MAKALAH BIOKIMIA II

PENGENALAN AGAROSA DAN ELEKTROFOSENSI GEL POLIAKRILAM DENGAN

KEPEKAAN SENSITIVAS DETEKSINYA

Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah BIOKIMIA II

Di Susun Oleh :

Fitri ainiyah 1711C1010

Virgin mentari rounur 1711C1028

Rusinih Yuliyanti 1712C1003

S1 Analis Medis dan Kimia

SEKOLAH TINGGI ANALIS BAKTI ASIH

BANDUNG

2019
 Pengenalan Agarosa dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid dengan
Kepekaan Sensitivitas Deteksinya.

Patricia Barril dan Silvia Nates

Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella ”, Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba,Argentina.

1. Perkenalan

Selama beberapa tahun terakhir teknik biologi molekuler, seperti reaksi berantai
polimerase (PCR), telah banyak digunakan untuk aplikasi medis dan forensik, serta penelitian,
dan deteksi dan karakterisasi organisme menular. Di bidang virologi, sudah menunjukkan
bahwa penggunaan teknik PCR menawarkan keuntungan yang tinggi sensitivitasdan
reproduktifitas dalam deteksi genom virus dan karakterisasi ketegangan. Namun, sensitivitas
dalam mendeteksi fragmen DNA juga terkait dengan sensitivitas dari matriks elektroforesis
yang diterapkan untuk pengembangan produk PCR. Elektroforesis melalui agarosa atau gel
poliakrilamida adalah metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi
dan memurnikan asam nukleat, karena kedua gel ini bersifat berpori di alam.

Di dalam bab evaluasi sensitivitas elektroforesis gel agarosa dan poliakrilamida matriks
dalam pendeteksian produk PCR dianalisis. Untuk tujuan ini, rotavirus PCR amplikon
digunakan sebagai model. Rotavirus manusia telah diakui sebagai penyebab paling umum
dehidrasi diare pada bayi dan anak kecil dalam skala dunia. Virus ini ditandai dengan
kehadiran 11 segmen RNA untai ganda dikelilingi oleh tiga yang terpisah kerang, inti, kapsid
dalam dan kapsid luar. Saat ini, rotavirus digolongkan ganda Genotipe G dan P
sesuai dengan perbedaan antigen netralisasi VP7 dan VP4 yang membentuk kapsid luar virion.
Dua vaksin rotavirus telah dilisensikan di Internet tahun 2006 di banyak negara. Meskipun
studi keamanan dan kemanjuran skala besar keduanya, vaksin rotavirus telah menunjukkan
kemanjuran yang sangat baik terhadap gastroenteritis rotavirus yang parah (Ruiz-Palacios et
al., 2006; Matson, 2006), kurangnya data yang jelas tentang perlindungan terhadap genotipe
yang tidak termasuk dalam formulasi vaksin menggaris bawahi pentingnya virologi
pengawasan, karakterisasi ketegangan rotavirus dan evaluasi dampaknya vaksin dalam
mengurangi penyakit diare di wilayah kami (Gentsch et al., 2005; Perez-Schael et al., 1990;
Velazquez et al., 1996).
 Selain itu, keberadaan beberapa genotipe G dan / atau P dalam spesimen individu dapat
terjadi ,lingkungan yang unik untuk akuisisi infeksi campuran dan karenanya untuk
reassortment gen rotavirus. Ini dapat mempengaruhi keduanya, evolusi rotavirus dan
kemanjuran kinerja vaksin saat ini dan masa depan. Dalam konteks ini, pengetahuan tentang
kedua rotavirus genotipe yang beredar di masyarakat dan kejadian infeksi campuran rotavirus
adalah penting untuk memperoleh pemahaman mendalam tentang ekologi dan distribusi,
Ketegangan rotavirus dan mengantisipasi perubahan antigenik yang dapat memengaruhi
efektivitas vaksin. Untuk tujuan ini, rotavirus G dan P genotipe ditentukan oleh ekstraksi virus
RNA dari spesimen tinja diikuti dengan analisis oleh PCR reverse-transcriptase semi-bersarang
(RT-PCR) dengan primer spesifik untuk wilayah gen yang mengkode VP7 atau VP4. Itu
Produk PCR spesifik genotipe kemudian dianalisis pada agarosa atau gel poliakrilamida diikuti
oleh pewarnaan ethidium bromide atau pewarnaan perak. Matriks yang digunakan untuk
elektroforesis harus memiliki ukuran pori yang dapat disesuaikan tetapi teratur secara kimia,
dan pilihan gel mana yang digunakan tergantung pada ukuran fragmen-fragmen yang
dipisahkan (Guilliatt, 2002).

2. Karakteristik umum dari matriks agarosa dan poliakrilamida

2.1 Elektroforesis gel Agarosa (AGE)

Agarose adalah polimer linier alami yang diekstraksi dari rumput laut yang membentuk
matriks gel oleh Ikatan hidrogen bila dipanaskan dalam buffer dan dibiarkan dingin. Untuk
sebagian besar aplikasi, hanya diperlukan agarosa komponen tunggal dan tidak diperlukan
katalis polimerisasi.
Oleh karena itu, gel agarosa sederhana dan cepat untuk disiapkan (Chawla, 2004). Keduanya
merupakan media populer untuk pemisahan asam nukleat berukuran sedang dan besar dan
memiliki berbagai pemisahan tetapi daya penyelesaian yang relatif rendah, karena pita
terbentuk digel cenderung kabur dan menyebar terpisah. Ini adalah hasil dari ukuran pori dan
tidak dapat sebagian besar dikontrol.

keuntungan dan kerugian lainnya dari menggunakan gel agarosa untuk DNA
elektroforesis diringkas dalam Tabel 1 (Stellwagen, 1998).

Keuntungan Kerugian
Media gel tidak beracun Biaya agarosa tinggi
Gel cepat dan mudah dilemparkan Pita kabur
 Baik untuk memisahkan molekul DNA besar Pemisahan yang buruk dari berat molekul
rendah sampel
Dapat memulihkan sampel dengan
melelehkan gel,
mencerna dengan enzim agarosa atau
mengobati
dengan garam chaotropic

2.2 Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Gel poliakrilamida adalah gel yang terikat secara kimiawi yang dibentuk oleh polimerisasi
akrilamida dengan zat pengikat-silang, biasanya N, N-metilenebisakrilamida. Reaksinya
adalah polimerisasi radikal bebas, biasanya dilakukan dengan amonium persulfat sebagai
inisiator dan N, N, N ', N-tetramethylethylendiamine (TEMED) sebagai katalis. walaupun
gel umumnya lebih sulit untuk disiapkan dan ditangani, melibatkan waktu yang lebih lama
persiapan daripada gel agarose, mereka memiliki keunggulan utama dibandingkan gel agarose.
Mereka punya daya penyelesaian yang lebih besar, dapat mengakomodasi jumlah DNA yang
lebih besar tanpa kehilangan yang signifikan dalam resolusi dan DNA yang pulih dari gel
poliakrilamida sangat murni (Guilliatt,2002). Selain itu, ukuran pori gel poliakrilamida dapat
diubah dengan mudah dan mode yang dapat dikendalikan dengan mengubah konsentrasi kedua
monomer. Bagaimanapun juga harus dicatat bahwa poliakrilamida adalah neurotoksin (bila
tidak dipolimerisasi), tetapi dengan perawatan laboratorium yang tepat itu tidak lebih
berbahaya daripada berbagai bahan kimia yang biasa digunakan (Budowle & Allen, 1991).

Beberapa kelebihan dan kekurangan menggunakan gel poliakrilamida untuk

elektroforesis DNA digambarkan pada Tabel 2 (Stellwagen, 1998).

Keuntungan Kerugian

Ikatan silang stabil secara kimia Monomer toksik

Pita tajam Gel membosankan untuk disiapkan dan

sering bocor
Baik untuk pemisahan fragmen-fragmen Perlu gel baru untuk setiap percobaan
dengan berat molekul rendah
3. Konsentrasi gel
3.1 Konsentrasi gel agarosa

Persentase agarosa yang digunakan tergantung pada ukuran fragmen yang harus
diselesaikan. konsentrasi agarosa disebut sebagai persentase agarosa terhadap volume buffer
(b / v), dan gel agarosa biasanya dalam kisaran 0,2% sampai 3% (Smith, 1993). Semakin rendah
konsentrasi agarosa, semakin cepat fragmen DNA bermigrasi. Secara umum, jika tujuannya
adalah untuk memisahkan fragmen DNA besar, konsentrasi rendah agarosa harus digunakan,
dan jika tujuannya adalah untuk memisahkan fragmen DNA kecil,menggunakan konsentrasi
agarosa tinggi.

Tabel 3. Konsentrasi gel agarosa untuk menyelesaikan molekul DNA linier.

Konsentrasi agarosa (%) Kisaran ukuran DNA (bp)

0,2 5000-40000
0,4 5000-30000
0,6 3000-10000
0,8 1000-7000
1 500-5000
1,5 300-3000
2 200-1500
3 100-1000

3.2 Konsentrasi gel poliakrilamida

Pilihan konsentrasi akrilamida sangat penting untuk pemisahan molekul yang optimal
(Hames, 1998). Memilih konsentrasi akrilamida yang sesuai dan ikatan silang
agen, methylenebisacrylamide, ukuran pori dalam gel dapat dikontrol. Dengan meningkatnya
total persentase konsentrasi (T) monomer (akrilamida plus cross-linker) dalam gel,
ukuran pori berkurang dalam hubungan yang hampir linier. Gel persentase lebih tinggi (T lebih
tinggi),dengan pori-pori yang lebih kecil, digunakan untuk memisahkan molekul yang lebih
kecil. Hubungan persentase total monomer yang diwakili oleh cross-linker (C) lebih kompleks.
Para peneliti telah menetapkan nilai C 5% (19: 1 akrilamida / bisakrilamida) untuk
sebagian besar bentuk dari denaturasi elektroforesis DNA dan RNA, dan 3,3% (29: 1) untuk
sebagian besar protein, asli Gel DNA dan RNA. Untuk optimasi, gel poliakrilamid 5% hingga
10% dengan pengait silang variabel dari 1% hingga 5% dapat digunakan. Menghubungkan
silang rendah (di bawah 3% C) menghasilkan "gel serat panjang"dengan ukuran pori meningkat
(Glavač & Dean, 1996). Selain itu, harus ditunjukkan bahwa pada konsentrasi akrilamida
rendah / bisakrilamida penanganan gel sulit karena mereka berlendir dan kurus.

Tabel 4 memberikan perbandingan DNA/ RNA yang direkomendasikan dan

persentase gel untuk rentang ukuran molekul yang berbeda.

Acrylamide / Bis Gel% DNA Asli / Didenaturasi

Rasio RNA(bp) DNA / RNA (bp)
19: 1 4 100-1500 70-500
6 60-600 40-400
8 40-500 20-200
10 30-300 15-150
12 20-150 10-100
29: 1 5 200-2000 70-800
6 80-800 50-500
8 60-400 30-300
10 50-300 20-200
12 40-200 15-150
20 <40 <40

Catatan:
aplikasi yang disarankan untuk setiap formulasi ditampilkan dalam huruf tebal.

4. Sistem buffer elektroforesis

Pemisahan efektif asam nukleat dengan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamida
tergantung pada pemeliharaan pH yang efektif dalam matriks. Oleh karena itu, buffer adalah
bagian integral dari teknik elektroforesis. Selain itu, mobilitas elektroforesis DNA dipengaruhi
oleh komposisi dan kekuatan ionik (kandungan garam) dari elektroforesis buffer (Somma &
Querci, 2006). Tanpa garam, konduktansi listrik minimal dan DNA nyaris tidak bergerak.
Dalam buffer dengan kekuatan ionik tinggi, konduktansi listrik sangat efisien dan sejumlah
besar panas dihasilkan. Berbagai kategori sistem buffer tersedia untuk elektroforesis: disosiasi
dan non-disosiasi, terus menerus dan terputus.
4.1 Dissociating dan non-dissociating systems buffer
Analisis elektroforetik asam nukleat untai tunggal dipersulit oleh yang sekunder
struktur diasumsikan oleh molekul-molekul ini. Pemisahan berdasarkan berat molekul
membutuhkan masuknya agen denaturasi, yang membuka untai DNA atau RNA dan
menghapus pengaruh bentuk pada mobilitas mereka. Asam nukleat membentuk struktur yang
distabilkan oleh hidrogen ikatan antara basis. Denaturasi membutuhkan gangguan ikatan
hidrogen . umumnya sistem penyangga yang dipisahkan termasuk urea dan formamida sebagai
denaturants DNA. DNA terdenaturasi bermigrasi melalui gel-gel ini pada tingkat yang hampir
sepenuhnya bergantung pada komposisi dan urutan dasarnya. Mendenaturasi atau memisahkan
sistem buffer untuk protein termasuk penggunaan natrium dodesil sulfat (SDS). Dalam sistem
SDS-PAGE,dikembangkan oleh Laemmli (1970), protein dipanaskan dengan SDS sebelum
elektroforesis sehingga kepadatan muatan semua protein dibuat kira-kira sama. Pemanasan di
SDS, anionik deterjen, mendenaturasi protein dalam sampel dan berikatan erat dengan molekul
yang tidak dikeraskan (dengan muatan negatif bersih). Akibatnya, ketika sampel ini
dielektroforesis, protein terpisah menurut massa saja, dengan efek yang sangat kecil dari
perbedaan komposisi. Molekul DNA bermuatan negatif; Oleh karena itu penambahan SDS
dalam gel persiapan hanya dengan tujuan meningkatkan daya resolusi pita (Day &Humphries,
1994). Dengan tidak adanya denaturants, DNA beruntai ganda (dsDNA), seperti produk PCR,
tetap ada struktur heliks ganda, yang memberinya bentuk seperti batang saat bermigrasi melalui
gel. Selama elektroforesis molekul asli dalam sistem buffer non-disosiasi, pemisahan
berlangsung pada tingkat yang kira-kira berbanding terbalik dengan log10 dari ukurannya.

4.2 Sistem buffer kontinu dan terputus-putus

Dalam sistem buffer kontinu, identitas dan konsentrasi komponen buffer adalah
sama di kedua gel dan tangki. Meskipun sistem buffer terus menerus mudah
menyiapkan dan memberikan resolusi yang memadai untuk beberapa aplikasi, pita cenderung
lebih luas dan resolusi akibatnya lebih buruk di gel ini. Sistem penyangga ini digunakan untuk
sebagian besar formulir elektroforesis gel agarosa DNA, yang umumnya mengandung EDTA
(pH 8.0) dan Trisacetate (TAE) atau Tris-borate (TBE) pada konsentrasi sekitar 50mM (pH
7,5-7,8). TAE lebih murah, tetapi tidak sesetabil TBE. Selain itu, TAE memberikan resolusi
yang lebih baik,Pita DNA dalam pemisahan elektroforesis pendek dan sering digunakan ketika
DNA selanjutnya ingin diisolasi . TBE digunakan untuk elektroforesis gel poliakrilamida dari
molekul yang lebih kecil DNA berat (MW <2000) dan elektroforesis gel agarosa dari DNA
yang lebih panjang di mana tinggi resolusi tidak penting.
 Sistem terputus-putus (multifasik) menggunakan buffer yang berbeda untuk tangki dan
gel, dan seringkali dua buffer berbeda di dalam gel. Sistem terputus berkonsentrasi atau
"menumpuk" sampel menjadi zona yang sangat sempit sebelum pemisahan, yang
menghasilkan peningkatan ketajaman pita dan resolusi. Gel tersebut dibagi menjadi gel "susun"
atas dengan persentase rendah akrilamida dan pH rendah (6,8) dan gel pemisah dengan pH 8,8
dan pori-pori jauh lebih kecil (lebih tinggi persentase akrilamida). Gel penumpukan mencegah
DNA dengan berat molekul tinggi hadir dalam sampel dari menyumbat pori-pori di bagian
atas gel yang berjalan sebelum rendah molekul DNA berat telah masuk. Baik, susun dan gel
pemisah, hanya berisi klorida sebagai anion bergerak, sedangkan buffer tangki mengandung
glisin sebagai anionnya, pada pH.
8.8. Keuntungan utama dari sistem buffer diskontinyu daripada sistem buffer kontinu
adalah bahwa sistem gel ini dapat mentoleransi volume sampel yang lebih besar (Rubin, 1975).

5. Memuat buffer
Buffer yang akan ditambahkan ke fragmen DNA yang akan di-elektroforesis. Buffer
ini mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kepadatan larutan DNA; jika tidak,
sampel akan larut dalam menjalankan tangki penyangga dan tidak tenggelam ke dalam kantong
gel. Gel loading buffer juga mengandung pewarna yang memudahkan pengamatan sampel
selama pengisian gel dan elektroforesis, seperti bromophenol blue atau xylene cyanol. Karena
molekul-molekul ini kecil, mereka bermigrasi dengan cepat melalui gel selama elektroforesis,
sehingga menunjukkan kemajuan elektroforesis (Chawla, 2004). Komponen dan konsentrasi
6X loading dye yang biasa digunakan adalah: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol
FF, 30% gliserin; atau 0,25% bromophenol blue, 50 mM EDTA, sukrosa 0,4%.

6. Tegangan / arus diterapkan

Semakin tinggi tegangan / arus, semakin cepat migrasi DNA. Jika voltase terlalu tinggi,
goresan pita, terutama untuk DNA≥12-15kb, dapat terjadi. Apalagi tegangan tinggi
menyebabkan peningkatan suhu dan arus buffer dalam waktu yang sangat singkat.
Jumlah panas dan arus tinggi yang terbentuk dalam proses mengarah pada pencairan gel, DNA
pita tersenyum, penurunan resolusi pita DNA dan ledakan sekering. Karena itu, sangat
direkomendasikan tidak melebihi 5-8 V / cm dan 75 mA untuk gel ukuran standar atau 100 mA
untuk minigels. Di sisi lain, ketika voltase terlalu rendah, mobilitas DNA kecil (≤1kb) adalah
berkurang dan pelebaran pita akan terjadi karena dispersi dan difusi.
7. Memvisualisasikan DNA
Setelah elektroforesis selesai, ada berbagai metode yang dapat digunakan untuk
membuat spesies DNA yang terpisah dalam gel terlihat oleh mata manusia.

7.1 Pewarnaan Ethidium bromide (EBS)

Lokalisasi DNA dalam gel agarosa dapat ditentukan secara langsung dengan pewarnaan
konsentrasi rendah pewarna etidium bromida fluoresen interkalasi di bawah ultraviolet
cahaya. Zat warna dapat dimasukkan dalam keduanya, tangki penyangga yang sedang berjalan
dan gel, gel itu sendiri, atau gel bisa ternoda setelah pemisahan DNA. Untuk catatan permanen,
kebanyakan foto instan diambil dari gel di ruangan gelap.

7.2 Pewarnaan perak (SS)

Pewarnaan perak adalah metode yang sangat sensitif untuk visualisasi asam nukleat dan
protein ,pita setelah pemisahan elektroforesis pada gel poliakrilamida. Asam nukleat dan
protein mengikat ion perak, yang dapat direduksi menjadi butiran logam perak yang tidak larut.
Perak yang cukup deposisi terlihat sebagai pita coklat gelap pada gel. Semua pewarnaan perak
dibuat dari langkah-langkah dasar yang sama, yaitu:(i) fiksasi untuk menghilangkan senyawa
yang mengganggu, ii) perak impregnasi dengan larutan perak nitrat atau larutan kompleks
perak-amonia, (iii) pembilasan dan pengembangan untuk membangun citra logam perak,
dan(iv) berhenti dan bilas sampai akhir pengembangan sebelum pembentukan latar belakang
yang berlebihan dan untuk menghilangkan ion perak berlebih (Chevallet et al., 2006).

8. Tujuan penelitian ini

Tujuan dari penelitian yang disajikan dalam bab ini adalah untuk menganalisis pengaruh gel
matriks elektroforesis (agarosa dan poliakrilamida) dan sistem pewarnaan (etidium
bromida dan pewarnaan perak) dalam deteksi amplikon genotipe G rotavirus (produk dari
dsDNA).

9. Bahan dan metode

9.1 Koleksi genotipe amplikon Rotavirus G
Koleksi spesimen 2148 sampel tinja diperoleh dari anak di bawah 3 tahun
usia yang dirawat di rumah sakit umum dan swasta yang berbeda di Kota Córdoba,
Argentina, selama periode 1979-2009. Dari 2148 spesimen tinja, total 590
(27,5%) positif untuk infeksi rotavirus dan semuanya memiliki genotipe G
oleh RT-PCR diikuti oleh heminested-PCR. Secara singkat, diekstraksi RNA dari sampel tinja
secara terbalik ditranskripsi menjadi VP7-gen cDNA panjang penuh dengan primer generik
Beg9 / End9. Kemudian, produk cDNA digunakan sebagai template untuk PCR VP7-
amplifikasi dengan pasangan primer Beg9 / End9 yang sama. Produk PCR panjang penuh VP7
digunakan sebagai templat dalam kombinasi dengan dua koktail primer dan jenis yang spesifik
generik reverse primer End9 untuk G-genotyping (Gouvea et al., 1990). Koktail adalah sebagai
berikut: G1 (aBT1), G2 (aCT2), dan G3 (aET3) dalam satu campuran, dan G4 (aDT4), G8
(aAT8) dan G9 (aFT9) di yang kedua. Amplikon yang diperoleh dianalisis secara komparatif
oleh metode elektroforesis gel agarosa standar dan pewarnaan etidium bromida (AGE / EBS)
dan elektroforesis gel poliakrilamid dan pewarnaan perak (PAGE / SS). Amplikon itu yang
menunjukkan hasil sumbang diurutkan untuk memverifikasi spesifisitas
pita divisualisasikan.

Gambar. 1. Algoritma untuk evaluasi perbedaan sensitivitas antara agarosa dan

matriks elektroforesis gel poliakrilamida dalam deteksi asam nukleat. Algoritma dilakukan
untuk evaluasi perbedaan sensitivitas antara agarosa dan matriks elektroforesis gel
poliakrilamida dalam deteksi asam nukleat .
9.2 Mempersiapkan, menjalankan dan mewarnai 2% gel agarosa
Ukuran yang diharapkan dari produk PCR spesifik genotipe adalah 749bp (G1), 652bp (G2),
374bp (G3), 583bp (G4), 885bp (G8), dan 306bp (G9). Karena itu, konsentrasi agarose 2%
digunakan untuk elektroforesis amplikon PCR (Tabel 5). Gel agarose dirawat dengan etidium
bromida untuk visualisasi selanjutnya dari amplikon DNA (konsentrasi akhir 0,5 ug / ml).
Ethidium bromide ditambahkan ke sediaan gel untuk meminimalkan limbah yang mengandung
etidium bromida. Volume yang sama dari 10ul heminested-PCR produk dan buffer Phyndia
(0,02M Tris-HCl pH 7,4, 0,3M NaCl, 0,01M MgCl2, SDS 0,1%, 5mM EDTA, 4% sukrosa,
0,04% bromofenol biru) dicampur dan dimuat ke dalam gel, bersama dengan tangga DNA
100pb, untuk perbandingan ukuran amplikon di kemudian hari. Gel agarose adalah di-
elektroforasi dalam menjalankan buffer TBE (0,09M Tris-Borate, 0,002M EDTA) selama 30-
60 menit pada 80-100V. Setelah dijalankan, produk PCR divisualisasikan dalam
transilluminator UV.

Bahan Kuantitas / volume

Agarose 2 gr 2 gr

Ethidium bromide (10 mg / ml) 5 ul

Air deionisasi 100 ml

9.3 Mempersiapkan, menjalankan dan menodai 10% gel poliakrilamida

Karena ukuran amplikon yang diharapkan PCR berada dalam kisaran 306-749bp, gel
poliakrilamida 6% konsentrasi harus digunakan, karena konsentrasi ini direkomendasikan
untuk pemisahan produk antara 80 dan 800bp. Namun, penanganan gel ini sulit karena mereka
terlalu berlendir. Untuk alasan ini, konsentrasi gel meningkat menjadi 10% dalam pemisahan
gel, mencapai pemisahan yang baik dari semua amplikon PCR dalam gel konsentrasi ini. Sama
volume 10ul dari produk PCR heminested dan buffer Phyndia dicampur dan dimuat ke 10%
gel poliakrilamida dengan ketebalan 1mm. Seiring dengan produk PCR, 100pb.
Gel pemisah Gel susun

Bahan volume Bahan volume

 Acrylamide 30% 2,5 ml Acrylamide 30% 400 μl

Bisacrylamide 1% 0,95 ml Bisacrylamide 1% 250 μl

Tris-hcl 3M (ph 8,7) ) 0,95 ml Tris-hcl 1M (ph 6,8) 315 μl

SDS 10% 75 μl SDS 10% 25 μl

Air deionisasi 3,2 ml Air deionisasi 1,5 ml

TEMED 5 μl Temed 2.5 μl

Amonium persulfat 10% 100 μl Amonium persulfat 10% 25 μl

Volume akhir 7,78 ml Volume akhir 2,52 ml

11 Tangga DNA juga dimuat dalam gel. Elektroforesis dilakukan dalam sel BioRad di a
sistem buffer non-disosiasi dan terputus-putus (stacking gel buffer Tris-HCl 1M pH 6,8
dan memisahkan buffer gel Tris-HCl 3M pH 8.7). Keduanya, dalam penumpukan dan separasi
gel solusi, 10% SDS ditambahkan untuk meningkatkan daya resolusi elektroforesis (Hari &
Humphries, 1994). Elektroforesis dilakukan dalam menjalankan buffer pH 8,9 (0,3% Tris,
1,44% Glycine, 0,1% SDS) selama 2 jam pada 60mA. Resep yang digunakan untuk terputus-
putus 10% persiapan gel poliakrilamid digambarkan pada Tabel 6. Setelah elektroforesis, gel
poliakrilamida diwarnai dengan perak nitrat mengikuti Herring et al. (1982) metode. Itu terdiri
dari: i) fiksasi fragmen DNA dalam etanol 10% dan 0,5% asam asetat glasial, ii) pewarnaan
dengan larutan perak nitrat 0,011M, iii) pengembangan dengan 0,75M NaOH dan 7,6%
formaldehid, dan iv) menghentikan proses dengan glasial 5% asam asetat ketika gambar yang
diinginkan telah dikembangkan.

Durasi setiap langkah perak pewarnaan ditunjukkan pada Tabel 7.

Langkah Larutan Waktu

1 Memperbaiki larutan 30 menit
2 Air dideionisasi 2 menit
3 Pewarnaan larutan 30 menit
4 Air terdeionisasi 10 detik
 5 Larutan pengembang 10-15 menit (hingga pita
terlihat)
6 Menghentikan Larutan tanpa
batas

Setelah pewarnaan perak, gel poliakrilamida dikeringkan dan diawetkan. Setiap poliakrilamida
gel ditempatkan di antara dua kertas plastik alami (satu menempel pada gelas) dan direndam
dalam larutan pengeringan yang mengandung 69% metanol dan 1% gliserol. Gel dikeringkan
di suhu kamar untuk 24-48 jam (Giordano et al., 2008).

10. Hasil
10.1 Deteksi genotipe Rotavirus G oleh AGE / EBS dan PAGE
/ SS
Di bawah kondisi eksperimental yang dijelaskan, analisis oleh AGE / EBS dari
rotavirus 590 sampel positif menunjukkan bahwa total 32 (5,4%) sampel tidak menampilkan
tipe PCR G. produk amplifikasi setelah elektroforesis gel. Dari 558 sampel yang
mengungkapkan PCR amplikon, 324 (58,1%) adalah infeksi genotipe G tunggal dan 234
(41,9%) genotipe G campuran infeksi (dua atau lebih amplikon terungkap dalam sampel yang
sama). Di samping itu, Analisis PAGE / SS dari amplikon PCR mengungkapkan bahwa semua
sampel positif rotavirus (n = 590) menunjukkan setidaknya satu amplikon. Dari 590 sampel,
318 (53,9%) adalah G tunggal.

Sistem Jumlah jenis infeksi rotavirus

pengembangan
Single Double Triple
AGE / EBS 324 234 0

Halaman / SS 318 240 32

infeksi genotipe dan 272 (46,1%) adalah infeksi tipe G campuran (240 ganda dan 32 tiga)
infeksi). Harus ditunjukkan bahwa, total infeksi genotipe G triple terdeteksi oleh PAGE / SS
dikembangkan sebagai infeksi genotipe G ganda atau tunggal oleh AGE / EBS. Hasilnya
digambarkan dalam Tabel 8. Jumlah sampel yang menggambarkan setiap genotipe G
ditunjukkan pada Tabel 9 dan Gambar 2. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sistem
AGE / EBS standar mengungkapkan jumlah yang lebih rendah.

Genotipe Jumlah genotipe yang terdeteksi oleh

Usia/EBS Halaman/SS
G1 461 504

G2 46 88
G3 12 19
G4 253 255
G5 2 2
G8 2 3
G9 16 23
Total 792 894
11. Diskusi
Pada perbandingan berdampingan yang disajikan dalam penelitian ini, metode deteksi
amplikon mengungkapkan secara umum bahwa jumlah genotipe yang lebih tinggi (11,4%)
dapat dideteksi oleh halaman / SS (n = 894) dibandingkan dengan AGE / EBS (n = 792). Dalam
banyak kasus, produk PCR divisualisasikan sebagai pita tidur oleh PAGE / SS dan kemudian
dikonfirmasi sebagai spesifik dengan urutan nukleotida, terjawab oleh teknik standar (AGE /
EBS). Biasanya genotipe G1 dan G4 yang umum terungkap sebagai pita yang kuat, sedangkan
genotipe lainnya sering kali dinyatakan pita lemah.
Oleh karena itu, kecenderungan AGE / EBS untuk mendeteksi tingkat genotipe G yang
lebih rendah adalah genap lebih jelas untuk genotipe yang lebih jarang, yaitu G2, G3, G8 dan
G9. Selain itu, 32 (5,4%) sampel positif rotavirus tidak mengungkapkan amplicon tipe PCR G
setelah AGE / EBS, sementara itu semuanya ditugaskan ke genotipe G setelah PAGE / SS.
Selain itu, penurunan deteksi genotipe rotavirus oleh AGE / EBS sehubungan dengan PAGE /
SS juga berdampak pada tingkat infeksi rotavirus campuran. Atas dasar pengamatan ini, itu
mungkin disarankan bahwa tingkat infeksi genotipe G campuran yang dilaporkan di seluruh
dunia, mungkin lebih tinggi jika sistem pengembangan standar, AGE / EBS, akan digantikan
oleh PAGE / SS teknik.
Penemuan-penemuan ini akan menarik untuk meningkatkan pengetahuan saat ini tentang
evolusi rotavirus dan menentukan potensi dampak infeksi campuran pada cakupan rotavirus-
vaksin dan efisiensi vaksin Secara keseluruhan, hasil yang diperoleh dalam penelitian ini
menyoroti bahwa metodologi yang digunakan untuk PCR visualisasi produk dapat menjadi
elemen penting untuk deskripsi yang beredar genotipe rotavirus dalam suatu komunitas dan
tingkat infeksi genotipe G campuran.

12. Pengakuan
Karya ini mendapat dukungan keuangan dari Dewan Sains dan Teknologi
Universitas Nasional Cordoba, Argentina (Grant 2009-2010).

13. Reverensi
Budowle, B. & Allen, R.C. 1991. Discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis of DNA
fragments. Methods in molecular biology: Protocols in human molecular genetics. (C.G.
Mathew, Ed.). Humana Press Inc., Clifton, NJ.
Chawla, H.S. 2004. Basic techniques. Introduction to plant biotechnology. 2nd edition. Science
Publishers, Inc. Enfield, NH, USA.
Chevallet, M., Luche, S. & Rabilloud, T. 2006. Silver staining of proteins in polyacrylamide
gels. Nat. Protocol. 1, 1852-1858.
Day, I.N. & Humphries, S.E. 1994. Electrophoresis for genotyping: microtiter array diagonal
gel electrophoresis on horizontal polyacrylamide gels, hydrolink, or agarose. Anal.
Biochem. 222, 389-395.
Gentsch, J.R., Laird, A.R., Bielfelt, B., Griffin, D.D., Banyai, K., Ramachandran, M., Jain, V.,
Cunliffe, N.A., Nakagomi, O., Kirkwood, C.D., Fischer, T.K., Parashar, U.D., Bresee,
J.S., Jiang, B., & Glass, R.I. 2005. Serotype diversity and reassortment between
human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs. J.
Infect. Dis. 192,S146-S159.
Giordano, M.O., Masachessi, G., Martinez, L.C., Barril, P.A., Ferreyra, L.J., Isa, M.B. & Nates,
S.V. 2008. Two instances of large genome profile picobirnavirus occurrence in
Argentinian infants with diarrhea over a 26-year period (1977-2002). J. Infect. 56,
371-375.
Glavač, D. & Dean, M. 1996. Heteroduplex analysis. Technologies for detection of DNA
damage
and mutations. (GP Pfeifer). Plenum Press, NY, USA.
Gouvea, V., Glass, R., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H., Forrester, B. & Fang, Z.Y. 1990.
Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from
stool specimens. J. Clin. Microb. 28, 276-282.
Guilliat, A.M. 2002. Agarose and polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in molecular
biology: PCR mutation detection protocols. (BDM Theophilus & R Rapley, Ed.).
Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Hames, B.D. 1998. An introduction to polyacrylamide gel electrophoresis. Gel electrophoresis
of proteins: A practical approach. 3rd Edition. (BDM Hames, Ed.). Oxford University
Press. NY, USA.
Herring, A., Inglis, N., Ojeh, C., Snodgrass, D., & Menzies, J. 1982. Rapid diagnosis of
rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid silver-stained
polyacrylamide gels. J. Clin. Microb. 16, 473-477.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature (London) 227, 680-685.
Matson, D.O. 2006. The pentavalent rotavirus vaccine, Rotateq. Semin. Pediatr. Infect. Dis.
17,195-199.
Perez-Schael, I., Blanco, M., Vilar, M., Garcia, D., White, L., Gonzalez, R., Kapikian, A.Z., &
Flores, J. 1990. Clinical studies of a quadrivalent rotavirus vaccine in Venezuelan
infants. J. Clin. Microbiol. 28,553-558.
Rubin, G.M. 1975. Preparation of RNA and ribosomes from yeast. Methods in cell biology:
Yeast cells. (DM Prescott, Ed.). Academic Press, Inc. London, England.
Ruiz-Palacios, G.M., Pérez-Schael, I., Velázquez, F.R., Abate, H., Breuer, T., Clemens, S.C.,
Cheuvart, B., Espinoza, F., Gillard, P., Innis, B.L., Cervantes, Y., Linhares, A.C.,
López, P., Macías-Parra, M., Ortega-Barría, E., Richardson, V., Rivera-Medina,
D.M., Rivera, L., Salinas, B., Pavía-Ruz, N., Salmerón, J., Rüttimann, R., Tinoco, J.C.,
Rubio, P., Nuñez, E., Guerrero, M.L., Yarzábal, J.P., Damaso, S., Tornieporth, N.,
Sáez-Llorens, X., Vergara, R.F., Vesikari, T., Bouckenooghe, A., Clemens, R., De
Vos, B., O'Ryan, M., & Human Rotavirus Vaccine Study Group. 2006. Safety and
efficacy of an attenuated vaccine against severe rotavirus gastroenteritis. N. Engl. J.
Med. 354,11-22.
Smith, D.R. 1993. Agarose gel electrophoresis. Methods in molecular biology: Transgenesis
Techniques. (D Murphy & DA Carter, Ed.). Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Somma, M. & Querci, M. 2006. Agarose gel electrophoresis (Session 5). The analysis of food
samples for the presence of genetically modified organisms. (M Querci, M Jermini & G
Van den Eede, Ed.). European Commission DG-JRC.
Stellwagen, N.C. 1998. DNA gel electrophoresis. Nucleic acid electrophoresis laboratory
manual.
(D Tietz, Ed.). Springer Verlag. Berlin-Heidelberg-New York.
Velázquez, F.R., Matson, D.O., Calva, J.J., Guerrero, L., Morrow, A.L., Carter-Campbell, S.,
Glass, R.I., Estes, M.K., Pickering, L.K., & Ruiz-Palacios, G.M. 1996. Rotavirus
infections in infants as protection against subsequent infections. N. Engl. J. Med.
335,1022-1028.
Wildt, S.J., Brooks, A.I., & Russell, R.J. 2008. Rodent genetics, models, and genotyping
methods. Sourcebook of models for biomedical research. (PM Conn, Ed.). Humana Press.
Totowa, NJ, USA.