Tumor Necrosis Factor (TNF)- Menghambat Pensinyalan Insulin melalui

Stimulasi Reseptor TNF p55 dan Aktivasi Sphingomyelinase

Tumor necrosis factor (TNF)- berperan penting dalam keadaan resistensi insulin,
berhubungan dengan obesitas. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa salah satu
mekanisme penting dimana TNF- mengganggu pensinyalan insulin adalah
melalui serin fosforilasi dari substrat reseptor insulin-1 (insulin receptor
substrate-1, IRS-1), kemudian berfungsi sebagai penghambat aktivitas tirosin
kinase dari reseptor insulin (insulin receptor, IR). Tetapi reseptor dan jalur
pensinyalan yang digunakan oleh TNF- dan memediasi penghambatan aktivitas
IR tidak diketahui. Kami menunjukkan di sini bahwa TNF- manusia mengikat
hanya untuk reseptor TNF (TNF receptor, TNFR) p55 murine, efektif
menghambat fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 bergantung insulin dalam sel adiposit
dan myeloid 32D sebagai TNF-murine mengikat pFR TNFR dan p75 TNFR.
Demikian juga, antibodi yang merupakan agonis spesifik untuk p55 TNFR atau
p75 TNFR menunjukkan bahwa stimulasi p55 TNFR cukup untuk menghambat
pensinyalan insulin, meskipun efek kecil juga dapat dilihat dengan antibodi
terhadap p75 TNFR. Sphingomyelinase dan ceramide eksogen, diketahui dibentuk
dengan aktivasi p55 TNFR, menghambat fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 dan
mengubah IRS-1 menjadi inhibitor IR tirosin kinase in vitro. Sel-sel myeloid 32D
yang mengekspresikan IR dan IRS-1 sensitif terhadap penghambatan ini, tetapi
sel-sel yang mengekspresikan IR dan IRS-2 resisten, menunjukkan perbedaan
penting fungsi biologis antara IRS-1 dan IRS-2. Data ini menyarankan TNF-
menghambat pensinyalan insulin melalui stimulasi p55 TNFR dan aktivitas
sphingomyelinase, menghasilkan produksi bentuk penghambatan IRS-1.

Resistensi insulin didefinisikan sebagai respons lebih kecil terhadap dosis insulin

yang diberikan. Ini juga berhubungan dengan obesitas dan komponen utama

diabetes mellitus yang tidak tergantung insulin, kemungkinan mewakili hubungan

sebab akibat utama antara kedua gangguan ini. Resistensi insulin terlibat dalam
berbagai keadaan patologis seperti dislepidemia, aterosklerosis, dan gangguan

kardiovaskular. Sebanyak 30% populasi orang dewasa di Amerika Serikat

mengalami obesitas, pemahaman lebih baik tentang resistensi insulin adalah

tujuan ilmiah dan medis yang penting. Tetapi pemahaman kita tentang dasar

molekuler dari hubungan erat antara obesitas dan resistensi insulin sangat tidak

lengkap.

Beberapa garis bukti menunjukkan bahwa TNF- berperan penting dalam

resistensi insulin yang diamati pada obesitas. Adiposit berasal dari sebagian besar

hewan walaupun tidak semua hewan dengan kelebihan berat badan

mengekspresikan TNF-berlebihan terhadap rekan-rekan mereka yang kurus.

Pengamatan ini diperluas ke manusia di mana ekspresi TNF-  berkorelasi positif

kuat dengan tingkat obesitas dan tingkat hiperinsulinemia, sering digunakna

sebagai ukuran tidak langsung resistensi insulin. Baru-baru ini, menggunakan

reaksi berantai transkriptase-polimerase terbalik, TNF- juga terbukti

diekspresikan berlebih pada otot selama obesitas. TNF- berperan sebagai

penyebab resistensi insulin pada hewan percobaan saat netralisasi TNF- pada

tikus gemuk meningkatkan sensitivitas insulin mereka, karena peningkatan

bersamaan aktivitas tirosin kinase dari IR dalam jaringan adiposa dan otot. TNF-

terbukti mengganggu pensinyalan insulin dengan menghambat aktivitas tirosin

kinase IR dalam kultur sel. Pada tingkat molekuler, baru-baru ini ditunjukkan

bahwa TNF- menginduksi fosforilasi serin IRS-1, dan bentuk IRS-1 yang

dimodifikasi ini dapat berfungsi sebagai penghambat aktivitas tirosin kinase IR

secara in vitro dan dalam sel-sel utuh.

 Meskipun terdapat banyak bukti terhadap peran kunci TNF-, langkah-langkah

awal dimana sitokin ini menghambat pensinyalan insulin tidak diketahui. TNF-

berhubungan dengan afinitas tinggi terhadap dua reseptor yang memiliki domain

intraseluler yang sama sekali berbeda. Reseptor ini, p55 TNFR dan p75 TNFR,

adalah glikoprotein dengan domain transmembran tunggal. Kedua protein tidak

memiliki aktivitas enzimatik tetapi dapat berhubungan dengan beberapa protein

intraseluler berbeda. Meskipun jelas bahwa protein terkait berperan dalam

transduksi sinyal oleh reseptor ini, fungsi tepatnya tidak diketahui.

Kemampuan p55 TNFR dan p75 TNFR secara individual untuk memediasi

pensinyalan TNF- menjadi bidang studi aktif. p75 TNFR mengikat TNF-

dengan afinitas lebih tinggi dan dengan tingkat disosiasi lebih tinggi dari p55

TNFR (Kd dari 100 pM versus 500 pM dan t1∕2 dari 10 menit versus 3 jam). p55

TNFR terlibat dalam banyak proses biologis termasuk letalitas yang

disebabkan lipopolysaccharide- dan D-galactosamine dan produksi

interleukin-6 dan granulocyte macrophage-colony-stimulating factor dalam

fibroblast. p75 TNFR berhubungan dengan beberapa aktivitas biologis,

termasuk penghambatan hematopoiesis awal, induksi produksi sitokin,

aktivasi NFKB, dan kelimpahan tinggi p75 TNFR, kematian sel. Saat ini,

peran yang dimainkan oleh masing-masing reseptor TNF dalam resistensi insulin

tidak diketahui.

Kami menunjukkan di sini bahwa TNF- menghambat IR fosforilasi tyrosine

IR dan IRS-1 yang diinduksi insulin dalam dua garis sel yang mengekspresikan

gen untuk reseptor TNF p55 dan p75. Dengan menggunakan dua pendekatan
berbeda, stimulasi p55 TNFR sangat menghambat fosforilasi tirosin stimulasi

insulin dari IR dan IRS-1. Penghambatan fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 juga

diamati setelah pengobatan sel dengan sphingomyelinase dan analog sintetik dari

ceramide, mediator yang berhubungan dengan p55 TNFR. Sama dengan TNF-,

sphingomyelinase dan ceramide mengubah IRS-1 menjadi inhibitor aktivitas IR

tirosin kinase in vitro. Menariknya, efek ini sangat spesifik untuk IRS-1, karena

IRS-2 tidak dapat berfungsi sebagai inhibitor dalam pengujian ini.

BAHAN DAN METODE

Reagen - Antibodi terhadap reseptor insulin adalah pemberian dari Drs. B.

Cheatam dan CR Kahn, antibodi anti-phosphotyrosine diberikan oleh Dr. T.

Roberts, dan PDGF BB dan antibodi untuk reseptor PDGF  adalah pemberian

dari Dr C. Stiles. TNF- pada manusia dan tikus berasal dari Biosource

International. C2 ceramide (N-acetylsphingosine), C6 ceramide (N-

hexanoylsphingosine), dan sphingomyelinase dari Staphylococcus aureus berasal

dari Sigma.

Kultur Sel - Sel 3T3-L1 ditanam dan dibedakan menjadi adiposit seperti yang

dijelaskan sebelumnya. Setelah diferensiasi maksimal (setidaknya 90% sel

berdiferensiasi), media diganti dengan medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco

dengan 0,2% serum albumin sapi selama 2 hari dan kemudian ditambah dengan

ligan yang sesuai. Sel 32D-IR/IRS-1 dan 32IR/IRS-2 ditanam dalam suspensi

dalam RPMI 1640 ditambah dengan serum sapi (10%) dan media dengan kondisi

WEHI-3 (5%) sebagai sumber interleukin-3.

 Persiapan Ekstrak Sel, Immunoprecipitations, dan Western Blots - Setelah

pengobatan dengan TNF-, antibodi, ceramide, atau sphingomyelinase (6 jam

untuk adiposit 3T3-L1 dan 4 jam untuk 32D-IR/IRS-1), sel-sel dirangsang selama

3 menit dengan insulin (10-7M). Sel-sel dicuci dalam ice-cold phosphate-buffered

saline dan dilarutkan dalam stop buffer (50 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10

mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 100 mM NaF, 1% Triton X-100

(v/v), 10  g/ml aprotinin, 20 mM leupeptin, dan 0,18 mg/ml fenilmetilsulfonil

fluorida). Reseptor IR, IRS-1, dan PDGF diimunisasi dari ekstrak sel dengan

antibodi spesifik yang diserap oleh protein A-Sepharose (Pharmacia Bio tech Inc.)

selama 90 menit pada suhu 4°C. Setelah pencucian dalam stop buffer, buffer

Laemmli ditambahkan ke beads, direbus selama 3 menit, dan protein diserahkan

ke SDS-PAGE dalam kondisi reduksi pada gel poliakrilamida 7,5%. Protein

kemudian ditransfer ke membran polyvinylidene difluoride (Millipore), dan

analisis Western blot dilakukan menggunakan ECL Western blot kit (Amersham

Corp) sesuai dengan instruksi pabrik.

Eksperimen Rekonstitusi In Vitro - Wheat germ agglutinin-purified IR diberi

perlakuan dengan insulin 10-6 M selama 30 menit pada 4°C dalam buffer kinase

(30 mM Hepes, pH 7,2, 30 mM NaCl, 0,1% Triton (v/v )) dan diinkubasi dengan

IRS-1 atau IRS-2 imunopurifikasi yang diperoleh seperti dijelaskan di atas tetapi

dicuci dua kali dalam stop buffer dan tiga kali dalam kinase buffer. Fosforilasi IR

dimulai dengan menambahkan 15 M [-32P] ATP, 8 mM MnCl2, dan 4 mM

MgCl2 selama 1 jam pada suhu kamar. Reaksi dihentikan dengan penambahan

buffer Laemmli dan dianalisis dengan SDS-PAGE.

HASIL

TNF- Menghambat Pensinyalan Insulin dalam Sel 3ip3-L1 dan Sel Myeloid 32D

- Untuk menyelidiki reseptor TNF yang terlibat dalam resistensi insulin, kami

ingin menggunakan antibodi agonis yang telah digunakan sebagai aktivator

spesifik pFR TNFR dan p75 TNFR. Tetapi penelitian kami sebelumnya dalam

adiposit 3T3-F442A menunjukkan bahwa efek kuat terhadap pensinyalan reseptor

insulin membutuhkan waktu beberapa hari untuk berkembang dalam sel-sel ini.

Sejak antibodi digunakan pada sel-sel dan dapat diambil melalui reseptor Fc atau

dihancurkan, banyak baris sel yang disurvei untuk menemukan orang-orang yang

menunjukkan efek TNF relatif cepat pada pensinyalan insulin. Gambar 1

menunjukkan bahwa 6 jam pengobatan adiposit 3T3-L1 dengan murine TNF-

sangat menghambat fosforilasi tirosin yang distimulasi insulin dari IR dan IRS-1

pada dosis dari 10 hingga 50 ng/ml. Kami juga menyelidiki efek ini dalam sel

myeloid 32D-IR/IRS-1. Sel induk 32D memiliki tingkat IR rendah dan tidak ada

IRS-1 atau IRS-2 dan digunakan sebagai sistem model di mana komponen-

komponen ini direkayasa secara genetik ke dalam sel untuk mempelajari

mekanisme biokimia spesifik yang berhubungan dengan kerja insulin. Gambar 1

mengilustrasikan bahwa 4 jam perlakuan TNF- (dari 1 hingga 25 ng/ml)

menghambat fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 yang distimulasi oleh insulin dalam

sel-sel ini. Pada kedua garis sel, jumlah absolut IR dan IRS-1 tidak terpengaruh,

menunjukkan bahwa TNF- menginduksi cacat spesifik dalam stoikiometri

fosforilasi tirosin.

Stimulasi p55 TNFR Cukup untuk Menghambat Tyrosine Fosforilasi IR dan

IRS-1 Disebabkan Insulin - Sekarang ditetapkan bahwa TNF- manusia mengikat

ke murine p55 TNFR tetapi bukan murine p75 TNFR. Jadi dengan menggunakan

TNF- manusia versus tikus, ini menyediakan alat untuk membandingkan efek

stimulasi hanya satu jenis reseptor dengan aktivasi kedua reseptor. Sebagai

langkah pertama kami memverifikasi bahwa pengkodean mRNA kedua reseptor

ada dalam sel 32D-IR/IRS-1 dan adiposit 3T3-L1 (data tidak ditampilkan). TNF-

 tikus dan manusia dititrasi pada kedua garis sel, dan IR dan IRS-1 dianalisis

dengan anti-phosphotyrosine Western blot. Seperti yang diamati pada Gambar 2,

TNF- manusia dan tikus menghambat fosforilasi IR dan IRS-1 dengan potensi

sangat mirip di kedua jalur sel. Hasil ini menunjukkan bahwa stimulasi p55 TNFR

dengan sendirinya cukup untuk meniru efek penuh TNF-  pada inhibisi tirosin

kinase IR.

Baru-baru ini ditunjukkan bahwa antibodi poliklonal yang diarahkan ke p55

TNFR atau p75 TNFR dapat bertindak sebagai agonis pada reseptor ini, tanpa

reaksi silang. Dengan demikian, agen ini menyediakan sarana untuk mengaktifkan

kedua reseptor ini secara individual. Sel 32D-IR/IRS-1 dan 3T3-L1 diinkubasi

dengan 5 dan 15 g/ml antibodi poliklonal diarahkan p55 TNFR (AB55) atau p75

TNFR (Ab75), atau keduanya. Sel-sel kemudian diberi perlakuan dengan insulin,

dan IR dan IRS-1 di imunopresipitasi dan dianalisis dengan anti-phosphotyrosine

Western blot. Seperti yang diamati pada Gambar 3, Ab55 menghambat fosforilasi

tirosin IR dan IRS-1 dengan cara yang tergantung pada dosis pada 32D-IR/IRS-1

(7 dan 49% untuk IR dan 10 dan 45% untuk IRS-1) dan 3T3 -L1 adiposit (5 dan

55% untuk IR dan 15 dan 60% untuk IRS-1). Dalam sel 32D dan adiposit 3T3-L1,

Ab75 menginduksi sedikit penurunan fosforilasi IR dan IRS-1 tetapi hanya pada
dosis tertinggi. Dalam 32D-IR/IRS-1, masing-masing penghambat yang diinduksi

oleh Ab75 mencapai 15 ± 2% dan 20 ± 4% untuk IR dan IRS-1, dan di hadapan

Ab75, kemampuan Ab55 menghambat pensinyalan insulin meningkat pada cara

aditif (dari 49 ± 5% hingga 68 ± 4% untuk IR, dan dari 45 ± 6% hingga 63 ± 6%

untuk IRS-1 pada konsentrasi lebih tinggi, rata-rata ± SE dari tiga percobaan

berbeda). Inkubasi sel dengan adanya antibodi non-imun (Ni) tidak mengubah

kemampuan insulin untuk merangsang fosforilasi tirosin IR dan IRS-1.

Hasil ini tidak mengesampingkan kemungkinan bahwa penghambatan IR oleh

antibodi agonis disebabkan dengan penghambatan umum semua reseptor yang

diberikan dengan aktivitas tirosin kinase. Untuk menjawab pertanyaan ini,

adiposit 3T3-L1 diinkubasi dengan Ab55 dan Ab75 seperti dijelaskan di atas dan

diperlakukan dengan PDGF BB selama 10 menit. Reseptor PDGF

diimunopresipitasi dan dianalisis oleh anti-phosphotyrosine Western blot. Seperti

yang diamati pada Gambar 3B, fosforilasi tirosin dari reseptor PDGF-  tidak

berubah setelah stimulasi p55 TNFR atau p75 TNFR. Ini menunjukkan bahwa

penghambatan aktivitas tirosin kinase oleh Ab55 dicapai dengan beberapa

spesifisitas untuk IR.

Mimik Pengaruh TNF- Ceramides dan Sphingomyelinase pada Pensinyalan

Insulin - Di antara banyak aktivitas p55, TNFR mengaktivasi sphingomyelinase,

mengarah pada produksi ceramide dan phosphocholine. Ceramides menginduksi

aktivasi kinase dan fosfatase teraktivasi ceramide. Untuk menanyakan apakah

jalur ini relevan dengan pensinyalan insulin, adiposit 3T3-L1 diobati dengan

sphingomyelinase dan dua ceramide permeant sel (N -acetyl-sphingosine (C2) dan

N-hexanoylsphingosine (C6)). Sel kemudian distimulasi dengan insulin, dan

fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 dianalisis (Gambar 4A). C2 dan C6 mengurangi

fosforilasi IR dan IRS-1 secara setara (sekitar 50%), sementara sphingomyelinase

tampaknya menghasilkan penghambatan lebih kuat dibandingkan keduanya

(sekitar 70%). Kami menyelidiki kekhususan efek ini dari ceramide dan

sphingomyelinase untuk pensinyalan IR dengan menentukan efeknya pada

fosforilasi tirosin reseptor PDGF. 3T3-L1 adiposit diberi perlakuan dengan

Sphingomyelinase dan ceramides dan dirangsang dengan PDGF BB, dan reseptor

PDGF diimunopresipitasi dan dianalisis dengan anti-phosphotyrosine Western

blot. Seperti yang diamati pada Gambar 4A, fosforilasi tirosin dari reseptor

PDGF tidak dihambat dengan perlakuan ini, menunjukkan bahwa penghambatan

yang diamati pada IR menunjukkan beberapa spesifisitas.

Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa IRS-1 berperan sangat penting dalam

memediasi penghambatan IR yang disebabkan oleh TNF- (lihat di bawah). Oleh

karena itu, ditentukan apakah penghambatan pensinyalan IR yang dimediasi

sphingomyelinase dan ceramide berfungsi melalui IRS-1. Untuk melakukan ini,

kami membandingkan kemampuan TNF-, sphingomyelinase, dan ceramide

untuk menghambat pensinyalan IR dalam sel 32D-IR/IRS-1 dan dalam sel 32D

yang mengekspresikan IR dan IRS-2 (32D-IR/IRS-2). IRS-2 adalah protein yang

memiliki homologi signifikan dengan IRS-1 dan terbukti menjadi substrat

alternatif IR dalam sel-sel yang kekurangan IRS-1. Sejauh ini, tidak ada

perbedaan penting fungsi biologis kedua protein ini telah dijelaskan. Sel 32D-

IR/IRS-1 dan 32D-IR/IRS-2 diberi perlakuan dengan TNF- , sphingomyelinase,

C2, dan C6 selama 4 jam. Sel kemudian distimulasi oleh insulin dan IR, dan

fosforilasi tirosin IRS-1 dan IRS-2 dinilai dengan imunopresipitasi diikuti oleh

anti-phosphotyrosine Western blot. Seperti yang diamati pada Gambar 4B, dalam

sel 32D-IR/IRS-1, C2 menyebabkan penghambatan sederhana (10% untuk IR dan

20% untuk IRS-1), sementara C6 dan sphingomyelinase menghambat IR (masing-

masing 50 dan 80%) dan fosforilasi tirosin IRS-1 (60 dan 70%). Tetapi TNF-,

sphingomyelinase, dan ceramide tidak memodifikasi fosforilasi tirosin IR dan

IRS-2 dalam sel 32D-IR/IRS-2. Ini menunjukkan bahwa IRS-1 tetapi bukan IRS-2

yang terlibat dalam mekanisme di mana TNF- , sphingomyelinase, dan ceramide

menghambat pensinyalan insulin dalam sel 32D.

Baru-baru ini ditunjukkan bahwa TNF- mengkonversi IRS-1 menjadi

inhibitor autofosforilasi IR in vitro. Oleh karena itu, kami menilai apakah

sphingomyelinase dan ceramide dapat memediasi efek yang sama. Sel 32D-

IR/IRS-1 diberi perlakuan dengan TNF-, sphingomyelinase, C2, dan C6 selama

4 jam. IRS-1 diimunopresipitasi dan diinkubasi dengan adanya ligan-stimulated

IR. Autofosforilasi IR dilakukan selama 1 jam dengan ATP [-32 P], dan protein

dipisahkan pada SDS-PAGE (Gambar 5). Dibandingkan dengan kontrol inkubasi

(imunopresipitasi non-imun) atau dengan inkubasi dengan IRS-1 dari sel-sel yang

tidak diberi perlakuan, IRS-1 dari sel yang diberi perlakuan dengan TNF 

menurunkan kemampuan IR untuk autophosphorylate. Menariknya,

sphingomyelinase dan C6 juga mampu menginduksi penghambatan seperti itu,

dan C2 tidak atau sedikit berpengaruh pada aktivitas IR tirosin kinase. Ini

berkorelasi dengan kemampuan senyawa-senyawa ini guna menghambat

fosforilasi tirosin IR dan IRS-1 in vivo dan kemampuannya untuk mengubah IRS-

1 menjadi inhibitor IR. Ini menunjukkan bahwa TNF-, sphingomyelinase, dan

ceramide menghambat pensinyalan IR melalui mekanisme yang sama. Kami juga

mengukur kemampuan IRS-2 dari sel yang diberi perlakuan dengan TNF-,

sphingomyelinase, dan ceramide untuk menghambat IR (Gambar 5). Konsisten

dengan data yang diperoleh dalam sel utuh, tidak ada modifikasi kemampuan IR

untuk autophosphorylate yang diamati. Hasil yang diambil bersama-sama

menyarankan peran sphingomyelinase dan produksi ceramide selanjutnya dalam

mekanisme di mana TNF- menginduksi cacat pada pensinyalan insulin.

DISKUSI

Beberapa bukti baru sekarang menunjukkan bahwa TNF- adalah penghubung

sangat penting antara resistensi insulin dan obesitas. Selain data yang

menunjukkan kelebihan ekspresi TNF- dari jaringan adiposa tikus yang resisten

terhadap insulin dan tikus obesitas, bukti baru menunjukkan korelasi erat antara

obesitas, resistensi insulin, dan ekspresi TNF- pada manusia. Hubungan antara

TNF- dan resistensi insulin adalah penyebab, ditunjukkan secara langsung dalam

studi netralisasi hewan. Menggunakan protein fusi reseptor-IgG TNF terlarut yang

dirancang untuk menetralkan TNF-, ditunjukkan bahwa resistensi insulin sangat

berkurang pada tikus Zucker yang gemuk, bersama dengan peningkatan

hiperglikemia, hiperinsulinemia, dan hiperlipidemia. Ini berkorelasi dengan

peningkatan besar fosforilasi tirosin pada IR maupun IRS-1, diketahui

dipengaruhi selama obesitas dan resistensi insulin. Timbal balik, pengobatan

adiposit dalam kultur dengan TNF- menginduksi penurunan aktivitas tirosin

kinase dari IR. Suatu penghambatan fosforilasi tirosin yang diinduksi insulin dari

IR dan IRS-1 juga ditunjukkan pada sel hepatoma yang dikultur. Sangat mungkin

bahwa penghambatan aktivitas IR tirosin kinase oleh TNF- adalah mekanisme

utama dimana TNF-a menginduksi resistensi insulin pada obesitas. Memang,

meskipun beberapa cacat yang terletak pada tingkat reseptor postinsulin telah

terdeteksi pada hewan yang mengalami obesitas, seperti penurunan jumlah IR dan

transporter glukosa peka-insulin Glut4, dicatat bahwa tidak ada dari mereka yang

dapat menjelaskan sejauh mana resistensi insulin pada penyakit ini. Di sisi lain,

berkurangnya aktivitas tirosin kinase dari IR, seperti yang terjadi di bawah kerja

TNF-, dicatat pada hewan dan manusia diabetes mellitus yang tidak tergantung

insulin. Jelas, aktivitas tirosin kinase yang diinduksi diharapkan mempengaruhi

semua kerja insulin selanjutnya. Memahami mekanisme molekuler dimana TNF-

 menghambat aktivitas kinase IR tirosin dan tirosin fosforilasi berikutnya dari

IRS-1 akan memberikan wawasan dasar molekul resistensi insulin disebabkan

TNF- terhadap obesitas.

Salah satu mekanisme dimana TNF- mengganggu fungsi IR melibatkan

fosforilasi serin disebabkan TNF- dari IRS-1. IRS-1 serine-terfosforilasi ini

bertindak sebagai inhibitor IR in vitro dan berhubungan dengan berkurangnya

aktivitas IR dalam sel-sel utuh. Di sisi lain, langkah pertama yang dirangsang oleh

TNF-, mengarah pada penghambatan fosforilasi tirosin IR, tidak diketahui.

Dengan menggunakan TNF- manusia, kami mengamati bahwa stimulasi p55

TNFR saja sudah cukup untuk menghambat fosforilasi tirosin IR dan IRS-1

dengan potensi stimulasi yang sama dari kedua reseptor TNF. Antibodi agonis
terhadap p55 TNFR menginduksi efek yang sangat mirip. Aktivasi p75 TNFR saja

oleh antibodi agonis spesifik juga menghasilkan penghambatan pensinyalan IR,

meskipun efek ini lebih kecil dibandingkan dengan yang diinduksi oleh antibodi

pada pFR TNFR. Tentu saja, ada kemungkinan bahwa perbedaan besarnya efek

antibodi p55 TNFR dan p75 TNFR berada dalam perbedaan afinitas masing-

masing untuk ligan mereka atau dalam stabilitas mereka. Tetapi fakta bahwa

kedua pendekatan memberikan hasil yang sama sangat menunjukkan bahwa

stimulasi p55 TNFR bertanggung jawab atas efek TNF- pada fosforilasi tirosin

IR dan IRS-1 dalam sel-sel ini. Tetapi penting untuk dicatat bahwa ada beberapa

alasan untuk percaya bahwa p75 TNFR dapat berperan in vivo. Pertama, mRNA

untuk p75 TNFR meningkat secara dramatis (4,5 kali lipat) dalam jaringan

adiposa tikus yang obesitas/resisten insulin. Kedua, karena level absolut TNF-

obesitas agak rendah (kurang dari 100 pg/ml) dan p75 TNFR memiliki afinitas

lebih tinggi untuk TNF-, ini bisa berperan lebih penting. Peran definitif kedua

reseptor ini harus mencakup analisis resistensi insulin pada tikus gemuk yang

mengandung alel nol yang sesuai untuk kedua reseptor.

Salah satu peristiwa pensinyalan yang dipicu oleh p55 TNFR adalah stimulasi

sphingomyelinase netral yang terikat membran, menghidrolisis sphingomyelin

menjadi ceramide dan choline. Kami menunjukkan di sini bahwa ceramide dan

sphingomyelinase juga dapat menyebabkan penurunan fosforilasi tirosin pada IR

dan IRS-1. Pada tingkat molekuler, ceramide dan sphingomyelinase mengubah

IRS-1 menjadi penghambat aktivitas tirosin kinase IR, seperti halnya TNF- .

Senyawa-senyawa ini memiliki beberapa kekhususan untuk pensinyalan IR karena

mereka tidak menghambat fosforilasi tirosin PDGF dalam adiposit juga mereka

tidak memodifikasi fosforilasi tirosin IR dan IRS-2 dalam sel 32D-IR/IRS-2. Data

ini menunjukkan bahwa aktivasi sphingomyelinase dan produksi ceramide

cenderung menjadi jalur utama yang digunakan oleh p55 TNFR untuk memediasi

penghambatan IR. Ceramides secara langsung mengaktifkan berbagai enzim

seperti PKC-, suatu kinase terkait membran yang memfosforilasi dan

mengaktifkan Raf-1, dan protein fosfatase teraktivasi ceramide yang merupakan

subtipe heterotrimeric phosphatase 2A. Hal ini menyebabkan aktivasi kaskade

kejadian fosforilasi/defosforilasi. Sangat mungkin bahwa stimulasi enzim ini

mengarah pada modifikasi IRS-1 dan selanjutnya menghambat IR.

Karena IRS-1 adalah komponen utama mekanisme dimana TNF-

menghambat pensinyalan IR, menarik untuk menyelidiki peran IRS-2 dalam

proses ini. IRS-2, juga dikenal sebagai 4PS, menunjukkan homologi struktural

substansial dengan IRS-1, dan juga memiliki fungsi biologis yang sama. Memang,

seperti halnya IRS-1, IRS-2 berikatan dengan Grb2, ke subunit p85 dari

phosphatidylinositol 3-kinase, dan memiliki situs pengikatan potensial untuk PTP-

2C. Selain itu, IRS-2 terbukti menjadi substrat alternatif IR pada tikus yang

kekurangan IRS-1. Tetapi jelas dari Gambar 4 dan 5, IRS-2 tidak dapat

menggantikan IRS-1 dalam penghambatan ini. Ini adalah perbedaan penting

pertama yang diamati dalam fungsi IRS-1 dan IRS-2, dan ini bisa menjadi alat

penting untuk memahami mekanisme dimana IRS-1 menghambat IR terhadap

perlakuan TNF- sel.