Gel elektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk

memisahkan dan mengidentifikasi makromolekul seperti DNA, RNA atau protein

berdasarkan ukuran, bentuk dan isoelektrik. Pemisahan ini berdasarkan pada
migrasi molekul yang bermuatan melalui matriks gel. Dalam mengkarakterisasi
campuran protein kompleks, sering dilakukan dengan gel ekeltroforesis dengan
matriks poliakrilamid, atau yang dikenal dengan polyacrylamide gel
electrophoresis (PAGE) karena mudah, cepat dan tidak mahal.
Protein memiliki muatan elektrik bila berada pada medium dengan pH yang
berbeda dengan pH isoelektriknya, sehingga mampu berpindah pada medium
elektrik. Kecepatan migrasi protein tergantung pada rasi antara muatan protein
dan massanya. Semakin tinggi muatan per unit massa, semakin cepat protein
bermigrasi.
Protein memiliki struktur yang beragam, sehingga kecepatan migrasinya
tidak sama dan tidak dapat bermigrasi pada titik isoelektriknya. Sehingga, protein
perlu didenaturasi dengan menambahkan suatu detergen ampifatik seperti sodium
dodecyl sulfate (SDS) dalam pemisahan protein berdasarkan berat molekulnya.
SDS merupakan agen pereduksi, bermuatan anion pada bagian kepala dan lipofil
pada bagian ekor, yang merusak ikatan disulfide menjadi gugus sulfidril,
memisahkan protein menjadi beberapa sub-unit dan memberikan muatan negatif
agar dapat bermigrasi melalui gel menuju anoda dan terpisah sesuai ukurannya.
Proses denaturasi ini juga menyebabkan protein kehilangan struktur tersiernya
sehingga kecepaatan migrasi protein sebanding dengan ukuran dalam bentuk
linear, bukan pada struktur tersier.
SDS PAGE merupakan gel yang terbentuk dari polimerisasi alrilamid
dengan metilen bisakrilamid. Proses polimerisasi ini terjadi dengan adanya katalis
dan inisiator berupa TEMED dan ammonium perosulfat (APS) yang menginisiasi
pembentukan polimer. Campuran protein ditambahkan dengan detergen ionik
SDS sebelum dan selama elektroforesis. SDS mendenaturasi protein menjadi
subunitnya dan rantai polipeptida diperpanjang konformasinya. Kopleks protein-
SDS menjadi bermuatan negatif dimana protein berukuran besar akan memiliki
muatan negatif yang lebih besar. Hal ini menyebabkan kecepatan migrasi protein
hanya dipengaruhi oleh panjang rantai dan massa protein. Protein memiliki ikatan
hidrofobik yang signifikan dan memungkinkan berikatan kuat dengan molekul
lainnya, seperti lipid, melalui interaksi hidrofobik. Pemanasan sampel pada suhu
minimal 60 °C dapat merusak molekul tersebut, sehingga memudahkan SDS
untuk berikatan dengan daerah hidrofob dan menyempurnakan denaturasi.
Sebelum melakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrikalamid, gel
harus dibuat dulu dengan prinsip polimerisasi antara akrilamid dan bis-akrilamid
dengan menggunakan katalis ammonium persulfat dan tetremetilendiamid
(TEMED). Dalam pembuatan gel dibuat dua jenis gel yakni stacking gel dan
separating gel, Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena
digunakan untuk mencetak sumur DNA (well ), selain itu digunakan untuk
menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum
protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan
sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Sedangkan
separating gel berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan
berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu sodium dodesil
sulfat 10% sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein
dapat terpisah berdasarkan ukurannya
Untuk membuat gel poliakrikalamid pertama dibuat terlebih dahulu
melakukan uji kebocoran dari alat cetakan untuk gel dengan cara memasukan
aquades dan kemuadian dikatakan apakah terjadi kebocoran pada alat cetakan
tersebut. Setelah itu, dibuatlah larutan campuran separating gel dengan cara
memasukan aquades 3350µL, 30% Akrilamid 4000µL, dan larutan buffer 2500µL
ke dalam vial 5ml. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori
gel pada proses pemisahan gel. Setelah itu dimasukkan 10% APS 50µL dan
TEMED 10µL secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi proses
polimerisasi secara sempurna. APS dan TEMED didigunakan sebagai katalisator
untuk mempercepat proses polimerisasi pada gel. Setelah itu diaduk supaya
homogen. Sebelum separating gel dimasukkan ke dalam cetakan, terlebih dahulu
kaca loading dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades sampai bersih
kemudian di lap searah menggunakan tisu, hal ini bertujuan agar kaca tidak
tergores sehingga mempengarui proses analisis yang dilakukan. Setelah itu kaca
loading dipasang pada alat elektroforesis, separating gel yang telah dibuat
dimasukkan kedalam cetakan dengan menggunakan mikropipet sampai pada batas
yang ditentukan yakni sekitar ¾ bagian dan ¼ bagian sisanya digunakan untuk
stacking gel. Setelah itu gel dibiarkan terpolimerisasi dalam suhu ruang selama 15
menit. Kemudian dituangkan sedikit aquades untuk membuat permukaan
separating gel datar/gel yang dibentuk tidak bergerigi yang dapat menyebabkan
adanya sekat diantara separating gel dengan stacking gel yang dapat mengganggu
proses pemisahan molekul. Aquades yang ditambahkan kemudian diserap dengan
menggunakan tisu agar tidak mempengaruhi gel yang terbentuk.
Selanjutnya dibuat stacking gel (gel pengumpul). Cara pembuatan stacking
gel hampir sama dengan pembuatan separating gel, yang membedakan yaitu
banyaknya atau jumlah yang ditambahkan. Langkah-langkah pembuatanya yaitu
pertama dimasukkan aquades 1525µl, 30% Akrilamid 325µL, dan buffer 625µL
kedalam vial 5 ml. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori
gel. Setelah itu dimasukkan 10% APS 15 µL dan TEMED 10µL secara bersamaan
dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. APS dan
TEMED didigunakan sebagai katalisator untuk mempercepat proses polimerisasi
pada gel. Setelah itu diaduk supaya homogen. Langkah selanjutnya yaitu
memasukkan stacking gel diatas gel pemisah dan disisipkan gigi sisir yang
berfungsi untuk mencetak sumur (well) yang akan digunakan sebagai tempat
meneteskan sampel. Gigi sisir dibiarkan sampai gel terpolimerisasi pada suhu
ruang selama 15 menit. Setelah terbentuk sumuran selanjutnya gigi sisir diambil
dari gel. Gel yang telah terbentuk kemudian dipindahkan kedalam tank
elektroforesis dan siapkan digunakan untuk proses selanjutnya.
pH yang digunakan dalam separating gel yaitu, 8,8 agar didapatkan protein
tetap dalam keadaan muatan negatif. pH stacking gel yang dibuat 6,8 bertujuan
agar kondisi pH-nya berada di bawah pH isoelektrik protein (pH 8) sehingga
protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking gel.
Sampel protein yang akan digunakan untuk elektroforesis ditambahkan
dengan buffer sampel yang terdiri dari 0,6 mL trisHCl 1 M pH 6,8; 5 mL gliserol
50 %; 2 mL SDS 10 %; 0,5 mL 2-merkaptoetanol; 1 mL bromofenol biru 1 %;
dalam 10 mL air suling, dengan perbandingan sampel: sampel buffer = 1:1,
kemudian dipanaskan dalam air selama 10 menit pada suhu 60oC agar
memudahkan SDS untuk berikatan dengan daerah hidrofob protein. Fungsi utama
SDS yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis
karena SDS merupakan deterjen anionic. 2-mercaptoetanol berfungsi untuk
mereduksi ikatan disulfida pada protein. Pewarna biru bromofenol berfungsi
untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis. Campuran ini
dimasukkan ke dalam sumur pada gel elektroforesis sebanyak maksimal 20 μL.
Pada praktikum kali ini tidak digunakan protein marker karena sampel protein
yang digunakan sudah dalam bentuk protein tunggal yaitu protein BSA.
Running buffer yang digunakan dibuat dari Trisma basa, glisin, SDS dan
air suling dengan pH 8,3. Larutan buffer dibuat pH 8,3 untuk menjaga kondisi
fisiologis dari protein dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas
titik isoelektrik. Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer dan
digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya tidak terendam maka arus listrik
tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang selanjutnya digunakan untuk
analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking gelnya dibuang karena
band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja. Running dilakukan
dengan tegangan konstan 150 volt selama 45 menit.
Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu
untuk dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang
terseparasi atau terpisah. Gel hasil elektroforesis dilepaskan dari rangkaian alat
elektroforesis kemudian direndam dengan larutan staining. Larutan staining yang
digunakan dalam praktikum ini yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB
ini memiliki sensitivitas yang tinggi bahkan terhadap protein yang memiliki
ukuran terkecil yaitu 0,5 µg/cm2. Kemudian gel yang sudah terendam larutan
staining digoyangkan menggunakan shaker untuk mengoptimalkan reaksi staining
oleh CBB. Lalu dilakukan pencucian dengan aquades. Pencucian dengan aquades
berfungsi untuk membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa
pada gel. Untuk proses selanjutnya seharusnya dilakukan perendaman dengan
larutan destaining selama 24 jam untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan
memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang
tidak berada pada band protein. Namun pada praktikum kali ini tidak dilakukan
proses destaining karena hanya dengan membilas gel dengan aquades saja sudah
dapat terlihat pita-pita proteinnya berwarna biru lebih gelap daripada background
gel yang juga terwarnai oleh CBB.
Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa
campuran protein secara kualitatif adalah SDS PAGE. Elektroforesis dilakukan
dengan menempatkan larutan sampel yang sudah dipreparasi ke dalam sumur SDS
PAGE lalu dialirkan arus listrik. Molekul dari protein yang sudah bermuatan
negative akibat penambahan SDS akan bermigrasi menuju kutub positif.
Pemisahan molekul protein berdasarkan pada tingkat migrasi dan berat
molekulnya dalam sebuah medan listrik.
Hasil yang didapatkan berupa satu pita, hasil tersebut menandakan bahwa
sampel protein yang digunakan telah murni bukan hasil eskpresi protein dari
E.coli. Pada praktikum juga tidak digunakan marker. Protein yang digunakan
yaitu BSA (Bovine Serum Albumin) yang berasal dari sapi. Protein BSA ini
memiliki berat molekul 66.500 Da atau 66,5 KDa. BSA merupakan protein
globular yang tersusun dari 20 asam amino esensial dalam struktur yang terdiri
dari asam amino terbanyak yaitu leusin kemudian lisin. BSA ini banyak
digunakan sebagai penstabil untuk protein terlarut lainnya atau enzim yang labil.
Selain itu BSA sering digunakan sebagai standar pada kalibrasi protein untuk
menentukan kuantitas protein lainnya.

SIMPULAN
Dapat dipahami teknik untuk pemisahan sampel DNA berdasarkan ukuran (berat
molekul) dan strukur fisik molekul menggunakan elektroforesis gel agarosa
dengan sampel yang digunakan yaitu protein BSA.