Material dan metode

Prinsip
1. Disk ditinju dari lot yang sama
kertas saring yang sebelumnya
jenuh mengandung darah yang sama
jumlah darah.
2. Disk standar dapat dibuat dari
spesimen darah dengan konsentrasi F EP diketahui.
3. Fluoresensi disk diperoleh
dari darah pasien dibandingkan
dengan disk standar. Dari ini
data, nilai F E P untuk pasien
darah bisa dihitung.
4. Konsentrasi FEP secara eksponensial
terkait dengan kadar timbal dalam darah.5

Reagen
Semua pereaksi digunakan tanpa lebih jauh pemurnian. Reagen termasuk filter kertas 8,2 cm dengan diameter
dan seng protoporphyrin IX. f

Solusi standar
Sebuah botol berisi 5,6 ara seng protoporphyrin IX digunakan. seratus dari solusi solvating khusus, Protosolvf,
ditambahkan ke botol yang dikocok selama sepuluh menit. Kemudian 10,0 ml asam hidroklorat 1,5 N, yang
sebelumnya telah jenuh dengan asam asetat etilasetat (4: 1 berdasarkan volume), ditambahkan. Pada
penambahan asam klorida, seng protoporphyrin IX membentuk 5,0 ara protoporphyrin IX. Solusi stok ini
mengandung 0,50 ara per ml protoporphyrin IX. Protoporfirin diencerkan sepuluh kali lipat dengan asam klorida
yang sama untuk membentuk larutan kerja yang mengandung 0,05 ara per ml yang digunakan setiap hari untuk
mengkalibrasi eter spektrofluorom. Panjang gelombang maksimal untuk protoporphyrin IX adalah panjang
gelombang eksitasi 405 nm dan panjang gelombang anemisi 610 nm. Solusi ini harus disiapkan setiap hari.
Asam hidroklorat jenuh dengan larutan asam asetat etilasetat sehingga protoporfirin IX dilarutkan dalam pelarut
yang sama dengan yang tidak diketahui spesimen darah.

Aparat Khusus
Semua fluoresensi adalah dibuat dengan spektrofluorometer menggunakan tabung photomultiplier R 136 sensitif
merah. Spektrofluorometer harus memiliki sensitivitas yang memadai sehingga 0,05 fig per ml protoporphyrin
IX dalam 1,5 N HC1 (tanpa saturasi asam asetat etilasetat sebelumnya) dapat diatur untuk membaca intensitas
relatif 0,80 pada maksimum maxima protoporphyrinIX (eksitasi 405 nm dan emisi 610 nm) panjang gelombang.

Prosedur
Jari pasien digosok selama satu menit dengan kain kasa yang telah direndam dalam larutan yang mengandung 2
persen asam sitrat dan 70 persen etanol. Setelah pengeringan, film collodion fleksibel kemudian diterapkan.
Ketika ini mengeringkan jari tertusuk dan empat bercak darah dikumpulkan pada kertas saring. Bintik darah
harus berdiameter sekitar 2,5 cm. Saat darah mengering, cakram dilubangi kertas. Tiga bintik rem dipertahankan
untuk kemungkinan penggunaan dalam uji timbal mikro. Disk darah lA inci ditempatkan ke dalam tabung reaksi
dan 0,3 ml larutan berair yang mengandung 5 persen celite dan 0,5 persen sterox ditambahkan. Disk
diperbolehkan berdiri pada suhu kamar selama 15 menit dengan sesekali bergetar. Dua ml larutan asam
etilasetat-asetat (4: 1) ditambahkan. Isi tabung dicampur secara menyeluruh pada mixer Vortex selama sepuluh
detik. tabung reaksi kemudian disentrifugasi pada 1800 rpm selama 30 detik. Supernatan dituang ke tabung
reaksi lain. Dua ml asam hidroklorat 1,5 N ditambahkan dan kedua lapisan diaduk pada mixer Vortex selama
sepuluh detik. Setelah dua fase terpisah, lapisan etilasetat atas dihilangkan dengan aspirasi, dan larutan asam
klorida adalah dipindahkan ke spektrofluorometer cuvet Intensitas relatif asam klorida dibaca dalam
spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 405 nm dan emisi em dengan panjang gelombang 610 nm
yang telah dikalibrasi dengan larutan 0,05 ara per ml dari protoporphyrin IX. Suatu blanko reagen, yang terdiri
dari piringan kertas saring tanpa darah, dianalisis secara perlahan. Intensitas relatif yang diperoleh untuk blanko
dikurangi dari masing-masing spesimen uji.
Penyusunan Standar
Lima spesimen darah vena yang telah dianalisis sebelumnya untuk timbal digunakan untuk menyiapkan kurva
standar F EP. Tiga dari spesimen yang dipilih harus memiliki kadar timbal antara 40 hingga 60 ara per 100 ml
darah, dan satu spesimen harus memiliki kadar timbal di atas 60 ara per 100 ml darah. Kadar FE P dari spesimen
darah ini ditentukan dengan menggunakan prosedur yang dijelaskan sebelumnya kecuali bahwa 20 fjd seluruh
darah digunakan sebagai pengganti cakram yang direndam darah dan 0,10 ml campuran yang mengandung
celite dan sterox.