I.

Prosedur Kerja
Presipitasi Laktat Dehidrogenase dari Ayam dengan Ammonium Sulfat
 Penyiapan jaringan
50 gram daging dada ayam dipotong kecil dan dibuang jaringan ikat dan lemaknya.
 Ekstraksi protein yang larut
Dimasukan potongan dada ayam dan 75 ml dapar pengekstrasi dingin ke dalam
blender. Ditutup dan dihancurkan jaringan dengan homogenasi, blen-der 4x30 detik
dengan jeda min 10 detik.
 Sentrifugasi
Dimasukkan homogenate kedalam 4 tabung sentri-fugasi 50 ml yang telah
didinginkan, dimasukkan dalam sentrifugasi selama 30 menit pada 2.500 rpm.
 Filtrasi
Dituangkan supernatant melalui kain penyaring kedalam gelas kimia yang sudah
didinginkan terlebih dahulu buang ampasnya. Diukur dan dicatat volume
supernatant, simpan 3 × 0,5 ml aliquot.
 Presipitasi dengan ammonium sulfat secara perlahan (lebih dari ~15 menit)
ditambahkan 0,39 gram ammonium sulfat per ml persupranatant ke dalam
supernatant yang telah disaring pada suhu dingin dan pengadukan dilakukan secara
perlahan agar tidak terjadi denaturasi protein (berbusa). Diaduk lagi 15 menit
setelah selesai ditambahkan ammonium sulfat agar setimbang.
 Sentrifugasi

Sampel disentrifugasi dengan prosedur yang sama dengan no 3. Supernatant dan

pellet disimpan ditempat yang berbeda dan disimpan dilemari es untuk tahap
pemurnian selanjutnya. LDH seharusnya terkandung didalam pellet.

Prosedur kerja kromatografi (gak tau dimasukin atau engga)

 Tidak perlu dilakukan resuspensi bagi kelompok yang menggunakan

supernatantnya.
 Resuspensi pellet ammonium sulfat
Ditambahkan 1 ml dapat Tris-PMSF ke pellet ammonium sulfat perlahan (jangan
sampai terjadi gelebung). Diaduk campuran tersebut hingga pellet larut pencampuran
dilakukan diatas es. Diperiksa volume larutan (tidak lebih dari 3 ml, jika kurang
ditambah lagi hingga 3 ml)
 Memasukan larutan suspense ke dalam kolom desalting
Ketika mendapatkan kolom, bagian atas frit akan ada larutan dapar, dibuang larutan
tersebut. Dimasukin sampel ke dalam kolom, dibuang cairan yang keluar dari kolom
 Elusi protein dari kolom desalting
Dimasukan 4 ml dapar Tris-PMSF kedalam kolom dan ditampung cairan yang keluar
dari kolom (cairan ini mengandung protein LDH, simpan diatas es)

Catat volume cairan yang keluar dari kolom (jika digunakan lebih dari satu kolom,
gabung cairan yang keluar dari tiap kolom ke dalam satu tabung dan ukur volume
total)

Data Pengamatan

Supernatant = 22 mL

Diambil 1,5 mL sehingga sisa 20,5 mL

Amonium sulfat = 7,995 gram

Sentrifugasi 1 Sentrifugasi 2

Pada tahap sentrifugasi awal didapat Pada tahap sentrifugasi kedua didapat
bagian atas berupa supernatant bagian atas berupa cair dan garam,
(protein), bagian bawah adalah cair sedangkan bagian bawah adalah LDH
dan garam. (protein)

Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pengujian pemurnian protein dimana digunakan
daging ayam pada bagian dadanya untuk mengetahui kandungan LDH. LDH adalah
enzim yang mengubah piruvat menjadi laktat dan termasuk dalam golongan
oksireduktase. Banyak jaringan mengandung LDH yang berfungsi mengkatalisis
perubahan reversible laktat ke piruvat, asam amino diperlukan oleh makhluk hidup
sebagai penyusun protein atau sebagai kerangka molekul-molekul penting. Ia
disebut esensial bagi suatu spesies organisme apabila spesies tersebut
memerlukannya tetapi tidak mampu memproduksi sendiri atau selalu kekurangan
asam amino yang bersangkutan. Untuk memenuhi kebutuhan ini, spesies itu harus
memasoknya dari luar (lewat makanan).

Awalnya daging ayam ditimbang sebanyak 50 gram, lalu dihancurkan dengan

homogenasi, hal tersebut agar memudahkan pelepasan enzim LDH. Setelah itu
ditambahkan dapar dalam bentuk es dan diblender. Pada saat diblender diberi jeda
10 detik pada setiap 30 detik penghalusannya, hal ini agar tidak terjadi pemanasan
yang bisa menyebabkan terdanaturasinya protein yang terkandung, dan
digunakannya dapar Tris-PMSF untuk menjaga kondisi pH optimum LDH. Lalu
dilakukan sentrifugasi selama 20 menit pada 15.000 rpm dan diperoleh supernatant
(protein lain, enzim LDH) dan pellet (matriks ayam yang lain), yaitu supernatant
berada pada bagian atas dan pellet berada pada bagian bawah. Sentrifugasi ini
bertujuan untuk memisahkan antara pellet dan supernatant yang berkaitan dengan
prinsip perbedaan BJ. Lalu setelah disentrifugasi hasilnya difiltrasi dengan kain
penyaring agar kita dapat mengambil supernatantnya, lalu supernatannya diukur
menggunakan gelas ukur, lalu disimpan 1,5 mL ditabung reaksi dan ditandai
homogen kasar. Filtrasi adalah proses pemisahan dari campuran berdasarkan
ukuran partikelnya. Dimana yang memiliki ukuran partikel paling besar akan
melewati lubang berpori, dan yang ukuran partikelnya kecil akan tertahan di pori-
pori tersebut.

Setelah itu dilakukan presipitasi dengan ammonium sulfat, yaitu supernatant

tersebut ditambahan ammonium sulfat yang sebelumnya sudah dilakukan
perhitungan dari supernatant yang dihasilkan, agar ammonium dapat
mempresipitasi supernatant. Dilakukan didalam gelas kimia yang berisi es agar
menjaga enzim untuk tidak bereaksi. Pengadukan supernatant dan ammonium
sulfat dilakukan perlahan agar tidak terjadi denaturasi LDH pada supernatant
tersebut. Penambahan ammonium sulfat bertujuan untuk mengurangi jumlah
molekul air yang berinteraksi dengan protein karena ammonium sulfat adalah
garam organik yang sangat larut dalam air. Ketika ammonium sulfat ditambahkan
dalam larutan protein akan mencapai konsentrasi dimana tidak ada lagi molekul air
dalam jumlah cukup untuk mempertahankan protein jenis tertentu dalam keadaan
terlarut, hal ini didukung dengan teori yang disampaikan Mayes, dkk (1990) yang
menyatakan bahwa “Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein
ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena
kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam
anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik
lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan
berkurang.” Setelah itu, protein akan mengendap atau yang biasa disebut ‘salting
out’ dari larutan.

Terakhir dilakukan sentrifugasi lagi, dan menghasilkan pellet pada bagian atas
yaitu isinya cair dan garam, dan supernatant yang posisinya ada dibagian bawah
larutan yang berisi enzim LDH dan protein lainnya.

Lalu dilakukan pemurnian dengan cara kromatografi. Supernatant yang telah

ditambahkan ammonium sulfat lalu dimasukan lagi ke tabung sentrifuga untuk
disentrifugasi lagi. Dari hasil sentrifugasi yang kedua, diambil pellet dan
suppernatantnya.
Pertama uji terhadap supertatant, supertatant tidak perlu diresuspensi karena sudah
dalam bentuk cairan. Kemudian digunakan kolom desalting untuk pemisahan
garam dan protein yang ada. Pada kolom desalting ini garam akan berada pada fasa
diam sedangkan protein akan turun bersama fasa gerak. Protein memiliki molekul
yang besar sehingga tidak terjerap pada fasa diam. Supernatant dimasukkan ke
dalam kolom desalting setelah membuang larutan Tris-PMSF yang sudah ada
sebelumnya pada kolom tersebut. Tris-PMSF ini berguna untuk menyamakan pH
dari supernatant dengan keadaan di dalam kolom. Setelah itu hasil uji ditampung di
dalam beaker glass yang kemudian hasilnya di ukur jumlahnya dalam mL.
Uji kedua adalah uji terhadap pellet. Pellet diambil lalu diresuspensi dengancara
ditambahakan Tris-PMSF untuk menjaga pH dari pellet dan diaduk perlahan-lahan
agar bercampur. Hal ini juga dilakukan agar pellet berada dalam keadaan cair atau
terlarut sehingga lebih memudahkan pada saat melakukan proses pemisahan pada
kolom desalting. Pada tahap pemisahan di kolom desalting, proses yang dilakukan
sama seperti pada uji terhadap supernatant.
Kemudian seharusnya dilakukan isolasi LDH dari beberapa protein yang ada di
dalam cairan tersebut dengan cara kromatografi afinitas. Dimana kromatografi ini
memiliki prinsip memisahkan protein-protein berdasarkan interaksi reversibel
antara satu protein (atau grup protein-protein) dan pasangan ligan spesifik ke
matriks kromatografi. Teknik ini ideal untuk menangkap tahap intermediet dalam
protocol pemurnian dan dapat digunakan kapanpun ligan yang cocok sesuai untuk
ketertarikan dari protein atau protein-protein tersebut.
Kolom yang digunakan untuk isolasi LDH ini adalah kolom cibacron blue, dimana
kolom ini memiliki grup ligan yang menarik perhatian LDH untuk secara alamiah
mengikat ligan-ligan tersebut, seperti laktat, piruvat, NAD+ , atau NADH.
Campuran protein yang lainnya akan melewati kolom dan LDH yang memiliki
afinitas yang tinggi akan terikat pada kolom cibacron blue. Lalu untuk
mengeluarkan LDH dilakukan dengan cara elusi, yaitu membilas kolom dengan
kelarutan garam dalam konsentrasi yang tinggi yang akan membiarkan LDH
terlepas dari ligannya. Sehingga didapatkan LDH dari proses yang dinamakan elusi
ini.