesetz, Juli

2009), 5 Praktik Laboratorium yang Baik, 20 dan Perlindungan Infeksi

(Infektionsschutzgesetz, Januari 2001) .4 Lisensi untuk menangani parvovirus H1

dan untuk melakukan studi toksisitas akut dan dosis berulang adalah diberikan

kepada BSL Bioservice oleh pemerintah Upper Bavaria, Munich, Jerman

5. Perumahan Dan Kondisi Makan

Tikus ditempatkan di bawah kondisi penghalang penuh di ruangan ber-AC

(10 udara berubah setiap jam) pada 22 ± 3 ° C, kelembaban relatif 55% ± 10%,

dan fotoperiode 12: 12-h. Hewan memiliki akses gratis ke diet pemeliharaan

komersial untuk tikus dan tikus (nomor lot 1020, Altromin 1324, Altromin, Lage,

Jerman) dan untuk mengambil air yang belerang diasidifikasi hingga pH 2,8

(kurang-lebih). Tikus ditempatkan secara individual selama pengujian

biodistribusi tetapi dikelompokkan secara kelompok untuk studi keamanan SSP,

kecuali status kesehatan hewan mengharuskan perumahan individu. Semua tikus

disimpan dalam kandang berventilasi individual (kandang polisulfon tipe H III

17
dengan alas serbuk gergaji dan terowongan polikarbonat untuk pengayaan) untuk

menghindari infeksi silang antar hewan. Kandang dengan tempat tidur segar

disediakan setiap minggu. Tikus-tikus digunakan selama 5 hari sebelum

percobaan dimula

6. Kelompok Uji Studi Biodistribusi

Populasi penelitian ini terdiri dari 36 tikus Wistar betina dan 36 jantan,

yang dibagi menjadi 3 kelompok sesuai dengan titik waktu terminal euthanasia (6

jam, 48 jam, atau 14 hari setelah dosis tunggal). Masing-masing dari 3 kelompok

dibagi menjadi 2 subkelompok berdasarkan rute administrasi (baik intracerebral

atau intravena). Sebelum pemberian pertama, pengamatan klinis rinci dilakukan

pada masing-masing hewan. Item tes diberikan baik sebagai injeksi intravena

tunggal (volume, 100 μL) atau intraserebral (volume, 10 μL). Semua tikus

menerima dosis yang sama 7,96 × 107 pfu H1PV.

7. Studi Keamanan Tentang Efek SSP

Studi keamanan SSP melibatkan 48 tikus jantan, yang dibagi menjadi 6

kelompok 8 Untuk masing-masing hewan. Sebelum pemberian pertama,

pemeriksaan klinis rinci dilakukan pada masing-masing hewan. Satu kelompok

masing-masing menerima salah satu kendaraan saja secara intracerebrally; 7,96 ×

107 pfu, 7,96 × 106 pfu; atau 7,96 × 105 pfu H1PV secara intracerebrally;

chlorpromazine oral; atau d-amfetamin oral. Untuk tikus dalam kelompok H1PV

dan kendaraan, volume total yang disuntikkan adalah 10 μL. Item referensi

masing-masing chlorpromazine dan d-amfetamin diberikan sebagai dosis oral

tunggal 20 mg / kg dalam air pada volume aplikasi 10 mL / kg

18
 8. Mode Administrasi

Pemberian intravena dilakukan pada tikus yang sadar dan terkendali

sebagai suntikan bolus lambat di vena ekor. Pemberian intraserebral dilakukan

pada tikus yang dianestesi isoflurane. Hewan ditempatkan pada selimut

homeotermik, dengan kepala ditempatkan dalam bingkai stereotaxic (DKI 900,

David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Kepala dicukur dan didesinfeksi dengan

larutan yodium. Setelah sayatan kulit garis tengah, tengkorak itu ditusuk dengan

jarum 20-gauge 1 mm anterior ke persimpangan sutura coronalis dan sutura

sagittalis dan 2 mm lateral ke kanan. Jarum Hamilton 10-μL Hamilton dipasang

pada kerangka stereotactic dan dimasukkan 6 mm di bawah level tulang. Sebelum

injeksi, jarum ditarik 1 mm. Butir uji disuntikkan secara perlahan, pada laju

sekitar 1 μL / mnt, dengan volume total 10 μL. Setelah pemberian, jarum

dibiarkan di tempat selama sekitar 2 menit untuk memungkinkan difusi lebih

lanjut dari item uji dari situs aplikasi. Jarum suntik kemudian dilepas perlahan,

sekitar 1 mm / menit. Situs sayatan dijahit, dan tikus kembali ke kandangnya

untuk pemulihan. Tidak ada analgesik pasca operasi yang diberikan

9. Pemeriksaan Mortalitas dan Observasi Klinis

Tikus dipantau selama 6 jam, 48 jam, atau 14 hari setelah pemberian

dalam studi biodistribusi dan selama 48 jam dalam studi toksisitas SSP. Hewan-

hewan diperiksa dua kali sehari untuk gejala klinis atau kematian. Tanda-tanda

penyakit sebelum, selama, atau setelah pemberian atau reaksi terhadap pengobatan

dicatat.

19
 10. Berat Badan

Dalam kedua penelitian, berat badan diukur sebelum pemberian dan pada

saat eutanasia untuk kelompok H1PV dan kendaraan saja. Tikus dalam kelompok

klorpromazin dan d-amfetamin ditimbang sebelum pemberian saja.

11. Pengambilan Sampel Untuk Evaluasi qPCR

Untuk studi biodistribusi, 24 tikus ditempatkan di kandang metabolik sehari

sebelum pemberian H1PV untuk memungkinkan pengumpulan urin, feses, dan

saliva. Dari 72 tikus (3 kelompok terdiri dari 24 tikus; 12 per rute pemberian,

sampel darah sementara seri diperoleh dari subkelompok 3 tikus jantan dan 3

betina pada setiap titik waktu untuk setiap rute pemberian (intravena dan

intratumor). kelompok sampel pada 0 menit, 15 menit, dan 2 jam, dengan semua

24 tikus sampel pada 6 jam (di euthanasia), tikus pada kelompok kedua sampel

pada 0 menit, 30 menit, 12 jam, dan 24 jam (6 tikus) setiap titik waktu), dengan

semua sampel sebelum eutanasia pada 48 jam, dan tikus pada kelompok terakhir

diambil sampel pada 0 menit dan hari 4, 7, 10, dan 14 (pada eutanasia) .Semua

sampel darah (400 μL) diperoleh dari vena jugularis isoflurane tikus yang

dianestesi. Darah dikumpulkan dalam tabung lithium heparin. Selain itu, tinja, air

liur, dan urin dikumpulkan pada hari yang sama dengan pengambilan sampel

darah dari tikus yang diambil sampel pada hari ke 4, 7, dan 10. Untuk qPCR

kuantifikasi genom virus H1PV, sampel darah (diobati dengan heparin), otak,

jantung, ovarium, paru-paru, hati, limpa, ginjal, mand kelenjar getah bening

ibular, kelenjar getah bening mesenterika, pankreas, prostat, mammae, sumsum

tulang, tinja, dan urin dikumpulkan di eutanasia. Kotoran dikumpulkan dengan

20
pengambilan sampel dari usus besar, dan urin diperoleh dengan sistosentesis. Air

liur dikumpulkan dengan menggunakan cotton swab (Catch-All Sample

Collection Swab, Epicenter, Madison, WI). Semua sampel dibekukan dalam

nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80 ° C (apusan saliva disimpan di bawah -

20 ° C) sampai pemrosesan dan analisis.

12. Prosedur qPCR

Setelah pencairan, jumlah organ dan feses yang diperlukan ditimbang dan

dipotong kecil-kecil. Apusan saliva terputus dari aplikator. Sampel darah

dianalisis sebagai darah lengkap, tanpa pemisahan serum dan mantel kulit. DNA

diekstraksi dengan menggunakan berbagai kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Belanda)

dan Solusi Ekstraksi DNA Ekstraksi Cepat (Episentrum), dengan sedikit

modifikasi; studi validasi dilakukan. Suspensi virus referensi diencerkan dalam 10

mM Tris HCl pH 7,5 sebelum menyerang dengan virus dari kalibrasi dan sampel

kontrol kualitas yang diperlukan. Setiap kurva kalibrasi terdiri dari 2 sampel

kontrol negatif dan 7 sampel duplikat yang sesuai dengan konsentrasi target 5 ×

107 (1,25 × 107 untuk air liur), 5 × 106, 5 × 105, 5 × 104, 5 × 104, 5 × 103, 5 ×

102, dan 3 × 102 hingga 5 × 101 VG per reaksi PCR, tergantung pada metode

yang divalidasi untuk setiap jenis sampel. Master mix per 20-μL reaksi (volume

akhir) mengandung 3,35 μL PCR-grade H2O; 10 μL LightCycler 480 Probe

Master (Roche, Mannheim, Jerman) 2 ×, 0,55 μL FW-H1 (40 ×, 10 μM; 5 ′ GCG

CGG CAG AAT TCA AAC T 3 ′), 0,55 μL Rev-H1 (40 ×, 10 µM; 5′CCA CCT

GGT TGA GCC ATC AT 3 ′); dan 0,55 µL menyelidiki H1 (40 × 10 µM; 5′-6-

FAM-ATG C5 * G CC5 * G5 * C5 * GT TA TAMRA 3 ′ [* menunjukkan ‘asam

21
nukleat yang terkunci]]. Aliquot (0,15 μL) dari campuran induk ditambahkan ke

setiap sumur pelat multiwall LightCycler, setelah itu ditambahkan 5 μL ekstrak

DNA. Parameter bersepeda adalah 95 ° C selama 10 menit; diikuti oleh 45 siklus

95 ° C selama 15 detik, 60 ° C selama 60 detik; dan diakhiri dengan 40 ° C selama

10 menit

13. Study Penilaian Toksisitas Fungsi Sistem Saraf Pusat Dan Otonom

Dalam studi keselamatan pada efek SSP potensial, pemeriksaan neurologis

sesuai dengan prosedur skrining IRWIN yang dimodifikasi dan pengamatan

aktivitas spontan di lapangan terbuka dilakukan sebelum dan pada dan 48 jam

setelah pemberian H1PV atau kendaraan intracerebral tunggal. 16,19 Tikus yang

menerima positif senyawa-senyawa kontrol (klorpromazin dan D-amfetamin)

diamati sebelum dan pada 1 jam (kecuali opthalmoskopi), 2 jam, dan 24 jam

setelah pemberian. Pemeriksaan meliputi pengamatan homecage singkat,

peringkat reaktivitas terhadap penghapusan dari kandang dan penanganan, dan

penilaian air liur, lakrimasi, exophthalmos, respirasi, piloerection, dan perubahan

kulit atau selaput lendir. Setelah tikus digunakan selama 2 menit di lapangan

terbuka, tingkat gairah (kewaspadaan), perilaku, aktivitas alat gerak dan

karakteristik gaya berjalan dicatat. Jumlah mata air yang didukung (menggunakan

perbatasan bidang terbuka sebagai pendukung) dan tidak didukung (tidak dibantu)

dihitung secara terpisah. Selain itu, bolus tinja dan genangan urin dihitung.

Kedutan, tremor, kejang, dan perilaku atau stereotip yang tidak biasa dicatat, jika

ada. Reaksi terhadap sentuhan pada jepitan kepala dan ekor dan kaki dicatat.

Dorong ekstensor, refleks fleksi, keseimbangan, kepasifan posisional, penempatan

22
visual, refleks menggenggam (bersama-sama dengan kekuatan genggaman),

refleks koreksi, dan respons goncangan pendengaran diuji. Respon pupil terhadap

cahaya diuji, dan ruang mata anterior serta fundus mata diperiksa setelah

penggunaan mydriatic (batch 240051, Atropin-Pos, Ursapharm, Saarbrücken,

Jerman). Suhu tubuh diukur setelah semua pemeriksaan dilakukan

14. Study Patologi Toksisitas SSP

Dalam studi keamanan pada efek SSP potensial, semua tikus di-eutanasia

dengan overdosis pentobarbital (Narcoren, Merial, Hallbergmoos, Jerman) pada

akhir periode pengamatan (48 jam). Tikus dalam kelompok H1PV dan kendaraan

menjalani nekropsi kotor, termasuk pemeriksaan otak. Selanjutnya, otak disimpan

dalam formalin buffered netral 10% untuk evaluasi histopatologis. Pemeriksaan

patologis dilakukan tanpa menyilaukan patologis ke kelompok perlakuan

15. Histopatologi Studi Toksisitas SSP

Evaluasi histopatologis dari semua tikus eutanasia dalam H1PV dan

kelompok kendaraan dilakukan tanpa menyilaukan patolog dengan alokasi hewan.

Otak yang difiksasi dalam formalin buffered netral 10% dikirim dari fasilitas uji

ke Propath UK (Hereford, Inggris, UK) untuk pemrosesan histologis. Setiap otak

dibedah dengan menggunakan matriks otak koroner RBM-4000C (Activational

Systems, Mableton, GA). Matriks ini memiliki 24 divisi (masing-masing 1 mm),

dan setiap otak dipotong pada divisi 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, dan 24 untuk

menyediakan 8 bagian koronal. Setelah penanaman parafin, bagian dengan

ketebalan sekitar 4 sampai 5 μm diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Lesi

23
yang berhubungan dengan tempat injeksi dinilai oleh ahli patologi bersertifikat

(GPE)

24
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

1. Bioavailability H1PV Setelah Injeksi

Data bioavailabilitas diperoleh sampai 14 hari setelah pemberian

intracerebral atau intravena tunggal 7,96 × 107 pfu H1PV untuk tikus Wistar. Tiga

kelompok, masing-masing terdiri dari 12 tikus Wistar jantan dewasa dan 12 betina

dewasa dan berbeda sesuai dengan waktu euthanasia setelah injeksi (6 jam, 48

jam, atau 14 hari), dievaluasi; masing-masing kelompok ini dibagi lagi sesuai

dengan rute administrasi. Konsentrasi tertinggi H1PV dalam darah diamati pada

titik waktu pengambilan sampel pertama (yaitu, 15 menit), terlepas dari rute

pemberian. Profil farmakokinetik untuk kedua rute (intravena dan intraserebral)

mengikuti penurunan bifasik, dengan fase eliminasi dan distribusi yang cepat dan

fase terminal yang rata (Gambar 1 dan 2). Pada 15 menit setelah pemberian,

konsentrasi darah H1PV (dalam jumlah VG / μL) tampaknya lebih tinggi setelah

intravena dibandingkan dengan injeksi intracerebral. Pada semua titik waktu

kemudian, konsentrasi darah tidak berbeda antara rute pemberian. Tingkat DNA

virus yang dapat dikuantifikasi masih dapat dideteksi dalam darah pada titik

waktu pengambilan sampel terakhir (14 hari setelah pemberian dosis) pada 9 dari

12 tikus yang diberi suntikan intraserebral dan pada 7 dari 12 hewan yang diberi

dosis intravena. Perhitungan bioavailabilitas setelah pemberian intraserebral 7,96

25
× 107 pfu H1PV menghasilkan nilai 42% untuk tikus jantan dan 97% untuk tikus

betina (Tabel 1). Secara umum, ada variabilitas antarindividu yang tinggi dalam

konsentrasi darah H1PV, terlepas dari cara pemberiannya. Konsentrasi maksimal

terdeteksi pada 0,5 hingga 2 jam setelah pemberian dosis, menunjukkan bahwa

H1PV didistribusikan ke kompartemen darah dalam waktu yang relatif singkat

setelah pemberian ke otak. Level darah puncak sedikit lebih tinggi pada tikus

betina, tetapi paparan keseluruhan sebanding dengan jenis kelamin. Mengingat

bahwa paparan darah secara keseluruhan setelah dosis intraserebral serupa antara

tikus jantan dan betina, perbedaan yang dihitung dalam bioavailabilitas rata-rata

antara kedua jenis kelamin tampaknya terkait dengan penentuan konsentrasi darah

setelah pemberian intravena dan karena itu kemungkinan besar karena variabilitas

tinggi dari nilai-nilai individu. Oleh karena itu, terlepas dari perbedaan yang

dihitung, bioavailablity intraserebral yang serupa pada kedua jenis kelamin dapat

secara wajar diasumsikan (Tabel 1).

Gambar 1. (A) konsentrasi H1PV dalam darah setelah pemberian intravena tunggal 7,96 × 107 pfu
untuk tikus Wistar jantan dan betina (n = 3 pada setiap titik waktu, kecuali n = 6 tikus dari setiap
jenis kelamin pada 6, 48, dan 336 h). (B) konsentrasi H1PV dalam darah setelah pemberian
intracerebral tunggal 7,96 × 107 pfu untuk tikus Wistar jantan dan betina (n = 3 pada setiap titik
waktu, kecuali n = 6 tikus dari setiap jenis kelamin pada 6, 48, dan 336 jam).

26
 2. Biodistribusi H1PV

Biodistribusi H1PV setelah dosis intracerebral atau intravena tunggal.

Sampel otak, paru-paru, hati, limpa, ginjal, kelenjar getah bening mandibula dan

mesenterika, pankreas, prostat, daerah kelenjar susu, sumsum tulang, dan jaringan

miokard dikumpulkan pada 6 jam, 48 jam, dan 14 hari setelah injeksi dari pria dan

wanita tikus setelah pemberian intracerebral atau intravena 7,96 × 107 pfu H1PV.

DNA virus terdeteksi oleh qPCR di semua organ dan jaringan yang diuji dianalisis

(Tabel 2). Konsentrasi DNA virus tertinggi ditemukan di hati dan limpa pada 6

jam setelah pemberian H1PV. Konsentrasi terendah ada di paru-paru, kelenjar

susu, dan sampel prostat. Pada sebagian besar jenis jaringan, DNA virus (no. VG)

sedikit menurun dari waktu ke waktu. Tidak ada penurunan dari waktu ke waktu

terdeteksi pada sampel paru-paru. Pada beberapa hewan, DNA virus masih dapat

terdeteksi di seluruh panel organ yang diuji 14 hari setelah injeksi. Pola

konsentrasi virus dari waktu ke waktu tergantung pada rute pemberian dalam 2

jaringan saja. Seperti yang diharapkan, konsentrasi yang lebih tinggi hadir dalam

otak tikus yang menerima suntikan H1PV intracerebral dibandingkan dengan

mereka yang terpajan dengan pemberian intravena. Perbedaan ini masih jelas

bahkan pada 14 hari setelah perawatan. Selain itu, konsentrasi DNA virus pada

kelenjar getah bening mandibula pada 6 jam lebih tinggi setelah intraserebral

dibandingkan dengan injeksi intravena. Perbedaan ini tidak tampak pada kelenjar

getah bening mesenterika. Tidak ada perbedaan yang berhubungan dengan jenis

kelamin dalam distribusi organ H1PV pada tikus

27
Gambar 2. Bagian otak koroner (pembesaran, 4 ×) menunjukkan saluran injeksi intraserebral pada
tikus yang diberi perlakuan (A) dengan kendaraan saja atau (B) 7,96 × 105 pfu, (C) 7,96 × 106
pfu, atau (D) 7,96 × 107 pfu H1PV. (E) Perdarahan parenkim dan vaskulitis minimal fokus
(asterisk) pada tikus yang diobati hanya dengan kendaraan (pembesaran, 20 ×). (F) Infiltrat sel
inflamasi meningeal ringan (panah) dan area kecil ensefalomalasia (tanda bintang) di dekat saluran
injeksi pada tikus yang diobati dengan 7,96 × 106 pfu H1PV (pembesaran, 10 ×).

1. Ekskresi H1PV Setelah Dosis Intracerebral Atau Intravena Tunggal

Pemberian H1PV (7,96 × 107 pfu) intracerebral atau intravena tunggal

menghasilkan paling banyak jejak DNA virus dalam urin dan saliva ketika

dievaluasi selama 14 hari setelah pemberian dosis.

Konsentrasi DNA virus yang moderat ditemukan dalam tinja dalam waktu 14

hari setelah injeksi H1PV. Baik rute administrasi maupun jenis kelamin tikus

tampaknya tidak mempengaruhi jumlah H1PV yang ditumpahkan (Tabel 3)

28
Tabel 1. Farmakokinetik darah rata-rata H1PV pada tikus Wistar setelah pemberian intracerebral
atau intravena tunggal 7,96 × 107 pfu

Tabel 2. Konsentrasi H1PV ((log mean ± 1 SD; no. VG / µg DNA genomik) dalam
jaringan setelah pemberian tunggal tikus Wistar secara intravena atau intracerebral
dengan 7,96 × 107 pfu

Tabel 3. Ekskresi (rata-rata log ± 1 SD) dari H1PV dalam tinja, urin, dan saliva tikus setelah
pemberian tunggal 7,96 × 107 pfu

29
Tabel 4. Jumlah lesi histologis terkait tempat suntikan setelah injeksi 8 tikus dengan H1PV pada 3
level dosis tunggal

2. Pengamatan Mortalitas Dan Klinis

Tidak ada tikus yang diobati dengan H1PV yang mati selama periode

pengamatan (6 jam sampai 14 hari setelah pemberian), juga tidak menunjukkan

temuan klinis terkait dengan persiapan virus.

3. Berat Badan

Penurunan berat badan minimal (6 g atau kurang) tampak jelas tanpa bias

mengenai jenis kelamin, rute pemberian, atau kelompok perlakuan pada titik

waktu 48 jam pada beberapa tikus. Pada 14 hari setelah pemberian intracerebral

atau intravena, semua tikus jantan dan betina mengalami kenaikan berat badan

dibandingkan dengan baseline. Tidak ada perbedaan yang relevan dalam

peningkatan berat badan terlihat antara tikus yang diobati melalui intravena

dibandingkan dengan rute intracerebral (data tidak ditunjukkan).

30
 4. Potensi Efek Buruk Pada SSP

Potensi efek buruk pada SSP setelah injeksi H1PV intracerebral. Kematian

dan tanda-tanda klinis. Tidak ada kematian yang tercatat setelah injeksi 10 μL

H1PV dalam kendaraan (48% iodixanol dalam larutan Ringer) intraserebral yang

mengandung dosis 0, 7,96 × 107, 7,96 × 106, atau 7,96 × 105 pfu H1PV. Selama

periode pengamatan 48 jam, tidak ada temuan klinis yang secara spesifik terkait

dengan kendaraan atau H1PV yang tercatat pada salah satu dari 3 level dosis.

5. Fungsionalitas SSP

Fungsionalitas SSP.Setelah injeksi intracerebral tunggal, tidak ada

perbedaan yang relevan dalam parameter fungsional atau perilaku yang terlihat

pada tikus yang diobati dengan H1PV (semua kelompok dosis) dibandingkan

dengan hewan kontrol yang disuntikkan kendaraan. Pengamatan meliputi postur,

gaya berjalan, penutupan palpebra, lakrimasi, piloereksi, gairah, dan vokalisasi.

Tidak ada kejang, tremor, stereotip, atau perilaku aneh yang diamati pada

kelompok kontrol atau dan kelompok yang diobati dengan H1PV. Tidak ada

kelainan dalam jumlah mata air yang didukung dan tidak didukung yang

terdeteksi. Respons motorik yang tertunda terhadap cubitan ekor dicatat dalam 4

tikus dari kelompok yang hanya menggunakan kendaraan. Tidak ada respon

terhadap refleks yang diubah dibandingkan dengan evaluasi pretreatment pada

tikus yang diobati dengan H1PV.

Respons pupil dan pemeriksaan oftalmologis normal pada semua hewan

pada tikus yang menggunakan kendaraan dan H1PV. Suhu dan frekuensi tubuh

31
serta jumlah buang air kecil dan buang air besar serupa antara hewan yang

disuntik dengan H1PV dan kendaraan dan tidak berbeda dari nilai sebelum

pengobatan.

Hewan kontrol positif berperilaku seperti yang diharapkan. Tikus kontrol

menunjukkan aktivitas lokomotor berkurang dan perhatian setelah pengobatan

dengan chlorpromazine dibandingkan dengan sebelum perawatan. Setelah

pengobatan dengan d-amfetamin, sebagian besar tikus menunjukkan gejala yang

diharapkan seperti air liur berlebihan dan peningkatan respons terhadap

penanganan, termasuk tanda-tanda agresivitas atau vokalisasi

6. Temuan Makroskopis

Pada tikus yang diinjeksi dengan kendaraan dan H1PV yang menjalani

nekropsi 48 jam setelah pemberian, temuan patologi kotor di otak menunjukkan

bukti pendekatan bedah yang digunakan untuk administrasi persiapan atau

pengencer virus. Situs aplikasi pada lobus frontal kanan otak dapat diidentifikasi

pada semua tikus kecuali 3 pada kelompok yang hanya menggunakan kendaraan.

Perubahan organ makroskopik sangat sedikit dan tidak terkait dengan item

tes. Pada semua tikus (H1PV dan kelompok kontrol), pembuluh darah abdominal

disuntikkan dengan darah, kemungkinan besar sebagai akibat dari suntikan

intraperitoneal yang diperlukan selama euthanasia dan kurangnya pengusiran jauh

saat nekropsi

7. Histopatologi

Situs injeksi Pada kebanyakan tikus, pemeriksaan histologis dari tempat

injeksi intracerebral menunjukkan perdarahan minimal hingga nekrosis atau

32
malacia, minimal vaskulitis dan perivaskulitis ringan atau ringan (Gambar 2 E),

dan infiltrat meningeal minimal hingga ditandai (Gambar 2 F). Lesi histologis

terkait tempat injeksi diklasifikasikan berdasarkan tingkat keparahan dan jumlah

hewan yang terpengaruh (Tabel 4). Perbandingan insiden kelompok dan tingkat

keparahan mengungkapkan bahwa tingkat keparahan rata-rata vaskulitis-

perivaskulitis dan infarkrat meningeal terkait situs tampaknya sedikit lebih tinggi

pada tikus yang diobati dengan H1PV dosis tinggi. Perbedaannya adalah minimal

saja, dan, mengingat variasi antarindividu, tidak dianggap sebagai bukti yang

jelas dari efek buruk terkait tes-item (Gambar 2A sampai D). Namun, hubungan

dengan persiapan virus yang disuntikkan tidak dapat dikecualikan secara definitif

8. Parenkim Dan Meninge Otak

Temuan histologis otak lainnya adalah meningeal difus atau kongesti

atau perdarahan parenkim, yang terdapat pada sebagian besar bagian otak. Tidak

ada hubungan dengan item tes yang dapat ditunjukkan. Oleh karena itu perubahan

ini dianggap sebagai hasil dari prosedur teknis euthanasia dan necropsy tanpa

exsanguination.

B. PEMBAHASAN

Studi-studi ini dilakukan untuk membahas bioavailabilitas, biodistribusi,

dan potensi toksisitas SSP H1PV sebagai bagian dari pengujian toksikologi yang

diperlukan selama persiapan untuk uji klinis pada pasien tumor otak. Semua tes

dilakukan pada tikus, inang alami virus, karena sistem model ini permisif untuk

replikasi virus, mungkin meningkatkan efek samping yang relevan dari infeksi

H1PV. Semua injeksi dilakukan dengan H1PV yang sangat murni yang

diproduksi dengan standar GMP, sebagaimana wajib untuk penggunaan klinis

33
pada pasien, sehingga menjamin infektivitas dan kemurnian virus. Ketersediaan

hayati dan biodistribusi dinilai dengan kuantifikasi qPCR dari jumlah genom yang

ada. Karena H1PV kompeten-replikasi dan karena itu memiliki potensi untuk

menginfeksi dan bereplikasi di jaringan normal, kadar asam nukleat virus

dikuantifikasi untuk dapat mendeteksi perubahan yang relevan. Namun, karena

keberadaan genom virus tidak setara dengan keberadaan partikel virus menular,

studi ini tidak cocok untuk menilai infektivitas hewan yang disuntikkan H1PV.

Investigasi mengungkapkan informasi berharga tentang keamanan virus

setelah berbagai rute administrasi. Selain itu, penelitian ini mengkonfirmasi

bahwa H1PV adalah nonpathogenik pada host alami bahkan pada injeksi

intracerebral langsung, setidaknya selama perjalanan waktu dan dalam

keterbatasan kondisi eksperimental. Lebih lanjut, penyelidikan menyediakan

informasi baru tentang sifat biologis H1PV pada tikus, termasuk lewatnya virus

melalui sawar darah-otak, rute utama eliminasi virus, dan pelepasan virus.

Namun, karena tikus adalah yang alami host H1PV, distribusi dan eliminasi virus

pada manusia kemungkinan besar akan berbeda. Apapun, informasi yang

diperoleh dalam penyelidikan ini menghasilkan arahan penting untuk perencanaan

yang tepat dari uji klinis pertama pada manusia.

Paparan sistemik untuk H1PV hanya menyebabkan perbedaan kecil antara

kedua rute administrasi, menunjukkan ketersediaan sistemik yang tinggi setelah

pemberian intraserebral. Temuan ini mungkin memiliki implikasi penting untuk

penggunaan klinis H1PV sehubungan dengan efikasi dan keamanan. H1PV adalah

salah satu virus terkecil dan dapat dengan mudah melewati sawar darah-otak,

34
bahkan tanpa adanya tumor otak eksperimental, yang diketahui memiliki

kemampuan untuk mengkompromikan fungsi sistem ini.3 Karena perbedaan

substansial dalam darah virus konsentrasi antara kedua rute pemberian hanya

terjadi dalam satu jam pertama setelah injeksi dan karena waktu untuk mencapai

konsentrasi darah maksimal setelah pemberian intraserebral berada dalam kisaran

0,5 hingga 2 jam, tingkat viral load yang tinggi melalui sawar darah-otak adalah

mungkin. Atribut ini terutama ditunjukkan oleh adanya DNA H1PV di jaringan

otak setelah injeksi intravena. Karena tikus tidak diberi perfusi setelah eutanasia,

kemungkinan kecil kontaminasi sampel jaringan otak dengan darah yang

mengandung DNA virus. Namun, mengingat bahwa proporsi pembuluh darah

yang mengandung per volume jaringan otak kortikal dihitung menjadi kurang dari

2% dan bahwa konsentrasi genom virus lebih tinggi dalam jaringan otak daripada

dalam darah, kesimpulan dari penetrasi virus di seluruh darah - sawar otak dapat

dibuat. Berdasarkan temuan ini bersama dengan serangkaian data praklinis

tambahan, sebagian pasien dalam uji klinis yang sedang berlangsung akan dirawat

dengan injeksi intravena sebelum dilakukan reseksi tumor. Jaringan tumor yang

resected akan diuji untuk keberadaan genom virus, sebagai indikator distribusi

virus di seluruh penghalang darah-otak manusia

Distribusi organ tidak menunjukkan perbedaan substansial setelah

intravena dibandingkan dengan pemberian H1PV intracerebral. Hanya setelah

injeksi intracerebral jaringan otak dan pengeringan kelenjar getah bening

mandibula mengandung tingkat genom virus yang lebih tinggi daripada yang

dicapai setelah pemberian intravena. Untuk jaringan otak, perbedaan ini dapat

35
dideteksi sepanjang periode pengamatan 14-hari. Hasil ini kemungkinan besar

disebabkan oleh distribusi awal virus ke semua organ tubuh setelah injeksi

intravena, sehingga secara substansial mengurangi jumlah yang tersedia untuk

perjalanan melalui sawar darah-otak. Sebaliknya, setelah pemberian intraserebral,

proporsi yang lebih tinggi dari inokulum tetap berada di dalam jaringan otak

meskipun menunjukkan distribusi virus dari otak ke kompartemen ekstraCNS.

Pada kelenjar getah bening mandibula, jumlah genom virus, yang lebih tinggi

pada titik waktu awal setelah injeksi intraserebral dibandingkan dengan injeksi

intravena, hampir menyamakan pada hari ke-14. Karena getah bening otak

mengalir ke serviks (terutama) dan berdekatan ( kelenjar getah bening mandibula,

perbedaan temporal dalam jumlah virus di lokasi-lokasi ini mungkin terkait

dengan pembersihan limfatik dari benda uji dari otak

Lebih lanjut, injeksi intravena tunggal atau intracerebral 7,96 × 107 pfu

H1PV cukup untuk mempertahankan genom H1PV dalam darah bahkan 14 hari

setelah pemberian. Distribusi H1PV tersebar luas, dengan sinyal virus positif

diperoleh di semua organ yang diuji, dan tidak ada temuan spesifik jenis kelamin

yang relevan terkait dengan distribusi jaringan. Penumpahan virus dan ekskresi

terjadi terutama melalui tinja, yang terus tes positif untuk genom virus 14 d

setelah injeksi. Sampel urin dan usap mulut menunjukkan sinyal virus-positif

terutama selama 7 hari pertama, dan konsentrasi genom virus lebih rendah dalam

urin dan air liur daripada di tinja.

Tingkat virus menurun dari waktu ke waktu di semua organ dan darah

yang diuji, sehingga tidak ada bukti untuk replikasi virus, setidaknya pada tingkat

36
yang lebih tinggi di bawah kondisi penyelidikan ini. Karena pengujian untuk

partikel virus infeksi aktif, viral load, atau protein virus berada di luar ruang

lingkup informasi yang diperlukan untuk persetujuan penggunaan klinis dari

persiapan virus yang diselidiki dalam penelitian ini, kemungkinan replikasi virus

tingkat rendah dalam jaringan normal tidak dapat sepenuhnya dikecualikan

sepenuhnya. berdasarkan hasil kami. Selain itu, tidak mungkin untuk

mengidentifikasi situs organ yang mungkin di mana persistensi virus dapat terjadi.

Temuan saat ini menunjukkan bahwa pemeriksaan rinci tambahan diperlukan

untuk lebih menjelaskan bagaimana H1PV bertahan dalam populasi hewan

pengerat.

Untuk menilai toksisitas otak, H1PV disuntikkan ke otak pada 3 tingkat

dosis. Karena volume injeksi di otak dibatasi hingga 10 μL, dosis tertinggi adalah

7,96 × 107 pfu, jumlah maksimal partikel virus dalam stok yang tidak diencerkan.

Investigasi histopatologis menunjukkan perubahan nyata yang mengindikasikan

peradangan di tempat injeksi serta di tempat yang jauh pada kelompok dosis

sedang dan tinggi. Karena bahan yang disuntikkan mengandung partikel virus,

temuan ini diharapkan dan tidak dianggap cukup parah untuk menjadi bukti yang

jelas untuk patologi yang signifikan terkait virus setelah injeksi langsung H1PV

ke otak. Namun, tidak dapat sepenuhnya dikesampingkan bahwa H1PV dapat

menyebabkan toksisitas lokal ketika diberikan pada tingkat dosis yang lebih tinggi

atau setelah periode pengamatan yang lebih lama dari 48 jam. Tidak ada patologi

organ makroskopik terkait pengobatan yang terkait dengan pemberian wahana

atau persiapan H1PV yang terlihat dalam penelitian ini, tetapi karena histopatologi

37
dilakukan hanya pada jaringan otak, perubahan mikroskopis pada jaringan lain

tidak dapat dikecualikan. Untuk menjawab pertanyaan ini, pemeriksaan histologis

terperinci dari semua organ sampel dilakukan selama 28-d studi toksikologi dosis

berulang intravena pada tikus, yang hasilnya dilaporkan di tempat lain

Pengaruh administrasi intracerebral tunggal H1PV pada fungsi sistem saraf

pusat dan otonom dinilai berdasarkan prosedur skrining IRWIN yang

dimodifikasi, yang meliputi pengamatan aktivitas spontan di lapangan terbuka dan

pemeriksaan neurologis terperinci. Pengujian ekstensif ini tidak menunjukkan

kelainan klinis atau perilaku, sejalan dengan kurangnya temuan patologis yang

signifikan di otak. Karena perilaku menyimpang atau patologis dapat terjadi tanpa

adanya perubahan struktural terkait arsitektur otak, analisis mendalam ini

menambah informasi fungsional yang berharga untuk melengkapi bukti histologis

38
 BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN

H1PV menunjukkan karakteristik kinetik yang menguntungkan untuk

kemungkinan penggunaan terapi. Secara khusus, virus dapat dengan cepat

melewati sawar darah-otak dan menyebar luas bahkan setelah injeksi lokal. Fitur-

fitur ini mendukung alasan yang menguntungkan untuk pengobatan tumor otak

oleh administrasi lokal maupun sistemik dari agen ini. Selain itu, tidak ada tanda-

tanda patologi morfologis atau fungsional yang relevan yang diamati setelah

pemberian H1PV otak ke tikus Wistar. Data yang diperoleh pada distribusi

jaringan dan keamanan SSP dari H1PV pada spesies hewan yang relevan (yaitu,

tikus) mendukung asumsi distribusi jaringan yang baik dan tolerabilitas yang baik

pada manusia

B. SARAN

Masih perlu dilakukan penelitian-penelitian kedepannya untuk

pengembangan penggunaan Intraserebral pada penyakit-penyakit yang menjadi

penyebab kematian terbesar

39
 DAFTAR PUSTAKA

Angelova AL, Aprahamian M, Balboni G, Delecluse HJ, Feederle R, Kiprianova

I, Grekova SP, Galabov AS, Witzens-Harig M, Ho AD, Rommelaere J,
Raykov Z. 2009. Oncolytic rat parvovirus H1PV, a candidate for the
treatment of human lymphoma: in vitro and in vivo studies. Mol Ther
17:1164–1172.

Angelova AL, Aprahamian M, Grekova SP, Hajri A, Leuchs B, Giese NA,

Dinsart C, Herrmann A, Balboni G, Rommelaere J, Raykov Z. 2009.
Improvement of gemcitabine-based therapy of pancreatic carcinoma by
means of oncolytic parvovirus H1PV. Clin Cancer Res 15:511–519.
Black KL, Ningaraj NS. 2004. Modulation of brain tumor capillaries for enhanced
drug delivery selectively to brain tumor. Cancer Control 11:165–73.
Bundesministeriums der Justiz. [Internet]. 2001. Gesetz zur Verhütung und
Bekämpfung von Infektionskrankheiten beim Menschen
(Infektionsschutzgesetz - IfSG). [Cited November 2014]. Available at
http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/ifsg/gesamt.pdf
Bundesministeriums der Justiz. [Internet]. 2009. Tierschutzgesetz in der Fassung
der Bekanntmachung vom 18. Mai 2006 (BGBl. I S. 1206,1313), das zuletzt
durch das Gesetz vom 15. Juli 2009 (BGBl. I S. 1950) geändert worden ist".
[Cited November 2014]. Available at http://www.gesetze-im-
internet.de/tierschg/
Cornelis JJ, Deleu L, Koch U, Rommelaere J. 2006. Parvovirus oncosuppression,
p 365–384. In: Kerr JR, Cotmore SF, Bloom ME, Linden RM, editors. The
parvoviruses. London (UK): Hodder Arnold.
Dupressoir T, Vanacker JM, Cornelis JJ, Duponchel N, Rommelaere J. 1989.
Inhibition by parvovirus H1 of the formation of tumors in nude mice and
colonies in vitro by transformed human mammary epithelial cells. Cancer Res
49:3203–3208.
Easterbrook JD, Kaplan JB, Glass GE, Watson J, Klein SL. 2008. A survey of
rodent-borne pathogens carried by wild-caught Norway rats: a potential threat
to laboratory rodent colonies. Lab Anim 42:92–98.
European Medicines Agency. [Internet]. 2009. ICH guideline M3(R2) on non-
clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing
authorisation for pharmaceuticals. [Cited November 2014]. Available at:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/
document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002720. pdf
Ferm VH, Kilham L. 1963. Rat virus (RV) infection in fetal and pregnant
hamsters. Proc Soc Exp Biol Med 112:623–626.

40
Ferm VH, Kilham L. 1964. Congenital anomalies induced in hamster embryos
with H1 virus. Science 145:510–511.
Geletneky K, Huesing J, Rommelaere J, Schlehofer JR, Leuchs B, Dahm M,
Krebs O, von Knebel Doeberitz M, Huber B, Hajda J. 2012. Phase I/IIa study
of intratumoral/intracerebral or intravenous/intracerebral administration of
parvovirus H1 (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent
glioblastoma multiforme: ParvOryx01 protocol. BMC Cancer 12:99.
Geletneky K, Kiprianova I, Ayache A, Koch R, Herrero YCM, Deleu L, Sommer
C, Thomas N, Rommelaere J, Schlehofer JR. 2010. Regression of advanced
rat and human gliomas by local or systemic treatment with oncolytic
parvovirus H1 in rat models. Neuro-oncol 12:804–814.
Herrero YCM, Cornelis JJ, Herold-Mende C, Rommelaere J, Schlehofer JR,
Geletneky K. 2004. Parvovirus H1 infection of human glioma cells leads to
complete viral replication and efficient cell killing. Int J Cancer 109:76–84.
Geletneky K, Leoni A, Pohlmeyer-Esch G, Loebhard S, Baetz A, Leuchs B,
Roscher B, Hoefer C, Jochims K, Dahm M, Huber B, Rommelaere J, Krebs
O, Hajda J. 2014. Pathology, Organ Distribution, and Immune Response after
Single and Repeated Intravenous Injection of Rats with Clinical-Grade
Parvovirus H1.Comp Med in press
Irwin S. 1968. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic,
quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of
the mouse. Psychopharmacologia 13:222–257.
Kilham L, Ferm VH. 1964. Rat virus (RV) infections of pregnant, fetal, and
newborn rats. Proc Soc Exp Biol Med 117:874–879.
Kilham L, Margolis G. 1969. Transplacental infection of rats and hamsters
induced by oral and parenteral inoculations of H1 and rat viruses (RV).
Teratology 2:111–123.
Moscardo E, Maurin A, Dorigatti R, Champeroux P, Richard S. 2007. An
optimised methodology for the neurobehavioural assessment in rodents. J
Pharmacol Toxicol Methods 56:239–255.
Organisation for Economic Co-operation and Development. [Internet]. 1997.
OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice (GLP) and
Compliance Monitoring. [Cited November 2014]. Available at
http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydo
cumentpdf/?cote=env/mc/chem(98)17&doclanguage=en
Patt S, Sampaolo S, Theallier-Janko A, Tschairkin I, Cervos-Navarro J. 1997.
Cerebral angiogenesis triggered by severe chronic hypoxia displays regional
differences. J Cereb Blood Flow Metab 17:801–806.

41
Rommelaere J, Geletneky K, Angelova AL, Daeffler L, Dinsart C, Kiprianova I,
Schlehofer JR, Raykov Z. 2010. Oncolytic parvoviruses as cancer
therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev 21:185–195.
Soike KF, Iatropoulis M, Siegl G. 1976. Infection of newborn and fetal hamsters
induced by inoculation of LuIII parvovirus. Arch Virol 51:235–241.
Tattersall P. 2006. The evolution of parvoviral taxonomy, p 5–14. In: Kerr JR,
Cotmore SF, Bloom ME, Linden RM, Parrish CR, editors. The parvoviruses.
London (UK): Hodder Arnold.
Toolan HW, Ledinko N. 1968. Inhibition by H1 virus of the incidence of tumors
produced by adenovirus 12 in hamsters. Virology 35:475–478.
Toolan HW, Rhode SL 3rd, Gierthy JF. 1982. Inhibition of 7,12-
dimethylbenz(a)anthracene-induced tumors in Syrian hamsters by prior
infection with H1 parvovirus. Cancer Res 42:2552–2555.
Wrzesinski C, Tesfay L, Salome N, Jauniaux JC, Rommelaere J, Cornelis J,
Dinsart C. 2003. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the
contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and
identify a DNA sequence that restricts parvovirus H1 in mouse cells. J Virol
77:3851–3858.

42