Laporan Kemajuan Penelitian Corected 21 Okt ARA 2019

LAPORAN KEMAJUAN
RISET KOLABORASI MITRA LUAR NEGERI

PENELITIAN DASAR UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
Judul
PRESERVASI RESIDUAL RIDGE TULANG

ALVEOLARIS MELALUI INDUKSI MANGOSTEEN
PERICARP
TIM PENGUSUL
Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM / NIDN 0023098101

Dr. Pratiwi Soesilawati, drg.,MKes.,PA(K)/ NIDN 00221169003
Gde Djodi Satria Rurus / NIM 02141133045
dr. Tobiume Kei Ph.D / Hiroshima University
UNIVERSITAS AIRLANGGA
OKTOBER 2019
1
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Penelitian: : Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui

Induksi mangosteen pericarp
Topik Riset Mandat : Kesehatan, Penyakit tropis, Gizi dan obat
Bidang Fokus : Pengembangan vaksin, obat dan obat tradisional
(Bahan alam )
Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap : Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM
b. NIDN : 0023098101
c. Jabatan Fungsional : Lektor
d. Program Studi : Bedah Mulut dan Maksilofasial
e. Nomor HP : 081390909100
f. Alamat surel (e-mail) : andra.ara@gmail.com
Anggota Peneliti (1)
a. Nama Lengkap : Dr. Pratiwi Soesilawati, drg.,MKes.,PA(K)
b. NIDN : 00221169003
c. Perguruan Tinggi : Universitas Airlangga
d. Nama Lengkap : Gde Djodi Satria Rurus
e. NIM : 02141133045
f. Perguruan Tinggi : Universitas Airlangga
g. Nama Lengkap : dr. Tobiume Kei Ph.D
h. NIDN :-
i. Perguruan Tinggi : Hiroshima University
Lama Penelitian Keseluruhan : 1 Tahun

Biaya Penelitian Keseluruhan : Rp. 100.000.000,-
Biaya Tahun berjalan :
- Diusulkan ke UNAIR : Rp. 100.000.000,-
- Dana institusi lain :-
- Inkind, sebutkan :-
Mengetahui, Surabaya, 21 Oktober 2019

Ketua Lembaga Penelitian dan Inovasi Ketua Peneliti
Prof. Hery Purnobasuki, M.Si., Ph. Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM
NIP 196705071991021001 NIP. 19810923 200501 1 001
Menyetujui Wakil Rektor 3
Prof. Ir Moch. Amin Alamsjah, M.Si., Ph.D

NIP. 197001161995031002
2
RINGKASAN
Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan

gigi yang hilang akibat pencabutan gigi. Pencabutan gigi dikatakan ideal apabila
dilakukan tanpa memberikan trauma yang berlebih terutama kepada prosesus
alveolaris. Pada keadaan yang normal pasca pencabutan gigi terjadi resorbsi
tulang alveolaris dalam arah horizontal dan vertical sehingga mempersulit
pemasangan dental implant. Banyak penelitian yang telah dilakukan mengenai
preservasi soket bekas pencabutan yang memanfaatkan bahan alam salah satunya
adalah kulit dari buah manggis (Garcinia mangostana).
Kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat

mempercepat proses proliferasi fibroblas dan proses angiogenesis. sehingga dapat
mempercepat proses penyembuhan luka. Indikator untuk penyembuhan luka
adalah dengan pemberian ekstrak kulit buah manggis dapat melibatkan banyak
protein, salah satunya adalah peningkatan jumlah fibroblast dan indikator
pembentukan osteoblast dengan melihat ekspresi PDGF-B, FGF-2, ,VEGF-A,
TGF-β1 dari tingkat mRNA atau protein.
Kulit buah manggis mengandung Xanthone yang mempunyai efek

antiinflamasi sehingga dapat membatasi ekspresi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan
CRP pada proses penyembuhan luka, sehingga resorbsi yang berlebihan pada
tulang alveolar bisa teratasi pasca pencabutan gigi. Indikator untuk penyembuhan
tulang adalah, salah satunya adalah peningkatan jumlah indikator pembentukan
osteoblast dengan melihat ekspresi Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP dari
tingkat mRNA atau protein.
Tujuan jangka panjang peneliti adalah menghasilkan suatu produk Gel

yang berisi ekstrak kulit manggis untuk mengisi soket bekas pencabutan gigi
sehingga dapat mempercepat penyembuhan tulang, mengurangi resiko terjadinya
infeksi dan mempertahankan dimensi vertical dan horizontal tulang alveolar.
Apabila semua tujuan bisa tercapai maka bisa mempermudah klinisi memasang
implant tanpa memikirkan untuk penambahan bahan tulang tandur. Seperti yang
kita ketahui bahwa pemilihan bahan tandur tulang yang berasal dari tubuh sendiri
3
dapat mengakibatkan defek pada tubuh sedangkan penambahan tulang dari tulang
organisme lain dapat mengeluarkan biaya yang tidak sedikit.
4
DAFTAR ISI
Halaman
Halaman Pengesahan.........................................................................................................2
Ringkasan..........................................................................................................................3
Daftar Isi............................................................................................................................5
Daftar Tabel ........................................................................................................................
Daftar Gambar...................................................................................................................5
Bab 1 Pendahuluan..........................................................................................................7
1.1 Latar Belakang.............................................................................................................7
1.2 Rumusan Masalah........................................................................................................9
1.3 Tujuan Penelitian.........................................................................................................9
1.4 Manfaat Penelitian.....................................................................................................10
1.5 Rencana Target Capaian Tahunan..............................................................................11
Bab 2 Tinjauan Pustaka................................................................................................13
2.1 Penyembuhan Luka...................................................................................................13
2.2 Penyembuhan luka pasca pencabutan gigi................................................................15
2.3 Angiogenesis..............................................................................................................15
2.4 Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A)...................................................17
2.5 Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2)........................................................................18
2.6 Fibroblas ...................................................................................................................19
2.7 Platelet-derived growth factor -B (PDGF-B) ...........................................................20
2.8 Transforming Growth Faktor-Beta1 (TGF-β1) ........................................................21
2.9 Protein penand/ marker proses inflamasi..................................................................21
2.9.1 Interleukin-1 (IL-1) ……………………….………………………..…................ 22
2.9.2 Interleukin-6 (IL-6) …………………………………………………………….. 23
2.9.3 Interleukin-10 (IL-10) ……………………………….………………………….. 23
2.9.4 Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) …………… ………………………….. 23
2.9.5 C-Reactive Protein (CRP) ………………………………………………………. 24
2.10 Penanda / Marker Proses Osteogenesis …………………………………………. 24
2.10.1 Bone Sialoprotein (BSP) ………………………………………………………. 26
2.10.2 Alkali Phospahate(ALP) ………………………………………………………. 27
2.10.3 Run-Related Transcription Factor 2 (RUNX2) ………………………………. 28
5
2.10.4 Colagen 1 Alpha 1 (Coll1α1) …………………………………………………. 29
2.10.5 Osterix (OSX) ………..………………………………………………….......... 29
2.11 Kulit Buah manggis ……………………………………………………………… 30
2.12 Methyl-Thiazol-Tetrazolium atau MTT Assay ………………………………….. 31
2.13 Wound Healing Assay …………………………………………………………... 32
2.14 Polymerase Chain Reaction (PCR) …………………………………………….... 32
2.15 Real-Time PCR …………………………………………………………………. 33
2.16 Osteoblastic Cell Line MC3T3-E1 ……………………………………………… 34
2.17 Lipopolisakarida (LPS) ………….……………………………………………… 34
Bab 3 Metode Penelitian...............................................................................................36
3.1 Jenis Penelitian..........................................................................................................36
3.2 Rancangan Penelitian................................................................................................36
3.3 Sampel dan Besar Sampel.........................................................................................36
3.3.1 Jenis Sampel...........................................................................................................36
3.3.2 Besar Sampel..........................................................................................................36
3.4 Variabel Penelitian.....................................................................................................37
3.5 Definisi Operasional..................................................................................................38
3.5.1 Human Gingival Fibroblas.....................................................................................38
3.5.2 Osteoblastic Cell Lini MC3T3-E1 ……………………………………….………38
3.5.3 Lipopolisakarida.....................................................................................................38
3.5.4 Ekstak Kulit manggis..............................................................................................38
3.6 Tahapan Penelitian …………………………………………………………..…… 42
3.7 Waktu dan Tempat Penelitian....................................................................................44
3.8 Alat dan Bahan Penelitian..........................................................................................44
3.8.1 Alat penelitian.........................................................................................................44
3.8.2 Bahan Penelitian ....................................................................................................45
3.9 Cara Kerja.................................................................................................................47
3.9.1 Pembuatan Ekstrak kulit buah Manggis................................................................47
3.9.2 Kultur sel ………………………………………………………….…………… 48
3.10 PCR …………………………………………………………..………………….. 49
3.10.1 Ekstraksi RNA ...................................................................................................49
3.10.2 Pengukuran kadar dan kemurnian RNA...............................................................49
6
3.10.3 Perancangan dan optimasi PCR primer PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, IL-1, IL-
6, IL-10, TNF α, CRP, Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan
BSP……………………………………………………………………..............50
3.10.4 Visualisasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis pada gel...................51
3.11 PCR Real Time………………………………………………………………….. 52
3.12 MTT Assay …………………………………………..………………………….. 54
3.13 Wound healing assay pada kultur Human Gingival Fibroblast ..……………….. 55
3.14 Analisis Data..........................................................................................................55
3.15 Luaran Per Tahun.....................................................................................................55
3.16 Indikator Capaian….……………………………………………………….......... 55
BAB 4 Road Map Penelitian …………………………………………………………56
BAB 5. Hasil Yang Dicapai …………………………………………………………. xx
Rencana Tahapan Berikutnya ……………………………………………………… xx
Kesimpulan dan Saran …………………………………………................................... xx
Kendala Yang Dihadapi …………………………………………................................ .xx
Solusi Penyelesaian …………………………………………...................................... xx
Perkiraan Riset Dapat Diselesaikan …………………………………………............... xx
Rincian Biaya Yang Dikeluarkan …………………………………………................. xx
Daftar Pustaka …………………………………………................................................ xx
Lampiran …………………………………………....................................................... xx
7
DAFTAR TABEL
Halaman
Rencana Target Capaian Tahunan....................................................................................14
Ringkasan..........................................................................................................................3
Daftar Isi............................................................................................................................5
Daftar Tabel ........................................................................................................................
Daftar Gambar...................................................................................................................5
Bab 1 Pendahuluan..........................................................................................................7
1.1 Latar Belakang.............................................................................................................7
1.2 Rumusan Masalah........................................................................................................9
2.3 Angiogenesis..............................................................................................................15
2.6 Fibroblas ...................................................................................................................19
2.9.1 Interleukin-1 (IL-1) ……………………….………………………..…................ 22
2.9.2 Interleukin-6 (IL-6) …………………………………………………………….. 23
2.9.3 Interleukin-10 (IL-10) ……………………………….………………………….. 23
8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Halaman Pengesahan.........................................................................................................2
Ringkasan..........................................................................................................................3
Daftar Isi............................................................................................................................5
Daftar Tabel ........................................................................................................................
Daftar Gambar...................................................................................................................5
Bab 1 Pendahuluan..........................................................................................................7
1.1 Latar Belakang.............................................................................................................7
1.2 Rumusan Masalah........................................................................................................9
2.3 Angiogenesis..............................................................................................................15
2.6 Fibroblas ...................................................................................................................19
2.9.1 Interleukin-1 (IL-1) ……………………….………………………..…................ 22
2.9.2 Interleukin-6 (IL-6) …………………………………………………………….. 23
2.9.3 Interleukin-10 (IL-10) ……………………………….………………………….. 23
9
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Kehilangan gigi tetap pasca pencabutan gigi tanpa penggantian gigi yang
hilang dapat mengakibatkan gangguan fungsi pengunyahan, estetik dan fonetik.
Selain itu dapat terjadi gangguan keseimbangan organ mastikasi dalam mulut,
seperti migrasi gigi tetangga, ekstrusi gigi antagonis, kehilangan kontak, karies,
resesi gingiva dan poket periodontal yang mengakibatkan masalah kesehatan gigi
dan mulut yang lebih kompleks.
Penggantian gigi yang hilang dapat dilakukan dengan aplikasi gigi tiruan
baik sebagian maupun lengkap, gigi tiruan cekat ( crown dan bridge ) dan dental
implant. Seiring dengan kebutuhan dan keinginan penderita serta perkembangan
tehnologi dalam bidang kedokteran gigi, implant gigi merupakan alternatif
terbaik.
Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan

gigi yang hilang akibat pencabutan gigi. Pencabutan gigi dikatakan ideal apabila
dilakukan tanpa memberikan trauma yang berlebih terutama kepada prosesus
alveolaris. Keberadaan dimensi vertikal maupun horizontal. Prosesus alveolaris
sangat menunjang dalam pemasangan dental implant. Pada keadaan yang normal
pasca pencabutan gigi terjadi resorbsi tulang alveolaris dalam arah horizontal dan
vertical sehingga mempersulit pemasangan dental implant.
Diperlukan metoda untuk menghambat proses resorpsi tulang alveolaris

sehingga dimensi soket gigi dapat dipertahankan sampai pada saat pemasangan
implant, disebut dengan prosedur socket preservation. Prosedur socket
preservation dilakukan dengan menempatkan bahan yang dapat mempercepat
proses penyembuhan soket pasca pencabutan gigi sehingga diharapkan dapat
menghambat proses resorpsi tulang alveolaris.
Saat ini banyak penelitian yang telah dilakukan mengenai preservasi soket
dan penyembuhan luka yang memanfaatkan bahan alam. Diantaranya digunakan
10
obat tradisional sebagai antiinflamasi. Hal ini dikarenakan kepercayaan
masyarakat terhadap kelebihan dari obat tradisional dibandingkan dengan obat
modern yaitu efek samping obat tradisional relatif kecil jika digunakan secara
tepat (Katno, 2007).
Bahan dari alam yang dapat dimanfaatkan untuk penyembuhan tulang
adalah kulit dari buah manggis (Garcinia mangostana) (Chaovanalikit, 2012). Di
dalam kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat merangsang
proliferasi fibroblas. Derivat dari senyawa fenol yaitu antosianin, flavonoid dan
tanin memiliki sifat antioksidan dan antimikroba (Sakagami, 2012). Derivat dari
xanthone yaitu α-mangostin memiliki aktivitas sebagai antijamur, antioksidan,
antiviral, antibakteri, serta anti inflamasi (Chaverri, 2008).
Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah
manggis melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah
fibroblast dan proses angiogesis. Angiogenesis merupakan pembentukan
pembuluh darah baru yang terjadi secara alami didalam tubuh baik dalam
kondisi sehat maupun patologi. Pada keadaan terjadi kerusakan jaringan
proses angiogenesis berperan dalam mempertahankan kelangsungan fungsi
berbagai jaringan dan organ yang terkena luka. Hal ini terjadi melalui
terbentuknya pembuluh darah baru yang menggantikan pembuluh darah yang
rusak ( Frisca et al. 2009 )
Ada berbagai macam growth factor yakni PDGF (Platelet Derived Griwth
Factor) , VEGF ( Vascular Endothelial Growth Factor ), TGF-β ( Transforming
Growth Factor Beta ) FGF ( Fibroblast Growth Factor ), Osx ( Osterix ),
RUNX-2 ( Runt Related Transcription Factor -2 ) dan ALP ( Alkali
Phosphatase ) yang dapat mempengaruhi proses migrasi fibroblast dan proses
osteogenesis pada proses penyembuhan ulang. Dengan demikian, penelitian ini
bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap
ekspresi PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP ditingkat DNA
dan Protein kultur sel human gingiva fibroblast sebagai strategi potensial untuk
mempercepat penyembuhan tulang. Dari penelitian ini dapat dilanjutkan dengan
membuat gel ekstrak kulit buah manggis yang diaplikasikan kepada soket pasca
pencabutan gigi untuk mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi infeksi.
11
Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah manggis
melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah Osteoblast
dan proses Osteogenesis. Osteogenesis merupakan proses perkembangan yang
melibatkan pembentukan fibrocartilago dan aktivitas osteogenik dari sel tulang
utama ( Solomon et al, 2010 ). Proses osteogenesis terdiri dari 5 fase, yaitu fase
hematoma, fase inlamasi dan proliferasi seluler, pembentukan callus,
konsolidasi, remodeling (Shapiro, 2008)
Ada berbagai macam marker osteogenesis yaitu Osterix, ALP, RUNX2,
COL1α, dan BSP yang dapat mempengaruhi proses osteogenesis pada proses
penyembuhan tulang. Dan selain itu ada berbagai macam marker inflamasi yaitu
IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP yang berperan dalam proses inflamasi.
Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh ekstrak
kulit buah manggis terhadap ekspresi Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP
serta marker inflamasi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP pada media
Osteoblastic Cell Line MC3T3-E1 sebagai strategi potensial untuk menghambat
resorpsi tulang pada proses inflamasi post ekstraksi gigi. Dari penelitian ini
dapat dilanjutkan dengan membuat gel ekstrak kulit buah manggis yang
diaplikasikan kepada soket pasca pencabutan gigi untuk mempercepat
penyembuhan luka, dan menghambat proses resorpsi tulang.
1.2 Rumusan Masalah

a. Apakah aplikasi ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi
PDGF, FGF, VEGF, TGF-β secara seluler dan wound healing assay pada
human gingiva fibroblast?
b. Apakah aplikasi ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi
Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP serta menurunkan marker inflamasi
IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP yang dievaluasi dengan realtime PCR
dengan media Osteoblastic cell line MC3T3-E1?
1.3 Tujuan Penelitian

a. Mengetahui dosis optimal ekstrak kulit buah manggis pada kultur sel
human gingiva fibroblast.
b. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat mempercepat
wound healing assay pada kultur sel human gingiva fibroblast
12
c. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
ekspresi RNA dan protein PDGF-B pada kultur sel human gingiva
fibroblast.
d. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
ekspresi RNA dan protein FGF-2 pada kultur sel human gingiva fibroblast.
e. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
ekspresi RNA dan protein VEGF-A pada kultur sel human gingiva
fibroblast.
f. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
ekspresi RNA dan protein TGF-β1 pada kultur sel human gingiva
fibroblast.
g. Mengetahui dosis optimal ekstrak kulit buah manggis pada Osteoblastic
cell line MC3T3-E1
h. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
Ekspresi gen Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP pada Osteoblastic
cell line MC3T3-E1
i. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat menurunkan IL-1,
IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1
1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Sebagai model penyembuhan luka untuk memperbaiki atau
mempercepat proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi melalui
migrasi fibroblast, proses jalur pencegahan keradangan dan aktivasi
proses angiogenesis.
2. Meningkatkan efektifitas pendayagunaan ekstrak kulit buah manggis
sebagai bio-produk yang baik sebagai bahan alternatif untuk
mempercepat penyembuhan luka pasca pencabutan gigi dan
mengurangi terjadi resiko terjadi infeksi.
3. Sebagai model penyembuhan luka untuk memperbaiki atau
mempercepat proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi melalui
proses jalur pencegahan keradangan dan aktivasi proses osteogenesis.
4. Meningkatkan efektifitas pendayagunaan ekstrak kulit buah manggis
sebagai bio-produk yang baik sebagai bahan alternatif untuk
13
mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi terjadinya resorpsi
tulang alveolar pasca pencabutan gigi.
1.5 Rencana Target Capaian Tahunan

No Indikator Capaian
Jenis Luaran TS1) TS+1 TS+2 TS+3
.
Internasional ada Ada ada Ada
Publikasi
1. Nasional Tidak
ilmiah2) Draf Submitted Published
Terakreditasi ada
Sudah Sudah
Pemakalah Internasional Draf Terdaftar
dilaksanakan dilaksanakan
2. dalam temu
Sudah Sudah
ilmiah3) Nasional Draf Terdaftar
Sudah Sudah
Invited speaker Internasional Draf Terdaftar
3. dalam temu
Sudah Sudah
ilmiah4) Nasional Draf Terdaftar
Visiting Sudah Sudah
4. Internasional Draf Terdaftar
Lecturer5) dilaksanakan dilaksanakan
Tidak
Paten Draf Terdaftar Terdaftar
ada
Paten Tidak
Draf Terdaftar Terdaftar
sederhana ada
Tidak
Hak Cipta Draf Terdaftar Terdaftar
ada
Merek Tidak
Draf Terdaftar Terdaftar
dagang ada
Tidak
Rahasia Tidak Tidak ada Tidak ada
dagang ada ada
Hak Kekayaan
Desain Tidak
5. Intelektual Tidak Tidak ada Tidak ada
Produk ada
(HKI)6) ada
Industri
Tidak
Indikasi Tidak Tidak ada Tidak ada
Geografis ada ada
Perlindungan Tidak
Tidak Tidak ada Tidak ada
Varietas ada
ada
Tanaman
Perlindungan
Topografi Tidak Tidak
Tidak ada Tidak ada
Sirkuit ada ada
Terpadu
Tidak
6. Teknologi Tepat Guna 7) Draf Produk Penerapan
ada
7. Model/Purwarupa/Desain/Kary Tidak Draf Produk Penerapan
14
a seni/Rekayasa Sosial8) ada
Tidak Tidak
8. Buku Ajar (ISBN)9) Tidak ada Tidak ada
ada ada
Tingkat Kesiapan Teknologi
9. 1 2 3 4
(TKT)10)
15
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Penyembuhan Luka

Penyembuhan luka merupakan suatu proses penggantian jaringan yang
mati/rusak dengan jaringan baru yang sehat oleh tubuh melalui proses regenerasi.
Luka dikatakan sembuh apabila permukaannya dapat bersatu kembali dan
didapatkan kekuatan jaringan yang mencapai optimal.
Penyembuhan luka meliputi 2 kategori yaitu regenerasi dan reparasi.
Regenerasi merupakan pemulihan jaringan seperti semula baik struktur maupun
fungsinya. Reparasi merupakan pemulihan atau penggantian oleh jaringan ikat.
Tahapan proses penyembuhan meliputi proses inflamasi, proliferasi,
reepitelisasi, pembentukan jaringan granulasi, angiogenesis interaksi antara
berbagai sel dan matriks, serta remodeling jaringan. Tujuan proses ini adalah
untuk mengembalikan keadaan jaringan seperti semula (Cockbill, 2002). Suatu
proses penyembuhan dimulai segera setelah terjadinya luka, akan tetapi
mekanisme, kecepatan penyembuhan dan jaringan baru yang menyusun luka
bergantung pada tipe dari luka tersebut (Cockbill, 2002). Proses penyembuhan
dimulai setelah terjadi luka memiliki 3 tahap utama yaitu keradangan, perbaikan
jaringan, dan maturasi jaringan. Beberapa menit setelah terjadi trauma pada
jaringan, biasanya juga melibatkan pembuluh darah, terbentuknya gumpalan
darah yang menutup daerah tersebut (Goepel, 1992).
Tiga tahapan proses penyembuhan luka meliputi (Goepel, 1992):
1) Tahap Inflamasi (Inflamatory phase)
Tahap inflamasi dari suatu proses penyembuhan luka secara klinis
dapat dikarakteristikkan melalui tanda-tanda kardinal radang yaitu kemerahan
(rubor), panas (kalor), ada pembesaran (tumor), terdapat rasa sakit (dolor),
dan hilangnya fungsi (function laesa) (Jorge, 2006).
Tahap keradangan berlangsung pada 72 jam pertama setelah terjadi
luka. Berbagai sel termasuk sel darah putih dan sel radang segera menuju ke
daerah luka untuk memulai proses pembersihan debris (Clark, 2001). Sel
darah putih yaitu neutrofil akan menginvasi daerah tersebut. Neutrofil akan
16
menghancurkan semua debris dan bakteri yang ada pada daerah tersebut.
Adanya neutrofil menandakan mulai terjadinya respon inflamasi yang
ditandai dengan peningkatan aliran darah dan permeabilitas pembuluh darah,
aktivasi reseptor nyeri, dan aktivitas neutrofil dan sel darah putih lain yang
mengeliminasi debris dan bakteri. 48 jam setelah terbentuknya luka, sel
makrofag akan menggantikan peran utama sel neutrofil dalam proses
inflamasi. Makrofag berfungsi menghancurkan neutrofil yang mati dan
eksudat lain yang ada pada daerah tersebut (Goepel, 1992).
Sel-sel makrofag kemudian memproduksi senyawa yang
menyebabkan fibroblast menggandakan diri, fibroblast merupakan sel yang
berperan penting dalam memproduksi protein untuk memperbaiki jaringan,
terutama kolagen (Clark, 2001).
2) Tahapan perbaikan jaringan (Proliferasi)
Perbaikan dan regenerasi jaringan bergantung pada tiga faktor utama
yaitu: eliminasi debris, regenerasi sel-sel endotelial dan produksi fibroblas
yang menyusun jaringan penghubung di seluruh tubuh dan sebagai dasar
dari jaringan parut (Clark, 2001). Fibroblas dan sel endotel merupakan sel
utama yang berperan penting dalam tahap proliferasi pada proses
penyembuhan luka.
Fibroblas mulai muncul ketika terjadi penurunan jumlah neutrofil
dan terjadi peningkatan jumlah makrofag. Fibroblas berimigrasi dari
jaringan sekitar ke daerah luka dimulai 72 jam setelah terjadi luka dan
menggandakan diri oleh karena respon cytokines dan growth factors yang
dilepas pada tahap awal proses penyembuhan luka (Ibelgaufts, 2002).
3) Tahap maturasi jaringan (Remodelling)
Remodeling / fase maturasi dapat berlangsung selama beberapa tahun
dan melibatkan keseimbangan antar degradasi dan pembentukan matriks.
Kebutuhan metabolik penyembuhan luka mengalami penurunan, sehingga
jaringan kapiler mulai berkurang. Matriks kolagen yang dipengaruhi oleh
sitokin dan faktor pertumbuhan terus terdegradasi, resintesis, reorganisasi,
dan distabilkan oleh ikatan silang (cross-link). Fibroblas mulai menghilang
secara bertahap. Tensile strength dari jaringan parut bertahap meningkat dan
17
akhirnya mendekati sekitar 80% dari kekuatan aslinya. Homeostasis kolagen
dan Extra Cellular Matrix (ECM) diatur oleh serine proteases dan matrix
metalloproteinases (MMPs). Inhibitor jaringan dari MMPs mengontrol
aktvitas proteolitik dalam jaringan parut. Setiap gangguan dapat
menyebabkan degradasi matriks yang berlebihan sehingga menghasilkan
bekas luka (Shetty & Bertolami 2004, p.5-6).
2.2 Penyembuhan Luka Pasca Ekstraksi Gigi

Penyembuhan soket setelah ekstraksi gigi merupakan contoh
penyembuhan dengan second intention. Segera setelah pencabutan gigi dari
soket, darah mengisi soket. Bekuan dimulai dalam 24 sampai 48 jam dengan
pembengkakan dan pelebaran pembuluh darah di dalam sisa-sisa ligamen
periodontal, diikuti oleh migrasi leukosit dan pembentukan lapisan fibrin.
Pada minggu pertama bekuan membentuk kerangka (scaffold) sementara dimana
sel-sel inflamasi bermigrasi. Epitel di pinggiran luka tumbuh di atas permukaan
bekuan. Osteoklas yang ada di sepanjang puncak tulang alveolar mulai aktif
meresorpsi. Angiogenesis berlangsung di sisa-sisa ligamen periodontal. Pada
minggu kedua bekuan terus terorganisir melalui fibroplasia dan angiogenesis
yang mulai menembus ke tengah bekuan darah. Pada minggu ketiga soket diisi
dengan jaringan granulasi dan tulang yang sedikit terkalsifikasi. Permukaan luka
sudah mengalami re-epitelisasi dengan pembentukan jaringan parut yang
minimal atau tanpa pembentukan jaringan parut. Remodeling tulang aktif.
Berdasarkan hasil radiografi, pembentukan tulang mulai tampak nyata pada
minggu keenam sampai minggu kedelapan setelah pencabutan gigi (Shetty &
Bertolami 2004, pp.7-8).
2.3 Angiogenesis
Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru yang terjadi
secara alami didalam tubuh, baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Proses
angiogenesis terdiri dari beberapa tahapan yang dimulai dari proses inisiasi, yaitu
dilepaskannya enzim protease dari sel endotel yang teraktivasi, pembentukan
pembuluh darah vaskular, antara lain terjadinya degradasi matriks ekstraseluler
18
(Extra Cellular Matrix, ECM), migrasi dan proliferasi sel endotel, serta
pembentukan ECM baru yang kemudian dilanjutkan dengan maturasi atau
stabilisasi pembuluh darah yang terkontrol dan dimodulasi untuk memenuhi
kebutuhan jaringan (Plank, 2004).
Tahapan-tahapan angiogenesis dapat dijelaskan sebagai berikut:

a) Pelepasan faktor stimulus angiogenik
Kumpulan sel pada jaringan yang mengalami kerusakan atau mengalami
hipoksia, akan melepaskan faktor angiogenik berupa faktor pertumbuhan dan
protein rantai pendek lainnya, yang dapat berdifusi ke sel-sel pada jaringan
sekitarnya kemudian disusul dengan terjadinya proses inflamasi. Pada proses
inflamasi, pembuluh darah kecil yang terdapat secara lokal sel endotel akan
berinteraksi dengan faktor peradangan dan angiogenik. Faktor-faktor angiogenik
ini dapat menarik dan mendorong proliferasi sel endotel dan sel radang.
Menjelang proses migrasi, sel-sel radang juga mensekresi molekul yang juga
berperan sebagai stimulus angiogenik (Carmeliet, 2000).
b) Pelepasan enzim protease dari sel endotel yang teraktivasi
Faktor angiogenik berupa growth factor kemudian berikatan dengan
reseptor spesifik yang terdapat pada reseptor sel endotel (EC) di sekitar lokasi
pembuluh darah lama. Ketika faktor angiogenik berikatan dengan reseptornya,
sel endotel akan teraktivasi dan menghasilkan signal yang kemudian dikirim dari
permukaan sel ke nukleus. Organel-organel sel endotel kemudian mulai
memproduksi molekul baru antara lain adalah enzim protease yang berperan
penting dalam degradasi matriks ekstraseluler untuk mengakomodasi percabngan
pembuluh darah (Lieken et al, 2008).
c) Disosiasi sel endotel dan degradasi ECM yang melapisis pembuluh darah
lama.
Disosiasi sel endotel dari sel-sel sekitarnya, distimulasi oleh faktor
pertumbuhan angiopoietin serta aktivitas enzim yang dihasilkan oleh sel endotel
yang teraktivasi, seperti urokinase-plasminogen activator (uPA) dan matrix
metalloproteinases (MMPs), dibutuhkan untuk menginisiasi terbentuknya
pembuluh darah baru (Polverini, 2002). Pada sistem enzimatik tersebut, sel
endotel dari pembuluh darah lama akan mendegradasi ECM dan menginvasi
19
stroma dari jaringan disekitarnya sehingga sel endotel yang terlepas dari ECM ini
akan sangat responsif terhadap signal angiogenik (Frisca dkk, 2009).
d) Migrasi dan proliferasi sel endotel
Degradasi proteolitik dari ECM segera diikuti dengan migrasinya sel
endotel ke matriks yang terdegradasi. Proses tersebut kemudian diikuti dengan
proliferasi sel endotel yang distimulasi oleh faktor angiogenik, yang beberapa di
antaranya dilepaskan dari hasil degradasi ECM, seperti fragmen peptide, fibrin
atau asam hialuronik (Kleinsmith et al, 2008).
e) Pembentukan lumen dan pembuatan ECM baru
Sel endotel yang bermigrasi tersebut kemudian mengalami elongasi dan
saling mensejajarkan diri dengan sel endotel lain untuk membuat struktur
percabangan pembuluh darah yang kuat. Proliferasi sel endotel meningkat
sepanjang percabangan vaskular. Lumen kemudian terbentuk dengan
pembengkokan dari sel endotel. Pada tahap ini kontak antar sel endotel mutlak
dibutuhkan (Frisca dkk, 2009).
f) Fusi pembuluh darah baru dan inisiasi aliran darah
Struktur pembuluh darah yang terhubung satu sama lain akan membentuk
rangkaian pembuluh darah untuk memediasi terjadinya sirkulasi darah. Pada
tahap akhir, pembentukan struktur pembuluh darah baru akan distabilkan oleh sel
mural (sel otot polos dan pericytes) sebagai jaringan penyangga dari pembuluh
darah yang baru terbentuk. Tanpa adanya sel mural, struktur dan jaringan antar
pembuluh darah sangat rentan dan mudah rusak (Frisca dkk, 2009).
2.4 Vascular Endothelial Growth Factor - A (VEGF-A)

VEGF merupakan glikoprotein pengikat heparin yang disekresi dalam
bentuk homodimer. Salah satu fungsi VEGF yang pertama kali diketahui adalah
memediasi peningkatan permeabilitas pembuluh darah pada mikrovaskular
tumor. Oleh karena itu VEGF disebut juga Vascular Permeability Factor (VPF)
(Berman dkk, 2000).
Dalam keadaan normal, VEGF diekspresikan dalam kadar yang bervariasi
oleh berbagai jaringan, termasuk diantaranya otak, ginjal, hati, dan limpa.
Tekanan oksigen dapat berfungsi sebagai regulator VEGF. Paparan kondisi
20
hipoksia menginduksi ekspresi VEGF dengan cepat. Sebaliknya, dalam
kondisi kadar oksigen normal, ekspresi VEGF menurun dan mengalami
stabilisasi. Tingkat ekspresi VEGF juga bergantung pada jumlah sitokin
inflamatori dan hormon pertumbuhan, termasuk diantaranya Epidermal Growth
Factor (EGF), Interleukin-1β (IL-1β), plateled derived growth factor (PDGF),
Tumor Necrosis Factor (TNF-α), dan transforming growth factor (TGF- β1)
(Goepel. 1992). VEGF beraksi sebagai mitogen yang terbatas pada sel endotel
vaskular dan terlibat dalam banyak tahap respon angiogenik, antara lain
menstimulasi degradasi matriks ekstraseluler disekitar sel endotel, meningkatkan
proliferasi dan migrasi sel endotel, membantu pembentukan struktur pembuluh
darah.
2.5 Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2)

Fibroblast Growth Factor-2 (FGF) merupakan faktor angiogenik yang
juga dapat membentuk kompleks dengan heparin. Kompleks heparin-FGF
membentuk suatu struktur yang tahan terhadap panas dan protease. Ikatan
dengan heparin juga menyababkan terjadinya bentuk dimer dan oligomer dari
FGF, yang akan meningkatkan efisiensi aktivitas sel menyusul terjadinya ikatan
antar FGF dengan reseptornya (Frisca dkk, 2009).
FGFs sebetulnya merupakan sebuah keluarga yang terdiri dari 28
anggota. FGF ditemukan pada kelenjar pituitari, otak, hipotalamus, mata,
kartilago, tulang, corpus luteum, ginjal, plasenta, makrofag, kondrosarkoma, dan
sel hepatoma. Dua struktur primer asam amino dari FGF ditemukan pada tahun
1985, antara lain acid FGF atau a-FGF (tersusun dari 140 asam amino) dan basic
FGF atau b-FGF (tersusun dari 146 asam amino). a-FGF merupakan hasil
faksinasi FGF pada kondisi pH asam, sedangkan b-FGF merupakan hasil
faksinasi FGF pada kondisi basa. Dalam kondisi normal, a-FGF dan b-FGF
terdapat dalam bentuk monomer. Kedua protein ini memiliki homologi asam
amino yang cukup tinggi (53%). Meskipun a-FGF dan b-FGF memiliki reseptor
yang sama (FGFR-1 sampai FGFR-4) namun keduanya memiliki tingkat afinitas
yang berbeda. Afinitas a-FGF dalam pengikatan terhadap reseptornya (FGFR1-4)
lebih tinggi dibandingkan b-FGF. a-FGF banyak terdapat pada otak dan retina
21
dan diketahui berperan dalam menjaga kondisi fisik tubuh, termasuk diantaranya
menjaga homeostasis tubuh seperti pertumbuhan pembuluh darah menjelang
regenarsi jaringan dan penyembuhan luka. Sedangkan b-FGF berperan dalam
pembentukan tumor, memediasi proses angiogenesis dan juga penyambuhan luka
(Frisca dkk, 2009).
Spesifitas a-FGF dan b-FGF cukup luas pada sejumlah sel target,
termasuk diantaranya adalah sel endotel dan sel otot polos, fibroblas dan sel
epitel. Diketahui bahwa faktor angiogenik ini tidak hanya menstimulasi
proliferasi sel endotel secara in vitro (pada konsentrasi 1 sampai 10 mg/ml)
namun juga pada proses angiogenik in vivo. Diantaranya adalah pertumbuhan
pembuluh darah baru pada proses penyembuhan luka dengan meningkatkan
proses reendotelialisasi pada pembuluh darah yang mengalami kehilangan atau
kerusakan sel endotel dan pembentukan pembuluh darah pada vaskularisasi
jantung (Frisca dkk, 2009).
2.6 Fibroblas
Fibroblas adalah sel dominan pada jaringan ikat. Sel ini bertanggung
jawab untuk pembentukan dan pemeliharaan komponen berserat dan substansi
dasar jaringan ikat. Fibroblas biasanya dikenali dengan ciri khas hubungan sel ini
dengan kumpulan serat kolagen. Sel fibroblas dalam kondisi tidak aktif adalah
sel memanjang dengan sedikit sitoplasma dan gelap, inti pipih mengandung
kromatin kental. Fibroblas aktif memiliki bentuk oval, nukleus dan sejumlah
besar sitoplasma berwarna lebih pucat. Tingkat kapasitas sintetis dan sekresi
fibroblas ini dibuktikan dengan jumlah retikulum endoplasma yang kasar, butiran
sekresi, dan mitokondria, dan sejauh mana kompleks Golgi di sitoplasma (Nanci,
2013).
Sel paling dominan yang ditemukan pada jaringan ikat adalah sel
fibroblas. Fibroblas yang penting dalam proses perkembangan, struktur dan
fungsi gigi. Fungsi utama dari fibroblas adalah pembentukan serat ekstraseluler
pada jaringan ikat. Serat yang dibentuk adalah kolagen, elastis, dan oxytalan.
Selain ini, fibroblas melakukan berbagai fungsi lainnya (Chandra et al, 2010).
Fibroblas merupakan sasaran dari banyak golongan protein yang disebut growth
22
factors yang mempengaruhi pertumbuhan sel dan diferensiasi. Pada orang
dewasa, jaringan ikat fibroblas jarang melakukan pembelahan sel. Namun,
fibroblas akan bermitosis dan melanjutkan siklus sel ketika jaringan
membutuhkan fibroblas tambahan yang dirangsang oleh growth factors yang
dilepaskan secara lokal misalnya, untuk memperbaiki organ yang rusak.
Fibroblas yang terlibat dalam penyembuhan luka kadang-kadang disebut
myofibroblasts (Junqueira & Mescher, 2013).
Migrasi fibroblas ke daerah yang cedera didorong oleh chemokines, TNF,
PDGF, TGF-b, dan FGF. Proliferasi fibroblas selanjutnya juga dipicu oleh
beberapa growth factor, termasuk PDGF, EGF, TGF-b, FGF, dan sitokin IL-1 dan
TNF. Makrofag adalah sumber utama untuk zat-zat faktor ini, meskipun sel
inflamasi lain dan trombosit juga dapat menghasilkan zat – zat tersebut (Kumar
et al, 2010).
Fibroblas yang pertama yang masuk ke daerah luka mengandung aktin
melimpah, myosin dan memiliki sifat kontraktil, sehingga sering disebut
contractile fibroblasts atau myofibroblasts. Sel-sel ini menyambung satu sama
lain dan dengan fibril jaringan ikat. Dan ketika berkontraksi, myofibroblasts
dapat menarik tepi luka bersama-sama, sehingga mengurangi luas permukaan
dan memudahkan penyembuhan (Nanci, 2012).
2.7 Platelet-derived growth factor - B ( PDGF-B )

Platelet-derived growth factor (PDGF-B) in vitro merangsang sintesis
DNA dan kemotaksis fibroblas dan sel-sel otot polos dan merangsang kolagen,
glikosaminoglikan, dan produksi kolagenase oleh fibroblas. Sifat-sifat in vitro
menunjukkan bahwa PDGF-B diantarkan oleh trombosit ke cedera in vivo yang
mungkin memainkan peran penting dalam inisiasi proses perbaikan luka.
Penambahan PDGF-B murni dapat mengakibatkan kenaikan yang signifikan
dalam lebar jaringan dan lapisan epidermis. Penambahan PDGF-B dapat
mengakibatkan peningkatan yang signifikan dalam tingkat protein dan sintesis
DNA luka bekas operasi. Efek yang sama diperoleh ketika faktor pertumbuhan
ILGF-1 ditambahkan dalam kombinasi dengan PDGF-B murni. Faktor
pertumbuhan insulin-seperti saya sendiri tidak menyebabkan perubahan morfologi
23
yang signifikan. FGF yang dikombinasi dengan PDGF-B mengakibatkan
penebalan hanya dari epidermis.
2.8 Transforming Growth Faktor – beta1 ( TGF-β1 )

Superfamili Transforming Growth Faktor (TGF-β1) Adalah salah satu
kelompok yang sitokin paling kompleks dengan efek luas pada banyak aspek
pertumbuhan dan perkembangan. Isoform dari TGF-β1 dan anggota keluarga
lainnya, misalnya Activins dan BMP, memiliki efek yang beragam di sejenis
situasi fisiologis dan terlibat dalam proses penyembuhan luka. Manipulasi rasio
TGF-β anggota superfamili, khususnya rasio TGFfil relatif TGFP3, mengurangi
jaringan parut dan fibrosis. Manipulasi tersebut termasuk mengurangi tingkat
TGFβ l / TGFβ-2 menggunakan antibody yang netral atau mencegah aktivasi dari
TGF-β. Pada luka kronis atau gangguan penyembuhan luka dengan penambahan
eksogen anggota superfamili TGF-β1 dapat mempercepat aspek dari proses
penyembuhan. Kumar et al, 2010).
2.9 Protein penanda / marker pada proses inflamasi

Inflamasi atau yang sering dikenal dengan istilah radang merupakan suatu
kejadian normal dari tubuh yang berkaitan dengan sistem kekebalan tubuh.
Inflamasi ini terjadi akibat sistem pertahan yang ada dalam tubuh sudah tidak
mampu lagi melawan paparan benda asing dari tubuh (virus dan bakteri) secara
biologis tempat tempat yang mendapatkan serangan dari luar tersebut akan terjadi
inflamasi atau peradangan. Beberapa produk gen pro-inflamasi telah diidentifikasi
memiliki peran penting pada penekanan apoptosis, proliferasi, angiogenesis,
invasi, dan metastasis. Di antara produk gen tersebut adalah TNF alfa dan anggota
superfamilinya, IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP (Paulo V, 2015).
24
Gambar 1. Jalur signal inflamasi ( Paulo V, 2015).
Jalur pro inflammatory signaling dipengaruhi oleh zinc. Mirip dengan

pensinyalan TLR, jalur pensinyalan IL-1, dan TNF-R bertemu pada kompleks IκB
kinase umum yang memfosforilasi protein penghambat NF-κB, menghasilkan
pelepasan NF-κB dan translokasi ke nukleus. Seng mencegah pemisahan NF-κB
dari protein penghambatnya, sehingga mencegah translokasi nuklir NF-κB dan
menghambat peradangan selanjutnya. Seng juga menghambat aktivasi STAT3
yang dimediasi IL-6 ( Kent LW,1996)..
2.9.1 Interleukin-1 (IL-1)
Merupakan mediator inflamasi yang berikatan dengan IL-8 yang berperan

pada pada reseptor inflamasi pada pembentukan osteoblast pada proses
osteogenesis (Germolec DR, 2010).
25
Gambar 2. Peran Interleukin-1 pada proses osteogenesis (Germolec DR, 2010).
Merupakan mediator inflamasi yang berkembang pada hiperinsulinemia yang

berperan dalam metabolisme karbohidrat dan lemak untuk meningkatkan lipolysis
dengan menghambat lipase (LPL) (Kent LW,1996).
Merupakan mediator inflamasi yang diproduksi oleh sel T-helper , limfosit, B-

limfosit, monosit dan makrofag, dimana dapat menjadi anti inflamasi yang
meregulasi system imun.
2.9.4 Tumor necrosis factor- alpha (TNF-α)
Merupakan mediator inflamasi yang memiliki autokrin, parakrin, dan akssi

endokrin. Dimana sel adiposite memberikan peranan pentingdalam regulasi
akumulasi lemak tubuh.
26
2.9.5 C-Reactive Protein (CRP)
Merupakan marker protein pada fase akut inflamasi, terdiri dari level
serum fibrinogen yang berhubungan dengan pembentukan fibrin, agregrasi
platelet dan viskositas plasma.
2.10 Penanda / marker proses osteogenesis
Metabolisme tulang juga dipengaruhi oleh beberapa protein dan faktor

pertumbuhan, yang dilepaskan dari platelets, makrofag, dan fibroblast. Protein-
protein ini membantu tulang untuk membentuk vaskularisasi baru, menjadi padat,
bergabung dan berfungsi secara mekanis. Protein ini juga menginduksi sel-sel dari
mesenkimal seperti monosit dan fibroblast, untuk bermigrasi, berproliferasi dan
berdifferensiasi di dalam tulang. Protein yang meningkatkan penyembuhan tulang
meliputi BMP, insulin-like growth faktor, faktor pertumbuhan transformasi, faktor
pertumbuhan yang diturunkan dari platelet dan faktor pertumbuhan dari fibroblast
(Lauing et al. 2013).
Protein yang cukup dikenal adalah BMP, derivat glikoprotein yang berasal
dari matriks tulang. Bone Morphogenesis Proteins (BMP) menginduksi sel-sel
mesenkimal untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang. Meskipun biasanya
hadir dalam beberapa saat di dalam tubuh, beberapa BMP telah disintesis
menggunakan teknologi DNA rekombinan dan saat ini sedang menjalani uji klinik
untuk menilai potensinya dalam penyembuhan tulang pada manusia. Protein-
protein yang lain mempengaruhi penyembuhan tulang dengan cara yang berbeda.
Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) mengatur angiogenesis, pembentukan
tulang, sintesis matriks ekstraseluler. Osteonectin, fibronectin dan osteocalsin
berpengaruh pada perlekatan sel, memfasilitasi migrasi sel dan mengaktifkan sel.
(Bellahcene, 2000).
Osteoblas dan osteoklas terdapat pada permukaan tulang kompak dan

tulang kanselus untuk membentuk dan menyerap tulang. Sel-sel progenitor
multipoten di periosteum dapat berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang dan tulang
rawan, yang penting ketika cedera terhadap tulang. Dua jenis sel utama langsung
bertanggung jawab untuk pemeliharaan massa tulang adalah osteoklas
(penyerapan tulang) dan osteoblas (pembentuk tulang) (Sharaway, 2001)
27
Gambar 3. Proses remodelling tulang. (Lauing et al. 2013).
Pada remodelling tulang dimulai oleh perubahan muatan mekanis yang

terdiri dari 4 langkah berturut-turut, yaitu aktivasi, resorpsi, pembalikan, dan
pembentukan. Aktivasib osteoklas dikendalikan melalui jalur
RANK/RANKL/OPG. Setelah deposisi tulang osteoblast dapat berdiferensiasi
menjadi osteosit (osteositogenesis), beralih ke sel-sel yang melapisi tulang, atau
memasuki apoptosis (Bellahcene, 2000).
Sel ini diatur dalam bone remodelling units (BRU) atau basic multicellular
units (BMU), yang mempertahankan aktivasi yang berkesinambungan dari
osteoklas diikuti oleh osteoblas yaitu resorpsi diikuti pembentukan tulang.
Osteoblas mensekresikan matriks organik unmineralized yaitu osteoid, yang
sebagian besar terdiri dari kolagen tipe I, selain proteoglikan, glikoprotein, dan
protein noncollagenous lainnya seperti osteocalcin (Lauing et al. 2013).
28
Gambar 4. Proses Osteogenesis (Kalfas, Iain 2001).
Pada proses sel progenitor (MSC) berpotensi proliferasi dan diferensiasi

menjadi osteosit, termasuk garis keturunan osteogenik dan adipogenik
berdasarkan stimulasi dengan pertumbuhan yang berbeda dan isyarat diferensiasi.
Diferensiasi garis keturunan spesifik adalah proses multi tahap dan terkoordinasi
dengan baik yang diatur oleh master regulator, seperti PPARγ dan EBPβ untuk
adipogenesis dan Runx2 dan osterix untuk osteogenesis. Diferensiasi osteogenik
dapat dipentaskan dengan mengukur alkaline phosphatase (penanda awal) dan
osteocalcin dan osteopontin (penanda akhir) (Lauing et al, 2013).
2.10.1 Bone Sialoprotein (BSP)
Ekspresi gen BSP, yang diinduksi dalam osteoblas yang baru terbentuk,
diatur oleh hormon dan sitokin yang meningkatkan pembentukan tulang dan
diatur oleh faktor-faktor yang menekan pembentukan tulang. Dengan demikian,
BSP memiliki sifat biofisik dan kimia dari nukleator, dan ekspresi temporo-
spasialnya bertepatan dengan mineralisasi de novo di tulang dan sementum.
Namun, kemampuan BSP untuk memediasi perlekatan sel dan memberi sinyal
melalui titik motif RGD untuk fungsi alternatif untuk BSP yang perlu diselidiki
lebih lanjut. Dalam kombinasi, sekuens asam poliglutamat pengikat hidroksiapatit
dan RGD memberikan entitas bi-fungsional yang melaluinya BSP dapat
menengahi penargetan dan perlekatan sel normal dan metastasis pada permukaan
tulang. Bone Sialoprotein (BSP) adalah glikoprotein asam, terfosforilasi yang
disintesis oleh osteoblas dan sel-sel yang menyerupai osteoklastik dalam kultur.
Ini memiliki massa tanpa glukosilasi 33 kDa (glikosilasi, 70-80 kDa). Meskipun
29
fungsi BSP masih belum sepenuhnya dipahami, BSP merangsang pembentukan
hidroksiapatit in vitro dan tampaknya memediasi interaksi sel-sel melalui situs
pengikatan integrin. BSP relatif terbatas pada tulang tetapi juga diekspresikan oleh
trofoblas dan sangat diregulasi oleh banyak tumor ganas (mis. Kanker payudara
dan prostat). Baru-baru ini, telah disarankan bahwa BSP dapat berperan dalam
angiogenesis yang terkait dengan pembentukan tulang, pertumbuhan tumor, dan
metastasis (Bellahcene, 2000). Sejumlah kecil BSP ditemukan dalam sirkulasi
dan dengan demikian merupakan penanda potensial pergantian tulang (Shaarawy,
2001).
Kadar BSP serum dilaporkan meningkat pada penyakit tulang ganas (Diel,
1999; Woitge, 2001) dan osteoporosis pascamenopause, dan menurun dengan
pengobatan antiresorptif (Seibel, 1996; Shaarawy, 2001). BSP stabil pada −80 ° C
tetapi sedikit yang diketahui tentang kinetika dan metabolisme BSP dalam serum.
Penanda dapat berguna dalam deteksi dini metastasis tulang dan gangguan tulang
lainnya, dan pengujian baru dan lebih baik untuk imunoreaktif BSP saat ini
sedang dikembangkan ( Seibel M.J, 1996).
Osteoblas yang telah dewasa/matang secara metabolik aktif merupakan

bone forming cells. Osteoblas mensekresikan osteoid yang merupakan
unmineralized organic matrix yang kemudian mengalami proses mineralisasi yang
menyebabkan tulang menjadi keras dan kaku. Sebagian dari osteoblas berubah
menjadi osteosit, sedangkan sebagian lainnya tetap berada di permukaan
periosteum dan endosteum (Kalfas, Iain 2001).
2.10.2 Alkali Phosphatase (ALP)
Alkali fosfatase (ALP) adalah grup enzim yang dihasilkan oleh hepar,
tulang, usus, plasenta, dan ginjal (tubulus proksimal). ALP akan meningkat dalam
plasma pada keadaan obstruksi saluran empedu, kolestatik intrahepatik, sirosis
hepatis, fatty liver, tumor hepar, metastase hepar, hepatitis, dan intoksikasi obat
(Sherlock, 1979). Alkaline phosphatase (ALP) merupakan enzim yang banyak
ditemukan di hepar (isoenzim ALP-1) dan tulang (isoenzim ALP-2), serta sedikit
diproduksi oleh sel-sel pada saluran pencernaan, plasenta, dan ginjal. ALP sering
30
digunakan untuk mendeteksi penyakit yang berhubungan dengan organ-organ
tersebut.
Kadar ALP dalam darah sangat bervariasi tergantung dari jenis kelamin, usia,
kehamilan, morfometrik tubuh, serta obat-obatan. Peningkatan kadar ALP dapat
terjadi antara lain karena :
1. Obat-obatan seperti glukokortikoid dan antikonvulsan.
2. Pengaruh usia. Kadar ALP tertinggi terdapat pada bayi yang baru lahir,
pada usia 10-11 tahun untuk anak perempuan dan 13-14 tahun untuk anak
laki-laki.
3. Penyakit-penyakit seperti gangguan hepatobilier, hyperadrenocorticism,

dan peningkatan aktivitas osteoblas.
2.10.3 Run-related transcription factor 2 (RUNX2)
Protein runx2 pertama kali terdeteksi pada preosteoblas, dan ekspresi

diregulasi dalam osteoblas imatur, tetapi diturunkan regulasi pada osteoblas
dewasa. Runx2 adalah faktor transkripsi pertama yang diperlukan untuk
penentuan garis turunan osteoblast. Runx2 menginduksi diferensiasi sel
mesenkimal multipoten menjadi osteoblas yang belum matang, mengarahkan
pembentukan tulang yang belum matang, tetapi Runx2 menghambat pematangan
osteoblas dan pembentukan tulang yang matang. Biasanya, tingkat protein Runx2
dalam osteoblas berkurang selama perkembangan tulang, dan osteoblas
memperoleh fenotipe matang, yang diperlukan untuk pembentukan tulang matang.
Lebih jauh, Runx2 memicu ekspresi gen matriks tulang utama selama tahap awal
diferensiasi osteoblas, tetapi Runx2 tidak penting untuk pemeliharaan ekspresi
gen ini dalam osteoblas dewasa (Bruderer M, et al, 2014).
Mekanisme yang bertanggung jawab atas regulasi gen Runx2 sendiri baru
saja mulai dipahami. Sebelumnya diasumsikan bahwa Runx2 mengatur gen
osteogenik dimediasi semata-mata oleh kadar protein Runx2, dan karenanya kadar
mRNA. Asumsi ini didasarkan pada data yang dikumpulkan dari model non-
31
manusia (biasanya tikus). Studi terbaru miliki menunjukkan bahwa kadar Runx2
selama in vitro diferensiasi osteoblas manusia primer tidak menunjukkan
perubahan besar, sedangkan kadar gen hilir seperti sialoprotein tulang dan alkaline
phosphatase meningkat secara dramatis. Data menunjukkan itu Level runx2
mRNA diekspresikan secara konstitutif, dengan kurangnya korelasi antara Runx2
mRNA / tingkat protein dan perolehan fenotip osteoblas (Kirkham GR and
Cartmell SH, 2007).
2.10.4 Collagen 1 Alpha 1 (Coll11)
Gen Coll11 memberikan instruksi untuk membuat bagian dari molekul

besar yang disebut kolagen tipe I. Kolagen adalah keluarga protein yang
memperkuat dan mendukung banyak jaringan dalam tubuh, termasuk tulang
rawan, tulang, tendon, kulit, dan bagian putih mata (sklera). Kolagen tipe I adalah
bentuk kolagen paling melimpah di tubuh manusia. Komponen kolagen tipe I
yang disebut rantai pro-α1 (I) diproduksi dari gen Coll11. Kolagen dimulai
sebagai molekul prokolagen seperti tali yang masing-masing terdiri dari tiga
rantai. Kolagen tipe I terdiri dari dua rantai pro-α1 (I) dan satu rantai pro-α2 (I)
(yang dihasilkan dari gen Coll12). Molekul prokolagen tiga-untai diproses oleh
enzim di luar sel untuk membuat kolagen dewasa. Molekul-molekul kolagen
kemudian mengatur diri mereka sendiri menjadi fibril-fibril panjang dan tipis
yang membentuk interaksi stabil (ikatan silang) satu sama lain dalam ruang-ruang
di antara sel-sel. Cross-link menghasilkan pembentukan serat kolagen tipe I yang
sangat kuat (Gastelbondo,2018).
2.10.5 OSTERIX (OSX)

Osterix(OSX) adalah factor transkripsi yang mengandung zinc finger yang
penting untuk diferensiasi osteoblast dan pembentukan tulang, terutama di
ekspresikan pada semua tulang dalam masa perkembangan. Jika tidak ada osterix
maka tidak ada tulang kortikal dan trabekula yang terbentuk melalui
intramembran atau osifikasi endochondral. Selama pembentukan tulang
endochondral yang normal, degradasi matriks tulang rawan yang termineralisasi
oleh osteoclast dan deposisi dari matriks tulang terjadi dengan koordinasi ketat.
32
Pada kondisi tidak ada OSX, sel mesenkim dari periosteum dengan pembuluh
darah menginvasi matriks mineral dari daerah kondrosit yang mengalami
hipertrofi. Sel mesenkimal yang bermigrasi dengan osteoclast dan pembuluh
darah tidak dapat mendeposit matriks tulang, sehingga tidak terjadi penulangan
pada matriks dengan mesenkim (Kazuhisa et al, 2012).
Penelitian yang dilakukan oleh Ying Cao.,Et al.2008 menunjukan adanya
down regulasi pada level transkripsional oleh OSX terhadap ekspresi dan produksi
dari IL-1α, suatu sitokin yang menstimulasi pembentukan osteoklas dengan
memproduksi RANKL oleh sel stromal sumsum tulang dan osteoblast. Sitokin
seperti IL-1α, IL-6, IL-11, dan prostaglandin E2 menunjukan partisipasi dalam
proses bone remodelling dengan menginduksi RANKL dan pembentukan
osteoklas. Karena itu perubahan dari kadar sitokin ini dapat mempengaruhi bone
lysis (Ying Cao et al, 2008)
2.11 Kulit Buah Manggis
Manggis merupakan tanaman buah berupa pohon yang berasal dari hutan
tropis yang teduh dikawasan Asia Tenggara, yaitu hutan belantara Malaysia atau
Indonesia. Manggis memiliki nama latin Garcinia mangostana L dan termasuk ke
dalam keluarga Clusiaceae. Buah manggis dikenal dengan sebutan Queen fruit
atau ratunya buah. Hasil penampisan fitokimia ekstrak kulit buah manggis
menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung komponen kimia alkaloid,
saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid, steroid dan glikosida.
Dibandingkan dengan buah yang lainnya, kandungan antioksidan dalam kulit
manggis juga jauh lebih tinggi. Kulit manggis pun dapat dipakai untuk kemoterapi
dan untuk mengurangi dampak dari kemoterapi (Lih-Geeng et al, 2008).
Komponen aktif utama dari buah manggis disebut xanthones. Xanthone
adalah sejenis senyawa polifenol yang secara biologis aktif dan secara struktural
mirip dengan bioflavanoids. Senyawa ini jarang terdapat di alam, paling banyak
ditemukan hanya dalam dua keluarga tanaman. 200 jenis xanthones alami yang
sejauh ini telah diidentifikasi. Sekitar 40 jenis diantaranya telah ditemukan dalam
buah manggis. Xanthone dan turunannya telah terbukti memiliki beberapa
manfaat, termasuk anti-inflamasi dan anti-alergi (Cui et al, 2010). Berdasarkan
33
studi literatur penelitian Garcinia mangostana L mempunyai aktivitas anti
inflamasi adalah -mangosten dan -mangosten yang merupakan senyawa utama
dari xanthone yang menghambat produksi enzim siklooksigenase(COX) yang
merupakan penyebab radang (Jung dkk, 200. Beberapa uji pra-klinik pada hewan
coba tikus menunjukkan zat aktif gamma mangostin (derivat xanthone) secara
langsung menghambat aktivitas enzim Ikappa B kinase mencegah proses
transkripsi gen COX-2 (gen target NF-kappaB), menurunkan produksi PGE2
dalam proses inflamasi (Middleton, 2000). Penelitian sebelumnya membuktikan
bahwa xanthone dalam ekstrak kulit manggis menghambat aktivitas ROS
intraselular. Inhibisi aktivitas ROS intraselular akan menghambat aktivitas enzim
yang mengaktifkan nuclear factor kappa B (NF-kB) untuk translokasi ke dalam
nukleus dan meregulasi mediator pro-inflamasi seperti IL-1, IL-6, TNF-alpha
(Ibrahim, 2014).
2.12 Methyl-Thiazol-Tetrazolium atau MTT Assay

MTT assay merupakan alat yang berfungsi untuk melihat viabilitas sel.
NAD(P)H MTT assay merupakan Methyl-Thiazol-Tetrazolium suatu metode 3-
(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Metode ini
merupakan metode menggunakan uji enzimatik yang bertujuan untuk mengukur
kemampuan sel hidup berdasarkan aktivitas mitokondria dari kultur sel. Prinsip
dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium oleh sistem
reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam
mitokondria sel-sel yang hidup membentuk Kristal formazan berbentuk Kristal
formazan berbentuk Kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air.
Penambahan reagen stopper bersifat detergenik akan melarutkan Kristal berwarna
ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA Reader.
Pengukuran menggunakan alat spectrophotometer menghasilkan data
berupa angka-angka optical density. Angka optical density tersebut merupakan
nilai dari kepekaan yang ditunjukkan dengan warna ungu pada kultur sel tersebut.
Semakin pekat warna yang dihasilkan, maka semakin tinggi angka optical density
nya. Intensitas warna ungu yang terbentuk merupakan gambaran proporsional
dengan jumlah sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar,
maka diartikan bahwa jumlah sel hidup semakin banyak.
34
2.13 Wound Healing Assay
Uji scratch assay secara in vitro adalah metode yang mudah, murah dan
dikembangkan untuk mengukur migrasi sel secara in vitro. Langkah awal dengan
membuat "goresan" dalam sel monolayer, mendokumentasikan gambar di awal
scratch dan secara berkala selama migrasi sel untuk menutup goresan, dan
membandingkan gambar untuk mengukur tingkat migrasi sel. Dibandingkan
dengan metode lain, uji ini sangat sesuai untuk mempelajari tentang efek interaksi
sel-matriks dan sel-sel pada migrasi sel, melihat pola migrasi sel selama
penyembuhan luka secara in vivo dan kompatibel dengan pencitraan sel hidup
selama migrasi secara intraselular. Selain memonitor migrasi populasi sel
homogen, metode ini juga telah diadopsi untuk mengukur migrasi sel individual di
tepi awal goresan. Uji ini biasanya menggunakan waktu yang beragam mulai dari
beberapa jam setelah goresan sampai 24 jam.( Chi Liang et al,2007)
2.14 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan suatu sekuen
nukleotida tertentu secara in vitro. Metode PCR sangat sensitif, sehingga dapat
digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA spesifik. Metode PCR dapat
melipatgandakan suatu fragmen DNA sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20
siklus reaksi selama 220 menit. Empat komponen utama pada proses PCR adalah
(1) Template DNA, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2)
oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (25 – 25 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, (3)
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan
(4) enzim DNA polymerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi rantai
DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer (Yuwono, 2006).
Reaksi melipatgandakan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan
denaturasi template DNA sehingga rantai DNA rantai ganda (double stranded)
akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan
dengan menggunakan panas (95oC) selama 1–2 menit, kemudian suhu diturunkan
menjadi 55oC sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang
telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen
35
dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer.
Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Suhu inkubasi kemudian
dinaikkan menjadi 72oC selama 1,5 menit, pada suhu ini DNA polymerase akan
melakukan proses polimerisasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang
ada pada daerah cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk selajutnya akan 20
didenaturasi lagi dengan menaikan suhu inkubasi menjadi 95oC. Rantai DNA yang
baru terbentuk selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerisasi
berikut. Reaksi-reaksi diulang sampai 25–30 siklus. Banyaknya siklus amplifikasi
tergantung dari konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi, akan tetapi,
pada umumnya konsentrasi DNA Taq polimerisasi terbatas setelah 25–30 siklus
(Yuwono, 2006.; Sambrook et al., 1989).
2.15 Real-Time PCR

Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan salah satu
teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern. RT-PCR
memiliki berbagai keunggulan untuk amplifikasi atau perbanyak DNA fragmen
yang dapat diamati secara tepat untuk menentukan konsentrasi DNA yang terdapat
dalam sampel (Higuchi, 1993).
Prinsip proses amplifikasi menggunakan real-time PCR dengan cara
mengukur peningkatan pewarna (dye) fluoresen yang berpendar ketika terikat
dengan double-stranded DNA. Oleh karena sifat inilah pertumbuhan fragmen
DNA hasil amplifikasi sapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang
terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluoresensi yang dihasilkan Quantitative
PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga
hitungan pictogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang
sangat tinggi. Hasil peningkatan fluoresensi digambarkan melalui kurva
amplifikasi yang menunjukkan 3 fasa yaitu fase awal, fase eksponensial atau
puncak dan fasa plateau atau stabil (Hoongbao et al, 2016).
Terdapat tiga komponen utama dalam instrument RT-PCR yaitu thermal
block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan
software sebagai analisis data. Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak
36
sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates (Soong R et al,
2001).
2.16. Osteoblastic cell line MC3T3-E1

MC3T3-E1 mewakili garis sel osteoblast popular mewakili fenotip pra
osteoblastik. Beberapa sub-klon telah dibentuk dari yang baru lahir ini garis sel
klonal calvaria tikus. Terdapat 5 diantaranya subklon 4,8,11,14, dan 26. Sub-klon
mineralisasi menyatakan tingkat tinggi mRNA untuk BSP, osteocalcin, dan
reseptor PTH/ PTHrP. Dari klon-klon ini hanya sub-klon 4 dan 14 yang
ditunjukkan untuk membuat mineral matriks ekstraseluler kolagen dan mirip
dengan osteogenesis intramembran in vivo.
2.17 Lipopolisakarida (LPS)
Lipopolisakarida merupakan memberan luar bakteri gram negative, yang

terdiri dari kompossi endotoksin terdiri ata rantai polisakarida (Rantai O).
Endotoksin bakteri gram negative mangikat larutan LPS-Binding protein atau
membrane luar sel mononukleus. Pengaruh interaksi antara monosit, makrofag
dan netrofil melepas mediator inflamasi seperti Interleukin (IL), Interferon (IF),
Platelet activating factor (PAF) dan Tumor necrosis factor (Naqvi, 2015).
Gambar 5. Komponen Membran luar gram negative (LPS) (Naqvi, 2015).
Metabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan

merangsang terjadinya inflamasi, di antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS)
37
yang dikandung dinding sel bakteri gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri
mati.8 Bakteri agresif penyebab periodontitis terutama adaMetabolit bakteri dan
produk toksik dapat merusak jaringan dan merangsang terjadinya inflamasi, di
antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS) yang dikandung dinding sel bakteri
gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri mati. Bakteri agresif penyebab
periodontitis terutama adalah Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis).
P.gingivalis (viable atau konstituennya) teridentifikasi pada plak aterosklerotik
manusialah Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). P.gingivalis (viable atau
konstituennya) teridentifikasi pada plak aterosklerotik manusia (Harazy, 2000).
BAB III
38
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian merupakan penelitian experimental laboratories.
3.2 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah post test only control group
design.
3.3 Sampel dan Besar Sampel
3.3.1 Jenis Sampel
Sampel penelitian menggunakan kultur sel human gingival fibroblast yang

diperoleh dari laboratorium Tropical Disease Center Universitas Airlangga
Surabaya dan Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 yang didapatkan dari
Universitas Hiroshima Jepang
3.3.2 Besar Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposive sampling. Penentuan besar
sampel penelitian ditentukan dengan menggunakan rumus Lemeshow:
n:2
Keterangan:
: banyaknya sampel tiap kelompok
: standar deviasi kelompok kontrol
39
: nilai pada distribusi normal standar yang sama denga tingkat kemaknaan
(untuk = 0.05 adalah 1.64)
: nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan power test sebesar
yang diinginkan (untuk β= 0.10 adalah 1.282)
: beda rata-rata masing-masing kelompok
Dalam rumus ini diperoleh besar sampel minimal adalah 2.
3.4 Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas
Ekstrak kulit manggis
b. Variable Tergantung
Ekspresi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP
Ekspresi Col1α, Osterix, Runx-2, Bsp dan ALP.
Ekspresi PDGF, FGF, VEGF, TGF-β
c. Variable Terkendali
- Kultur sel Human Gingiva Fibroblast
- Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1
- Kriteria sampel
- Volume pemberian ekstrak kulit manggis
- Tempat pemeliharaan kultur sel dalam kondisi yang sama
- Lingkungan dengan temperature, suhu kamar (25o-27o C)
- Pemeriksaan dengan menggunakan RT-PCR dan Realtime-PCR
40
3.5 Definisi operasional
3.5.1 Human gingival fibroblast
Human gingival fibroblast (HGnF) adalah sel yang diisolasi dari human gingiva, di
cryopreserved pada passage one dan dalam kondisi beku. Bebas dari HIV-1, HBV, HCV,
mycoplasma, bakteri, yeast dan fungi.
3.5.2Osteoblastic cells line MC3T3-E1

MC3T3-E1 Adalah sel precursor osteoblast yang berasal dari tulang Calvaria Mus
Musculus ( Mouse C57BL/6 calvaria). Dengan medium MEM α + 2mM Glutamine + 10%
Foetal Bovine Serum (FBS)
3.5.3 LPS
Lipopolisaccharides ( LPS ) adalah komponen karakteristik dari dinding sel bakteri gram
negative, terlokalisasi di lapisan luar membrane dan termasuk dalam golongan tidak
berkapsul, terpapar pada permukaan sel. LPS berkontribusi pada integritas membrane luar,
dan melindungi sel terhadap garam empedu dan antibiotic lipofilik.
3.5.4 Ekstrak Kulit manggis

Ekstrak kulit manggis adalah ekstrak yang dibuat dengan 200gram serbuk kulit manggis
(Garcinia mangostana L.) yang dibasahi dengan pelarut DMSO 0,1% dan dishacker selama
2x24 jam, disaring dengan 3x penyaringan menggunakan kain saring, dan di rotary
evaporator dengan waktu 12 jam menjadi 40cc ekstrak.
3.5.5 Ekspresi marker penanda inflamasi

3.5.5.1 IL-1
Interleukin-1A Mouse Recombinant yang diproduksi di E.Coli adalah rantai Polipeptida
tunggal, non-glikosilasi yang mengandung 156 asam amino dan memiliki massa molekul
17,9 kDa. IL-1A dimurnikan dengan teknik kromatografi eksklusif. Interleukin 1 alpha
(IL1α) juga dikenal sebagai hematopoietin 1 adalah sitokin dari keluarga interleukin 1 yang
41
pada manusia dikodekan oleh gen IL1A. IL1α diproduksi terutama oleh makrofag
teraktivasi, serta neutrofil, sel epitel, dan sel endotel. Memiliki aktivitas metabolik,
fisiologis, hematopoietik, dan memainkan salah satu peran sentral dalam pengaturan
respons imun. Ia berikatan dengan reseptor interleukin-1 dan di jalur yang mengaktifkan
tumor necrosis factor-alpha
3.5.5.2 IL-6
Interleukin-6 Mouse Recombinant yang diproduksi di E.Coli adalah rantai polipeptida non-
glikosilasi tunggal yang mengandung 187 asam amino dan memiliki massa molekul 21709 Dalton.
IL-6 dimurnikan dengan teknik kromatografi eksklusif. Interleukin-6 adalah sitokin proinflamasi
yang kuat, utamanya diproduksi oleh sel T teraktivasi dan bermacam sel lainnya termasuk sel
endotel dan makrofag. IL-6 mempengaruhi limfosit B dan T dan telah terbukti memiliki peran
dalam pertahanan inang, reaksi fase akut, respon imun dan hematopoiesis.
3.5.5.3 IL-10
IL10 adalah sitokin yang diproduksi terutama oleh monosit dan pada tingkat lebih rendah oleh
limfosit. Sitokin ini memiliki efek pleiotropik dalam imunoregulasi dan peradangan. Mendown-
regulasi ekspresi sitokin Th1, MHC kelas II Ags, dan molekul costimulatory pada makrofag. Ini
juga meningkatkan kelangsungan hidup sel B, proliferasi, dan produksi antibodi. Sitokin ini dapat
memblokir aktivitas NF-kappa B, dan terlibat dalam regulasi jalur pensinyalan JAK-STAT.
3.5.5.3 TNF α
Tumor necrosis factor-α (TNF-α) adalah sitokin proinflamasi yang kuat yang memainkan peran
sentral dalam aktivitas antitumor, modulasi imun, peradangan, anoreksia, cachexia, syok septik,
replikasi virus, dan hematopoiesis.
TNF-α diekspresikan oleh beragam sel, dengan banyak agen induktif dan supresif. Terutama, TNF-
α diproduksi oleh makrofag dalam menanggapi tantangan imunologis seperti bakteri
(lipopolysaccharides), virus, parasit, mitogen dan sitokin lainnya
42
3.5.5.4 CRP
C-Reactive Protein (CRP), juga dikenal sebagai Pentraxin 1, adalah protein pentamerik yang
disekresikan yang berfungsi sebagai sensor dan aktivator untuk respon imun bawaan. Pada
manusia, itu adalah protein fase akut utama; konsentrasinya yang beredar meningkat secara
dramatis pada permulaan peradangan.
3.5.6 Ekspresi marker penanda osteogenesis
3.5.6.1 Osterix
Osterix (Osx) adalah faktor transkripsi khusus osteoblas yang penting untuk diferensiasi osteoblas
dan pembentukan tulang. Tikus knock-out Osx kekurangan tulang sepenuhnya. Satb2 sangat
penting untuk diferensiasi osteoblas sebagai faktor transkripsi pengikatan kaya AT
3.5.6.2 Coll1α
Kolagen tipe I bertanggung jawab untuk stabilitas mekanik, elastisitas, kekuatan dan
ketangguhan, diamati pada tendon, ligamen, kulit, kornea, tulang, dentin dan banyak
jaringan lainnya. Kolagen tipe 1 memiliki peran struktural dalam matriks ekstraseluler
dengan memberikan dukungan mekanis dan ketahanan terhadap ketegangan. Beberapa
penyakit genetik yang lebih penting, secara langsung atau tidak langsung melibatkan jenis
kolagen ini termasuk sebagian besar kasus osteogenesis. Kolagen tipe I berkontribusi
maksimal pada kandungan protein berserat pada mamalia. Protein ini memiliki struktur
silinder memanjang dengan ujung meruncing, memiliki heliks tangan kiri dengan tiga
helai polipeptida tipe-poliproline II.
3.5.6.3Runx-2
Faktor transkripsi yang terlibat dalam diferensiasi osteoblastik dan morfogenesis kerangka.
Penting untuk pematangan osteoblas dan osifikasi intramembran dan endokhondral. CBF
berikatan dengan situs inti, 5'-PYGPYGGT-3 ', dari sejumlah peningkat dan promotor,
termasuk virus leukemia murine, penambah poliamavirus, peningkat reseptor sel-T,
43
osteocalcin, osteopontin, sialoprotein tulang, alfa 1 (I) kolagen , Promotor LCK, IL-3 dan
GM-CSF. Menghambat aktivasi transkripsi tergantung KAT6B (Dengan kesamaan). Dalam
osteoblas, mendukung aktivasi transkripsi: bersinergi dengan SPEN / MINT untuk
meningkatkan aktivasi yang dimediasi FGFR2 dari elemen responsif FGF osteocalcin FGF
(OCFRE)
3.5.6.4 BSP
BSP (Bone Sialoprotein) adalah komponen dari jaringan mineral seperti tulang, dentin,
sementum dan kartilago terkalsifikasi. BSP adalah komponen signifikan dari matriks
ekstraseluler tulang dan telah disarankan untuk membentuk sekitar 8% dari semua protein
non-kolagen yang ditemukan dalam tulang dan sementum. sebagian besar spesifik untuk
jaringan mineral dan diekspresikan selama pembentukan awal tulang dan sementum.
3.5.6.5 ALP
ALP (Alkaline phosphatase) adalah enzim yang ditemukan di beberapa jaringan di seluruh
tubuh. Konsentrasi ALP tertinggi hadir dalam sel -sel yang terdiri dari tulang dan hati.
Peningkatan kadar ALP dalam darah paling sering disebabkan oleh penyakit hati atau
gangguan tulang. Tes ini mengukur tingkat ALP dalam darah.
3.6 Tahapan Penelitian
Ekstrak yang didapatkan dari proses ekstraksi kulit buah manggis jenis Garcinia
mangostana dengan metode maserasi yang dilarutkan dalam larutan DMSO 0,1%
(Poelongan & Praptiwi, 2010)
44
1. Pemeliharaan kultur sel thowing human gingival fibroblast dilakukan mulai dari
membangunkan sel (selama ± 2 minggu).

1. Sel thawing human gingival fibroblast dilakukan multiple scratch dan diinkubasi
selama 24 jam
2. Masing-masing sampel diberi ekstrak kulit manggis sebanyak 800 µg/ml pada
kelompok treatment dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator 37ºC

3. Setelah 24 jam maka setiap sampel dilakukan ekstraksi RNA dan protein.
4. Dilakukan RT-PCR dengan primer PDGF, FGF, VEGF dan TGF-β.
5. Dilakukan pemeriksaan western blotting dengan antibody PDGF, FGF, VEGF,
TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP.

6. Dilakukan Immunohistokimia pada tepi guratan wound healing assay dengan
antibody PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP

7. Dilakukan penelitian wound healing assay dan dilihat wound closure setiap 24 jam,
48 jam dan 72 jam.

8. Hasil dari RT-PCR kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel
elektroforesis dan dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet untuk melihat katebalan
dari band.
9. Hasil dari immunohistokimia akan dihitung setiap sel yang memancarkan protein
PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP
Ekstrak yang didapatkan dari proses ekstraksi kulit buah manggis jenis Garcinia
mangostana dengan metode maserasi yang dilarutkan dalam larutan DMSO 0,1%
(Poelongan & Praptiwi, 2010)
1. kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan mulai dari membangunkan
sel (selama ± 2 minggu)

2. Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 diberi perlakuan LPS
(Lipopolisakarida) sehingga terjadi respon inflamasi selama 24 jam.

3. Masing-masing sampel diberi ekstrak kulit manggis sebanyak 800 µg/ml pada
kelompok treatment dan diinkubasi selama 48 jam di dalam inkubator 37ºC

4. Setelah 72 jam maka setiap sampel dilakukan ekstraksi RNA
5. Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan RT-PCR dengan untuk
melihat marker osteogenesis: Osterix, Col1α, Runx-2, Bsp dan ALP
45
6. Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan RT-PCR dengan untuk
dmelihat marker inflamasi: IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP.

7. Dilakukan penelitian dengan waktu perlakuan pada sampel setiap 6 jam, 12 jam,
24 jam, 48 jam dan 72 jam.

8. Hasil dari RT-PCR kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel
elektroforesis dan dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet untuk melihat katebalan
dari band.
3.7 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada tahun 2019 mulai bulan Agustus sampai Desember, dengan
rincian tempat penelitiannya, adalah:
a. Pembuatan ekstrak di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas
Airlangga.
b. Pemeliharaan, pemberian perlakuan serta analisis hasil pada kultur sel thowing
human gingival fibroblast dilakukan di Tropical Disease Center Universitas
Airlangga.
c. Pemeliharaan, pemberian perlakuan serta analisis hasil pada kultur sel osteoblastic
cells line MC3T3-E1 dilakukan di Hiroshima University Japan
3.8 Alat dan Bahan penelitian
3.8.1 Alat Penelitian

a. PCR cycle (Gene Amp, PCR System 2400, Perkin Elmer)
b. Spectrophotometer (UV-Visible Spectrophometer, Shimatzu)
c. Electrophoresis
d. Centrifuge (Himac SCR 20B, Hitachi)
e. Ependorf micropipette White tips (0,5-10µl), yellow tips (10-100µl) dan blue
tips (100-1000 µl)

f. Tips Micropipet White, Yellow dan Blue
g. Transluminator UV
h. Kamera digital dengan resulusi 3,2 megapixel atau diatasnya
i. Transsonic 310 (Elma)
j. Spinator (Millipore)
k. Tabung eppendorf 0,5cc dan 1,5cc
l. Timbangan elektrik (Libror EB-3200B,Shimadzu)
46
3.8.2 Bahan Penelitian
A. Bahan untuk ekstraksi RNA:
a. DNAzol® Reagent (Organic method) 1 ml
b. larutan 100% ethanol 0,5 ml
c. larutan 75% ethanol 0,8 – 1 ml
d. Distilled water (Sigma) 25 – 30 µl
B. Bahan untuk PCR:
a. PCR Mix (12,5 µl) yang terdiri: dNTP (ATP, CTP, TTP, GTP), MgCl2 dan
Taq Polimerase.
b. DW sigma (Nuclease Free water)
c. Primer forward dan Reverse
PDGF ( 489 bp ) :
Forward : 5’ –CTGGGCACGTGAGGGCAGCGTCT-3’
Reverse :5’ –TGCCGGAAGTCCATCCTCACAGTC-3’
FGF ( 453 bp ) :
Forward : 5’ –CCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG-3’
Reverse :5’ –GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG-3’
VEGF ( 478 bp ) :
Forward : 5’‐UGUAGCAGCCAGGGCCUAGAGAAGG‐3’
Reverse :5’‐TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
TGF-β ( 455 bp ) :
Forward : 5’‐ACCACAGTCCATGCCATCAC‐3’
Reverse : 5’‐TGGAGGACCTGGTAGAGGAA‐3’
ALP ( 97 bp ) :
Forward : GGCTTCTTCTTGCTGGTGGAA
Reverse : CCTGGTCCATCTCCACTGCT
Coll1 α (137 bp):

Forward : GCTTCTACCTCAGCCGCAT
Reverse : TTTCACCACATCAGACACGCT
BSP (128 bp):

Forward : TTTGGAGAGTCCAGAGCGAC
Reverse : TAAAGGCCATTCCACCACCA
47
RUNX2 (168 bp):
Forward : ATCCCCATCCATCCACTCCA
Reverse : AGTTCTGAAGCACCTGCCTG
Osterix ( 131 bp)

Forward : 5′-GCCTACTTACCCGTCTGACTTT-3′
Reverse : 5′-GCCCACTATTGCCAACTGC-3′
IL-1 ( 152 bp )
Forward : CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G
Reverse : GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA
IL-6 (141 bp )
Forward : CAG AAT TGC CAT CGT ACA ACT CTT TTC TCA
Reverse : AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA
IL-10 ( 190 bp )
Forward : GGT TGC CAA GCC TTA TCG GA
Reverse : ACC TGC TCC ACT GCC TTG CT
TNF α ( 155 bp )
Forward : GGGGCCACCACGCTCTTCTGTC
Reverse : TGGGCTACGGGCTTGTCACTCG
CRP (440 )
Forward : TCGTATGCCACCAAGAGACAAGACA
Reverse : AACACTTCGCCTTGCACTTCATACT
C. Bahan Elektroforesis
a. 40% acrylamide:bis (19:1)
b. TEMED
c. TBE 0,5%
d. Marker 100 bp
e. Urea
f. Bind silane (methacryloxypropyltrimethoxysilane)
g. Distilled water (Sigma)
h. 10% Amonium Persulfat (APS)
48
i. Gel Slick®
j. 0,5% asam asetat dalam 95% ethanol
3.9 Cara Kerja

3.9.1 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Kulit buah manggis yang baru diambil dari pohonnya ditimbang sebanyak 2500
gram, dikuliti, ditinggal batangnya saja dan ditimbang lagi hingga 1000 gram. Kemudian
diblender hingga halus dan ditimbang lagi hingga tinggal 850 gram. Ditambahkan
aquadest steril sebanyak 150 cc, kemudian disaring menggunakan alat Bugner yang
dihubungkan dengan Vacuum pump (Gast, USA) hingga tinggal 820 cc ekstrak kulit buah
manggis. Dari hasil freeze dryed, bubuk ekstrak kulit buah manggis ditimbang kembali
hingga tinggal 2.7 gram. Hasil dari freeze dryed kulit buah manggis diambil sebanyak 0.5
gram kemudian dihaluskan untuk digunakan dalam penelitian ini. Sedangkan sisanya
disimpan di dalam botol dan ditutup menggunakan kertas perak (Farmakope, 1995).
3.9.2 Kultur sel

3.9.2.1 Human gingival Fibroblast
Kultur sel Human Gingiva Fibroblast dibangunkan dari keadaan beku. Sel kemudian di
kultur kedalam medium DMEM + 10% FBS + 1% Streptomycin dan di inkubasi kedalam
inkubator 37ºC selama 1 bulan untuk mendapatkan hasil yang maksimal.
3.9.2.2 Osteoblastic clls line MC3T3-E1
Kultur sel Osteoblastic clls line MC3T3-E1 dibangunkan dari keadaan beku. Sel kemudian
di kultur kedalam medium DMEM + 10% FBS + 1% Streptomycin dan di inkubasi
kedalam inkubator 37ºC selama 1 bulan untuk mendapatkan hasil yang maksimal.
3.9.2.3 Pemberian Ekstrak Kulit Buah Manggis Pada Kultur sel Human gingival
Fibroblast dan Osteoblastic cells line MC3T3-E1.

Ekstrak kulit buah manggis sebanyak 600 µg/ml di campur dengan medium yang
berisi sel Human gingival Fibroblast dan Osteoblastic cells line MC3T3-E1
pada 6 wells dish dan di inkubasi selama 24 jam didalam inkubator 37ºC.
49
3.10 Polymerase Chain Reaction ( PCR )
3.10.1 Ekstraksi RNA

1. Hasil irigasi ditambah 1 ml RNAzol® Reagent, keduanya dicampur dengan cara
di-vortex, kemudian inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar. Selanjutnya di
centrifuge 10.000 rpm selama 10 menit temperatur 4 0C, diambil viscous
supernatant dan dipindahkan tabung baru.

2. Pada tabung baru tersebut ditambahkan 0,5 ml 100% ethanol (absolute), di bolak-
balik, di inkubasi pada suhu kamar selama 1-3 menit, centrifuge 4000 rpm selama
1-2 menit temperatur 40C. Supernatant dibuang dengan hati-hati agar RNA
(pelet) tidak ikut terbuang.

3. Pelet dicuci dengan 0,8-1 ml 75% ethanol sebanyak 2 kali dan setiap kali
pencucian tabung dibolak-balik sebanyak 3-6 kali.

4. Tabung diletakkan pada posisi tegak selama 0,5-1 menit, setelah itu ethanol 75%
dibuang dengan cara pipeting atau decanting. Pelet dikeringkan dengan cara
membiarkan tabung terbuka selama 5-15 detik.

5. Pelet yang berisi RNA tersebut dilarutkan dengan 25-30 µl DW, di-vortex
secukupnya, kemudian di simpan pada suhu -20º C.
3.10.2 Pengukuran kadar dan kemurnian RNA
Pengukuran kadar dan kemurnian RNA pada sampel penelitian yang sebelumnya
telah diekstraksi RNAnya menggunakan UV-spectrophotometer. Kemurnian RNA ini
diukur dengan nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Nilai panjang gelombang 260 nm digunakan untuk pengukuran kuantitas atau kadar RNA
dengan rumus berikut:
Kadar RNA = (A260 x faktor pengenceran x 50) μg/mL
Keterangan :
50
A260: nilai absorbansi sampel RNA pada panjang gelombang 260 nm
50 (Konversi Spectrophotometer): Nilai satu dalam satuan absorbansi gelombang 260 nm
sama dengan 50 µg/ml RNA.
Idealnya, nilai ratio (λ260 : λ280) yang didapatkan seharusnya berkisar antara 1.8 – 2.0
(RNA dikatakan murni atau kualitas RNA baik). Jika nilai ratio lebih kecil dari 1.8, berarti
RNA tersebut telah terkontaminasi dengan protein lain. Namun bila nilai ratio lebih besar
dari 2.0, ada RNA dalam sampel tersebut (QIAGEN, 2001; Jain, 2004; Moore et al, 2004;
Saili dkk., 2010).
3.10.3 Perancangan PCR primer PDGF-B, FGF-2, VEGF-A dan TGF-β1, IL-1, IL-6,
IL-10, TNF α, CRP, Col1α, Osterix, Runx-2, Bsp dan ALP.
Program PCR (Promega Corporation, 2010):
PCR Mix sebanyak 12,5 µl ditambah dengan kedua primer (masingmasing 2,5 µl).
Kemudian DNA dari lokus yang akan diperiksa (vWA). Setelah itu, tambahkan nuclease
free water sehingga volume total sebesar 25µl.

tahap I: - initial denaturation 96ºC selama 2 menit
- subsequent denaturation 94ºC selama 1 menit
- annealing 60ºC selama 1 menit - extension 70ºC selama 1 menit 30
detik
- cycle: 10 cycles
tahap II: - denaturation 90ºC selama 1 menit
- annealing 60ºC selama 1 menit ( Tergantung pada masing-masing
primer )
- extension 70ºC selama 1 menit 30 detik
51
3.10.4 Visualisasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis pada gel
A. Pembuatan Gel Poliacrylamide

1. Masing-masing plat kaca dietsa pada satu sisi kemudian ditandai. Cuci dengan
ethanol 95% dan Kimwipes® sebanyak 2x pada bagian plat kaca yang panjang dan
yang pendek.
2. Aplikasikan 3ml larutan Gel slick® pada bagian plat kaca yang lebih panjang yang
telah dietsa kemudian diratakan pada seluruh permukaan dengan gerakan memutar
menggunakan lap kering.

3. Tunggu 5 menit sampai larutan Gel slick® mengering. Bersihkan kelebihan larutan
Gel Slick® yang masih tersisa dengan lap yang telah diberi distilled water, lalu
keringkan dengan Kimwipes® tissue.

4. Persiapkan larutan fresh binding dengan menambahkan 3µl silane kedalam 1 ml
asam asetat 0,5% didalam 95% ethanol pada tabung 1,5ml. Usap bagian plat kaca
pendek dengan Kimwipes® tissue yang telah disaturasi dengan larutan fresh
binding.
5. Tunggu 5 menit sampai larutan kering. Usap dengan ethanol 95% dan Kimwipes®
tissue 3-4x untuk membersihkan kelebihan larutan.

6. Hindari kontak antara 2 bagian plat kaca yang telah diberi perlakuan dengan
menempatkan spacer 0,4 mm.

7. Siapkan larutan acrylamide 6% dengan mencampurkan : Urea 31,50 gr ditambah
dengan distilled water 36,25 ml + 10x TBE buffer 3,75 ml+ 40 % acrylamide:bis
(19:1) 11,25 ml sehingga hasil akhir volume larutan sebesar 75 ml.

8. Saring larutan acrylamide dengan filter 0,2 micron.
9. Campurkan larutan acrylamide dengan TEMED 50µl dan 10% ammonium
persulfate 500µl.
10. Tuangkan perlahan larutan acrylamide diantara plat kaca, hindari terbentuknya
gelembung udara dengan cara menuangkan perlahan dan konstan pada satu sisi.
11. Berikan cetakan atau comb pada gel diantara plat kaca (yang dipakai berisi 9
cetakan).
52
B. Running gel elektroforesis
1. Pindahkan comb dan spacer yang dipasang pada gel.
2. Tambahkan 0,5x TBE pada ruangan dibagian bawah alat elektroforesis.
3. Masukkan sampel DNA hasil PCR pada bagian cetakan di gel sebesar masing-
masing 10 µl.
4. Masukkan larutan marker sebesar 3 µl pada sumuran yang dikehendaki.
5. Running gel elektroforesis dengan listrik kekuatan 100 volt sampai larutan turun
kebawah seluruhnya.
3.11 PCR Real Time
1. Pengambilan ekstraksi RNA kultur sel dilakukan pada 24, 48 dan 72 jam, dengan cara:
a. Buang medium dari dish
b. Cuci dengan PBS steril
c. Ditambahkan Isogen II (250 µL) sebagai langkah awal ekstraksi RNA
d. Resuspensi untuk melepaskan sel dari dasar plate, kemudian diambil dan
dimasukkan ke microtube.
e. Microtube digoyang dengan shaker selama 15 detik.
f. Ditambahkan ddH2O (100 µL)
g. Microtube digoyang dengan shaker selama 15 detik.
h. Inkubasi 5 menit dalam suhu ruangan
i. Centrifuge 15.000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4°C.
j. Didapatkan dua lapis cairan dalam microtube: lapisan bawah merupakan
Isogen II, lapisan atas berwarna jernih (aquaeous phase) merupakan sel.
k. Ambil bagian lapisan yang jernih (280 µL) dan dipindahkan ke microtube
baru.
l. Ditambahkan isopropanol 230 µL.
m. Microtube digoyang dengan tangan selama 15 detik.
n. Inkubasi 10 menit dalam suhu ruangan.
o. Centrifuge 15.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C
p. Didapatkan pellet dan supernatan, buang supernatantnya.
q. Cuci pellet RNA dengan ethanol 75% 500 µL.
r. Centrifuge 15.000 rpm selama 3 menit dengan suhu 4°C
53
s. Keringkan pellet RNA di suhu ruangan selama 10 menit (tidak boleh terlalu
kering).
t. Ditambahkan RNAse free water 30µL.
u. Simpan dalam suhu -80°C.
2. Mengukur konsentrasi dan kemurnian RNA:
a. Teteskan 1.5 µL RNA pada bagian detektor RNA biodrop machine.
b. Catat kemurnian dan konsentrasi RNA yang terlihat pada monitor.
3. Proses Two Step Reverse Transcriptase PCR Konvensional menggunakan PCR kit
RiverTra Ace (Toyobo, Tokyo, Japan)
a. Membuat template cDNA dari masing-masing sampel:
- Membuat reverse transcription reaction mix dalam microtube berisi: Nuclease-
Free Water 9.75µl, RiverTra 5X Reaction Buffer 4µl, dNTPs 2µl, OligoDT 1µl,
ReverTra Ace 1µl, Recombinat RNasin Ribonuclease Inhibitor 0,25 µl untuk tiap
1 sampel. Pembuatan total master mix didapatkan dengan mengalikan jumlah
sample dengan tiap-tiap reagen.
- Mencampurkan 2µl RNA dan 18µl reverse transcription reaction mix dalam
microtube.
- Anneal dengan suhu 25°C selama 5 menit
- Extend dengan suhu 42°C selama 60 menit
- Inactivate Reverse Transcriptase dengan suhu 90°C selama 5 menit.
4. Running Real-Time Reverse Transcriptase PCR:
cDNA diamplifikasi dalam volume 10 l dengan 0.11 x SYBR Green I (CAMBREX,
Rockland, ME, USA), 0.2 mM/satuan dNTPs, 0.5 M/satuan tiap pasangan primer, dan
0.5unit Dream Taq Hot Start DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA) dalam kondisi sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, dilanjutkan 55 PCR siklus
pada 95°C selama 30 detik, 60°C selama 20 detik, dan 72°C selama 40 detik. Sinyal
fluorescent diukur secara real time, dan kemudian tiap sample dikuantifikasi menurut
petunjuk dari pabrik. Sekuens primer yang digunakan pada studi ini dapat dilihat pada
table 1. Untuk penghitungan normalisasi dari perbedaan tiap sampel total RNA di tiap
reaksi, Ribosomal protein L13a (Rpl13a) digunakan sebagai kontrol endogenous. Unit
arbitrary ditentukan dengan membagi konsentrasi tiap produk PCR dengan konsentrasi
produk PCR dari Rpl13a. Tiap reaksi real-time PCR analysis dibuat dalam triplikasi,
dan diulang setidaknya 3 kali untuk memastikan hasil yang konsisten.
54
3.12 MTT assay
1. Sel Human Gingiva Fibroblast dilakukan splitting dan dicuci dengan larutan PBS dan
diberi tripsin sebanyak 2-2,5 ml dan diinkubasi selama 5 menit

2. Dilakukan resuspensi dengan DMEM untuk menghilangkan tripsin
3. Dilakukan splitting dan dipindahkan dalam mikroplate 96 sumuran dan setiap sumuran
di beri sel sebanyak 5x104 + DMEM 100µl dan diinkubasi sampai sel kondisi 80 %
4. Setelah sel dalam kondisi 80% diberi perlakuan dengan Ekstrak kulit buah manggis
bertingkat ( 200 µg/ml, 400 µg/ml, 600 µg/ml, 800 µg/ml, 1000 µg/ml dan 1200 µg/ml )
+ DMEM 50 µl dan diinkubasi selama 24 jam.

5. Setelah 24 jam diberi reagen MTT pada setiap sumuran sebanyak 25 µl dan diinkubasi
selama 4 jam.
6. Setelah 4 jam medium pada mikroplate dipindahkan ke mikroplate reader yang baru
7. Dibaca dengan menggunakan ELISA reader.
3.13 Wound Healing Assay pada kultur Human Gingival Fibroblast

Sel Human Gingival Fibroblast dengan jumlah 1x105 dikultur pada 6
sumuran. Scratch yang linier dibuat pada sel yang confluent monolayer dengan
menggunakan pipet 200 µl. Debris sel di bilas dengan menggunakan medium
DMEM. Gap scratch diobservasi menggunakan kamera mikroskop cahaya dengan
berbagai macam perbedaan waktu.
3.14 Analisis Data
Data yang diperoleh dilakukan pengamatan langsung hasil band hasil RT-PCR ,
ekspresi protein imunositokimia antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.
3.15 Luaran per tahun

Hasil penelitian ini akan ditulis jurnal dan di masukkan ke dalam jurnal international
scopus dengan minimal grade Q3 sebanyak 2 jurnal. Dan setelah hasil ini dicapai maka
peneliti akan membuat gel ekstrak kulit manggis yang akan dipatenkan ke HAKI.
3.16. Indikator Capaian

Indikator capian dapat tercapai setelah 2 jurnal dapat diterima pada jurnal international
scopus minimal grade Q3.
55
56
BAB 4
ROAD MAP PENELITIAN
MC3T3-E1 Osteogenesis
TNFα OSTERIX
CRP Runx2
Xanthone Inflamasi IL-1 ALP
IL-6 BSP
IL- 10 Coll1α1
Mangosteen
Pericarp
LPS
Keterangan :
: menginduksi
: menghambat
: Kandungan / penanda
57
BAB 5
HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI
5.1 Pembuatan ekstrak kulit manggis
Pembuatan ekstrak kulit manggis dilakukan di UPT Laboratorium Herbal Materia Medica
Batu dengan metode maserasi dengan pelarut DMSO 0,1%. Pembuatan ekstrak kulit
manggis ini bertujuan untuk kelompok perlakuan pada sel fibroblast dan sel osteoblast.
5.2 Hasil MTT assay
5.3 Hasil wound healing assay fibroblast
Wound healing assay dilakukan pada sel fibroblast yang telah diberi Ekstrak kulit manggis
dibandingkan kelompok control selama 24 dan 48 jam. Pada pengamatan sel fibroblast
yang telah diberi ekstrak kulit manggis selama 24 dan 48 jam didapatkan perbedaan
58
dimana sel fibroblast yang dilakukan perlakuan didapatkan migrasi sel secara individu ke
tengah. Hal ini disebut sebagai single cell migration. Berbeda hasil pada sel fibroblast yang
tidak diberi perlakuan selama 24 dan 48 jam didapatkan sel yang bergerak Bersama sama
yang sering dinamakan collective cell migration.
Gambar 5.3.1 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 0 jam
dengan diberi ekstrak kulit manggis
59
dengan diberi ekstrak kulit manggis
Gambar 5.3.4 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 48 jam tanpa
diberi ekstrak kulit manggis
5.4 Hasil PCR fibroblast without wound healing

5.5
60
Gambar 5.4.1
A. Hasil pembacaan TGFβ-1 pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24 jam, (b)
perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48 jam.
B. Ekspresi GAPDH (a) kontrol 24 jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48
jam.
Gambar 5.4.2
A. Hasil pembacaan PDGF-B pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24 jam, (b)
jam.
Gambar 5.4.3
A. Hasil pembacaan FGF-2 pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24 jam, (b)
61
jam.
Gambar 5.4.4
A. Hasil pembacaan VEGF-A pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24 jam, (b)
jam.
Gambar 5.4.5 Diagram perbandingan kelompok TGFβ-1 kontrol dan perlakuan 24 dan 48 jam
menggunakan Image J
62
Gambar 5.4.6 Diagram perbandingan kelompok PDGF-B kontrol dan perlakuan 24 dan 48
jam menggunakan Image J
Gambar 5.4.7 Diagram perbandingan

kelompok FGF-2 kontrol dan perlakuan 24 dan 48 jam menggunakan Image J
Gambar 5.4.8 Diagram perbandingan

kelompok VEGF-A kontrol dan perlakuan 24 dan 48 jam menggunakan Image J
63
Ekstrak kulit manggis memiliki xanthone dan flavonoid yang merupakan antioksidan dalam kulit
manggis. Antioksidan dapat menetralisir radikal bebas dengan cara menyumbangkan elektronnya
pada radikal bebas yang berperan menurunkan ROS sehingga stimulasi makrofag tidak terhambat.
Makrofag akan mensekresi growth factor seperti FGF, PDGF, TGFβ, dan VEGF yang dapat
menarik lebih banyak fibroblas ke daerah luka dan mensintesis kolagen serta meningkatkan
proliferasi pembuluh darah kapiler.
Hal ini dapat menjelaskan peningkatan TGF-β1 pada kelompok perlakuan. Namun
perbedaan pendaran band TGF-β1 pada kelompok perlakuan 24 jam tidak signifikan bila
dibandingkan dengan kelompok 48 jam. Hal tersebut dikarenakan fase inflamasi dimulai pada hari
ke-2. Pada fase inflamasi, sel melepaskan faktor pertumbuhan seperti platelet derived growth
factor (PDGF) dan transforming growth factor ß (TGF ß), granulocyte colony stimulating factor
(G-CSF), C5a, TNFα, IL-1 dan IL-8.
Xanthone dapat dihubungkan dengan peningkatan ekspresi kelompok perlakuan VEGF-A

karena xanthone dapat berikatan dengan suatu unsur radical superoxide (O2- ) dan kemudian akan
melepaskan suatu unsur free Nitric Oxide (NO). Dalam jumlah kecil, NO dapat meningkatkan
ekspresi VEGF melalui jalur PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)-Akt yang mentransduksi sinyal
intraseluler sehingga gen HIF-1α akan teraktivasi. Dimana Hipoksia-inducible factor (HIF-1)
merupakan regulator transkripsi kunci untuk beberapa faktor angiogenik. Kemudian sinyal tersebut
akan mempengaruhi nukleus yang didalamnya terdapat gen VEGF. Nukleus akan
mengekspresikan VEGF didalam sel dan dikeluarkan dari dalam sel berbentuk suatu protein VEGF
yang nantinya mempengaruhi peningkatan angiogenesis dan diharapkan akan mempengaruhi
percepatan penyembuhan luka. Peningkatan ekspresi VEGF pada hasil PCR menunjukkan adanya
kemungkinan bahwa jumlah NO pada penelitian ini kecil, dan dihubungkan dengan kadar ekstrak
kulit manggis yang optimal yakni 800 µg/ml. Sebaliknya, jika kadar ekstrak kulit manggis lebih
dari 800 µg/ml dan jumlah NO besar maka ekspresi VEGF dapat menurun. Penelitian ini melihat
kondisi sel secara normal yang tidak mengalami inflamasi serta diharapkan mampu menunjukkan
peningkatan ekspresi VEGF setelah pemberian ekstrak kulit manggis. Salah satu faktor dalam
penyembuhan luka yaitu VEGF ini memang lebih poten pada aktivitas mitogen yang terbatas pada
sel endotel vaskular. Peningkatan ekspresi VEGF pada kelompok perlakuan 24 jam dan 48 jam
sudah menunjukkan bahwa aplikasi ekstrak kulit manggis menghasilkan aktivitas proliferasi
fibroblas yang lebih baik.
Penurunan PDGF-B pada kelompok perlakuan dapat dijelaskan oleh kandungan ekstrak kulit
manggis yaitu flavonoid yang diketahui menghambat reseptor PDGFR-β yang merupakan reseptor
dari PDGF-B. Flavonoid memutuskan ikatan PDGFR- β pada transduksi sinyal tingkat molekul
64
yaitu Ras GAP, SHP-2 (Phosphotyrosine Phosphatase), PI3K (Phophatidylinositol 3-Kinase), PLCγ
(Phospholipase Cγ1). Flavonoid juga menghambat aktivasi Erk dan induksi gen awal serta
proliferasi dan migrasi. Penurunan kelompok kontrol PDGF-B 48 jam disebabkan PDGF muncul
pada awal fase penyembuhan luka yaitu fase hemostasis, kemudian akan mengalami penurunan dan
muncul kembali pada fase inflamasi kronis 72 jam kemudian.
Pada FGF-2, flavonoid dapat meningkatkan pelepasan Nitric Oxide (NO) dari Vascular
Smooth Muscle Cell (VSMC) sehingga terjadi peningkatan FGF-2. Didapatkan hasil bahwa
tingginya kadar NO yang dilepaskan oleh VSMC mengakibatkan pelepasan FGF-2 sehingga
merangsang proliferasi sel endotel. NO yang dilepaskan dari VSMC menjadi sinyal penting pada
interaksi seluler antara sel endotel dan VSMC. Sinyal interaksi seluer ini melibatkan transkripsi
Early growth response-1 (Egr-1) melalui mekanisme Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK).
Aktivasi dari jalur MAPK akan mengaktifkan Endotelin-3 (ET-3) lalu ditranskripsi oleh EGR-1,
transkripsi ini mempengaruhi nucleus yang didalamnya terdapat FGF-2. Kemudian nucleus
mengekspresikan FGF- 2 didalam sel yang nantinya mempengaruhi peningkatan ekspresi FGF-2.
Kandungan lain dari ektrak kulit manggis adalah saponin yang dapat meningkatkan
proliferasi monosit sehingga dapat meningkatkan jumlah makrofag yang menstimulasi sekresi
growh factor. Saponin akan mengaktifkan fungsi dari TGFβ-1. TGFβ-1 memiliki beberapa fungsi
seperti sintesis matriks ekstraseluler, migrasi sel, diferensiasei sel, dan sebagai imunosupresor.12
Ada beberapa mekanisme aktivasi TGFβ oleh saponin; (1) saponin menstimulasi sintesis,
sekresi, dan aktivasi TGFβ-1 pada sel fibroblas, (2) saponin mengubah ekspresi reseptor TGFβ, (3)
saponin memodifikasi sistem transduksi sinya pada post-reseptor TGFβ. Perubahan ekspresi
reseptor TGFβ adalah sebuah hal penting karena dalam percepatan sintesis fibronectin dari
fibroblas disebabkan oleh saponin.
65
5.6 Hasil PCR fibroblast dengan wound healing assay
Gambar 5.5.1. Visualisasi hasil PCR.
1, 2: kontrol 24 jam ; 3, 4: perlakuan 24 jam ; 5, 6: kontrol 48 jam ; 7,8: perlakuan 48 jam ; M:

marker
Gambar 5.5.2 Grafik ekspresi PDGF-B dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software ImageJ
Gambar 5.5.3 Grafik ekspresi TGF-1 dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software Image
J
66
Gambar 5.5.4 Grafik ekspresi FGF-2 dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software ImageJ
Gambar 5.5.5 Grafik ekspresi VEGF dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software ImageJ
Kandungan ekstrak kulit manggis yang berpengaruh dalam peningkatan ekspresi growth factor
adalah xanthone, flavonoid, tanin, saponin. Xanthone dan flavonoid berfungsi sebagai anti-
inflamasi dengan cara menghambat kerja enzim siklooksigenase dengan lebih cepat dan ditandai
dengan proliferasi sel fibroblas yang meningkat. Proliferasi fibroblast yang meningkat ini
menunjukkan adanya keterlibatan dari reseptor PDGF-B yaitu PDGFR-β. PDGFR-β memiliki
peran penting pada proliferasi, transformasi, dan sekresi kolagen dari fibroblas. Pada beberapa
penelitian tentang perbaikan vaskular dan angiogenesis, ditemukan bahwa PDGFR-β berfungsi
67
melalui jalur pensinyalan PI3K/Akt, yang aktivasinya diketahui ikut terlibat pada regulasi dari
proliferasi, migrasi, diferensiasi dan angiogeneis pada sel. PDGF-B menginduksi tirosin fosforilase
dari PDGFR-β dan meningkatkan produksi inositol trifosfat, kemudian PDGFR-β merekrut PI3K,
fosfolipase Cg1, Src family kinase, dan fosfotirosin fosfatase SHP-2. PI3K kemudian mengaktifkan
Akt yang berfungsi sebagai regulator multifungsi pada pertumbuhan dan ketahanan sel serta
menstimulasi proliferasi, migrasi dan angiogenesis.
Kandungan ekstrak kulit manggis xanthone juga diketahui dapat meningkatkan proses
angiogenesis melalui ekspresi VEGF. Antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak kulit manggis
atau di dalam xanthone dapat berikatan dengan suatu unsur radical superoxide (O2-) dan kemudian
akan melepaskan suatu unsur free Nitric Oxide (NO). NO dapat meningkatkan ekspresi VEGF
melalui jalur PI3K (Phosphoinositide 3-kinase)-Akt yang mentransduksi sinyal intraseluler
sehingga gen HIF-1a akan teraktivasi. Dimana Hipoksia-inducible factor (HIF-1) merupakan
regulator transkripsi kunci untuk beberapa faktor angiogenik. Kemudian sinyal tersebut akan
mempengaruhi nukleus yang didalamnya terdapat gen VEGF. Nukleus akan mengekspresikan
VEGF di dalam sel dan dikeluarkan dari dalam sel berebentuk suatu protein VEGF yang nantinya
mempengaruhi peningkatan angiogenesis dan diharapkan akan mempengaruhi percepatan
penyembuhan luka.
Flavonoid dalam kandungan ekstrak kulit manggis dapat mempengaruhi ekspresi FGF-2 yang
lebih tinggi pada kelompok perlakuan 24 jam. Hal ini berhubungan dengan adanya peningkatan
kadar Nitric Oxide (NO) yang dipengaruhi oleh adanya flavonoid. Mekanisme ini diawali dengan
proses direct signaling FGF-2, yaitu transfer molekul dari satu sel ke sel lainnya melalui membran
sel. Terikatnya FGF-2 ekstraselular terhadap reseptornya yaitu FGFR-2 yang ada pada permukaan
membran sel fibroblas, dengan heparan sulfat proteoglikan (HSPG) sebagai kofaktor, akan
membentuk formasi kompleks berupa FGF-FGFR-HSPG. Kompleks ini kemudian mengaktifkan
domain tirosin kinase FGFR-2 intraselular melalui fosforilasi dari residu tirosin. Reseptor yang
telah aktif akan memberi sinyal melalui jalur Ras-MAPK (mitogen-activated protein kinase).
Aktivasi dari reseptor tersebut menginduksi peningkatan konsentrasi sitosolik dari Ca 2+ melalui
produksi inositol-1,4,5-trifosfat oleh fosfolifase Cγ dan Ca 2+ yang dikeluarkan dari retikulum
endoplasma yang diperantarai oleh aktivasi kanal Ca 2+. Peningkatan Ca2+ akan membentuk
kompleks Ca2+-kalmodulin (Ca2+/CaM) yang akan mengakibatkan aktivasi eNOS, yaitu enzim yang
akan menyintesis NO. Kemudian NO yang telah disintesis akan mengaktifkan sitosolik guanilil
silase yang akan menginduksi cGMP. cGMP kemudian mengaktivasi protein kinase G (PKG) yang
akan RAF kinase. RAF kinase akan berfosforilasi, lalu mengaktifkan MEK yang akan
berfosforilasi juga dan mengaktifkan MAPK. MAPK akan mengaktifkan Etv4 dan Etv5 yang
merupakan anggota dari famili faktor transkripsi DNA, yang akan berpengaruh pada proses
transkripsi dari ekspresi FGF-2 di dalam nukleus.
68
Tanin dan Saponin dalam ekstrak kulit manggis berpengaruh pada peningkatan ekspresi dari
TGF-β1. Kandungan tanin dalam ekstrak kulit manggis dapat merangsang TGF-β untuk stimulasi
proliferasi fibroblas. Tannin merupakan antioksidan yang memiliki ikatan dengan protein dan
polisakarida yang mampu membentuk kompleks kuat sehingga dapat meningkatkan ekspresi dari
TGF-β1. Kandungan saponin dalam kulit manggis akan mengaktifkan fungsi dari TGF-β. Saponin
mengaktifkan reseptor TGF-β yaitu TGF-βR1 untuk menstimulasi peningkatan dari TGF-β1 pada
reseptor fibroblas. Peningkatan TGF-β1 dapat menstimulasi migrasi sel ke arah perlukaan dan
meningkatkan proliferasi fibroblas.22 Mekanisme saponin mengaktivasi TGF-β yaitu saponin
menstimulasi sintesis, sekresi, dan aktivasi pada sel fibroblas, lalu saponin mengubah ekspresi
reseptor TGF-β, dan saponin memodifikasi transduksi sinyal pada post-reseptor TGF-β.
Pada penelitian ini, ekspresi PDGF-B dan FGF-2 pada kelompok sampel 48 jam, baik
kontrol maupun perlakuan mengalami penurunan dibanding kelompok sampel 24 jam. Hal
ini kemungkinan berhubungan dengan selesainya proliferasi dari kultur sel HGF pada penelitian in
vitro ini. Sel fibroblas berhenti tumbuh setelah membentuk selapis tunggal yang rata (confluent
monolayer) di bagian dasar media kultur karena adanya contact inhibition. Sel akan menghentikan
proliferasinya pada saat sel tersebut sudah berkontak dengan sel lainnya. PDGF-B yang berperan
pada proses wound healing meningkat pada fase awal penyembuhan luka, kemudian akan
mengalami penurunan apabila proses neovaskularisasi telah selesai serta perfusi di area luka telah
kembali normal. Selain itu, hal yang kemungkinan berperan terhadap rendahnya ekspresi FGF-2
pada waktu 48 jam adalah efek dari konsentrasi 800 μg/ml ekstrak kulit manggis yang pengaruhnya
bersifat sementara. Jika ekpresi FGF-2 terjadi terus menerus maka akan terjadi overekspresi yang
pada akhirnya bisa mengakibatkan tumbuhnya berbagai macam sel kanker seperti kanker prostat,
melanoma, dan karsinoma hepatoselular.
5.7 Kultur Sel Osteoblast
69
Gambar 5.6.1 Kultur sel Osteoblast
5.8 Submit jurnal ke Q3 Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e clinica Integrada
70
5.9 Rencana tahap berikutnya
1. Ekstraksi RNA
Sel Osteoblast dilakukan kultur sampai dengan 80% confluent dan di beri LPS
( Lipopolysaccharides ) kemudian diberi treatment ekstrak kulit manggis selama 24.
Setelah 24 jam dilakukan ekstraksi RNA dengan menggunakan kit Purelik RNA Mini kit.
Proses ekstraksi RNA dilakukan sesuai dengan data sheet dari perusahaan. Dan untuk
menghitung kemurniaan dari RNA dilakukan pengecekan dengan nano drop. Dikatakan
RNA murni apabila nilai A260/A230 pada nano drop menunjukkan angka ratio 2,1. Dan
apabila angka menunjukkan lebih tinggi dari 1,8 masih dapat diterima. Apabila angka
<1,8 maka RNA berpotensi untuk tercampur DNA atau protein.
2. Pembuatan cDNA
71
Setelah didapatkan RNA murni ( single stranded ) maka perlu dilakukan pembuatan
komplemen DNA atau cDNA. cDNA merupakan DNA untai tunggal sintetik atau buatan
yang disalin dari untaian mRNA menggunakan tehnik PCR dengan memanfaatkan enzim
reverse transcriptase. Pada pembuatan cDNA ini menggunakan iScript cDNA Synhtesis kit.
3. Melakukan real time PCR
Setelah didapatkan cDNA maka dilakukan real time PCR dengan menggunakan reagen
SsoFast EvaGreen Supermix. Adapun primer yang diperiksa adalah TNF, CRP, IL-1, IL-
6, IL-10, OSterix, Runx2, ALP, BSP, Coll11.
4. Pengumpulan data dan statistik data
Dari hasil pemeriksaan real time PCR tersebut selanjutnya dilakukan pengumpulan data dan
analisis statistik
5. Pembahasan
Dari pengumpulan data dan hasil analisis statistik akan dilakukan pembahasan dan
kesimpulan penelitian
6. Penyusunan draft artikel ilmiah
Draf artikel ilmiah akan disubmit pada jurnal internasional Q3.
5.10 Kendala yang dihadapi
1. Pemesanan alat dan bahan untuk real time yang membutuhkan waktu 3 bulan
2. Ketersediaan kamera mikroskop yang tidak tersedia di Riset senter di FKG Unair
5.11 Solusi penyelesaian
1. Menunggu 3 bulan untuk melakukan penelitian

2. Mencari tempat ketersediaan kamera mikroskop di tempat lain
5.10. Perkiraan riset dapat diselesaikan
1. April 2019
5.11. Rincian biaya yang dikeluarkan
72
1. Alat dan bahan 19 juta dengan rincian kuitansi terlampir
DAFTAR PUSTAKA
Arabski M, Weglerek-Cluk A, Czerwonka G, Lankoff A, Kaca W. 2012. Effects of

Saponins Againts Clinical E. coli Strains and Eukayotic Cell Line. J. of Biomedicine
and Biotechnology. pp: 1-7.
Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko MS, Brem H, Tomic-Canic M. 2008. Growth
Factors and Cytokines in Wound Healing. Wound Rep Reg. 16: 585-601.
73
Butler M. 2005. Animal Cell Culture and Technology. 2nd ed. London and New York. BIOS
Scientific Publisher.
Carson SN. 2005. Basics of Wound Healing and Treatment. Available from:
http://www.Baybutt.net/pubs/wound. Accessed at: 30th Desember 2011.
Chaovanalikit A, Mingmuang A, Kitbunluewit T, Choldumrongkool N, Sondee J,
Chupratum S. 2012. Anthosyanin and Total Phenolics Content of Mangosteen and
Effect of Processing on the Quality of Mangosteen Products. Int Food Rsch J. Vol 19
(3). pp: 1047-1053.
Chaverri JP, Rodriguez NM, Ibarra MO, Rojas JMP. 2008. Medicinal Properties of
Mangosteen. J. Food and Chemical Toxicology. (46): 3227-3239.
Diegelmann RF, Evans MC. 2004. Wound Healig: An Overview of Acute Fibrotic, and
Delayed Healing. Frontiers in Bioscience. 9:283-289
Freshney RI. 2010. Culture animal cells : a manual of basic technique and
specialized applications 6th. New Jersey : John Wiley & Sons, Inc. Pp 1-8,
111-114, 187-206, 365-377.
Gao Y, Li D, Han T, Sun Y, Zhang J. 2009. TGF-ß1 and TGFBR1 are Expressed in
Ameloblast and Promote MMP20 Expression. Weifang, Shandong, China. Wiley-
Liss, Inc. Pp: 886.
Guo F, Carter DE, Mukhopadhyay A, Leask A. 2011. Gingival fibroblasts display reduced
adhesion and spreading on extracellular matrix: a possible basis for scarless tissue
repair. USA. PloS ONE.
Hayyu NS. 2013. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Garcinia mangostana Linn terhadap Sel
Fibroblas Gingiva Manusia. Surabaya. Fakultas Kedokteran Gigi Universitas
Airlangga
Hoffman D. 2003. Medical Herbalism: The Science and Practice of Herbal Medicine.
Rochester, Vermont. Healing Art Press. p: 116.
Harazy VI., Zambon JJ., Trevisan M., Zeid M., Genco RJ. 2000. Identification of
Periodontal Pathogens in Atheromathous Plaques. J. Periodontal. 71:1554-60.
Hunt KT. 2003. Wound Healing: Current Surgical Diagnosis and Treatment. 12th Ed.,
McGraw-Hills, USA. In: Doherty MG. p75-87
Ibelgaufts H. 2002. Wound Healing. Cytokins and Cells Online Pathfinder Encyclopedia.
www.cope.cgi.htm. Accessed on 16 April 2014.
Innis MA, Gelfand DH. 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and Applications.
California. Academic Press.
Naqvi AR, Fordham JB, Khan A, Nares S. 2015. microRNAs responsive t o A . a c tin o m
y c e m c o mit a n s a n d P.gingivalis LPS modulate expression of genes regulating
innate immunity in human macrophages. HHS Public Access. I n n a t e I m m u n .
Author manuscript : 540-551. 21
74
Kent LW, Rahemtulla F, Hockett Jr. RD, Gilleland RC, Michalek SM. 1998. Effect of
Lipopolysaccharide and Inflammatory Cytokines on Interleukin-6 Production by
Healty Human Gingival Fibroblast. U.S. America. American Society for
Microbiology. 66(2) p: 608-614.
Liska-yunitasari. 2011. Gempur 41 Penyakit dengan Buah Manggis : Khasiat dan Cara
Pengolahannya untuk Pengobatan. Yogyakarta: Pustaka Baru Press. Hal 24-34.
Mann A, Breuhahn K, Schirmacher P, Blessing M. 2001. Keratinocyte-Drived

Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Accelerates Wound Healing:
Stimulation of Keratinocyte Proliferation, Granulation Tissue Formation, and
Vascularization. J. Invest Dermatol. 117:1382-1390.
Massague, J. 1998. Tgf-beta signal transduction [Review]. Annual Review of
Biochemistry, 67: 753-791.
Miryanti, YIPA, Sapei L, Budiono K, Indra S. 2011. Ekstraksi Antioksidan dari Kulit Buah
Manggis. Karya Tulis Ilmiah. Universitas Katolik Parahyangan Bandung. Hal: 11.
Putra ATW, Ade W, Hamidy MY. 2010. Tingkat Kepadatan Fibroblas pada Luka Sayat
Mencit dengan Pemberian Gel Lidah Buaya (Aloe chinensis Baker). Hal: 1-8.
Ryan John. 2008. Introduction to Animal Cell Culture. Technical bulletin. Available from :
www.corning.com/lifesciences. Acces :24 Maret 2012.
Sakagami H, Kushida T, Makino T, Hatano T, Shirataki Y, Matsua T, Matsuo Y, Mimaki Y.
2012. Functional Analysis of Natural Polyphenols and Saponins as Alternative
Medicines. Availabe at www.Intechopen.com. Accessed at 6 April 2014.
Shibata MA, Matoba Y, Tosa H, Iinuma M. 2013. Effects of Mangosteen Pericarp Extract
Againts Mammary Canceri. Altern Integ Med. Vol. 2. pp: 139.
Tjahjaningtyas. 2011. Manggis Ratu Buah Kaya Manfaat: Khasiat Dahsyat dan Tips
Mengkonsumsinya. Surabaya. Stomata. Hal 23-88.
Tukiran, Suyanto, Hidayanti N. 2015. Uji Awal Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis
(Garcinia mangostana L.). Surabaya. Universitas Negeri Surabaya. C-82.
Werner S. Dan Grose R. 2003. Regulation of wound healing by growth factor and
cytokines. London. Physiol Rev 83, p: 835-70.
Kazuhisa Nakashima,2 Xin Zhou,2 Gary Kunkel,3 Zhaoping Zhang, Jian Min Deng,
Richard R. Behringer, and Benoit de Crombrugghe1. The Novel Zinc Finger-
Containing Transcription Factor Osterix Is Required for Osteoblast Differentiation
and Bone Formation. Cell, Vol. 108, 17–29, January 11, 2002.
Yatman E. 2012. Kulit Buah Manggis Mengandung Xanton yang Berkhasiat Tinggi.
Jakarta. Univesitas Borobudur. No. 324. Hal: 2-3.
Ying Cao1, Shu-Fang Jia1, Geetika Chakravarty2, Benoit de Crombrugghe3, and Eugenie
S. Kleinerman1 . 2008. The Osterix Transcription Factor Down-Regulates
75
Interleukin-1α Expression in Mouse Osteosarcoma Cells. Mol Cancer Res. 2008
January ; 6(1): 119–126. doi:10.1158/1541-7786
Bruderer M, et al. Role and Regulation of RunX2 in Osteogenesis. European Cells and
Materials Vol.282014 (pages 269 - 286) DOI :10.22203/eCM.v028a19) 2014
Kirkham GR and Cartmell SH. Genes and Proteins Involved in the Regulation of
Osteogenesis. Topics in Tissue Engineering, Vol. 3, 2007. Eds. N Ashammakhi, R
Reis & E Chiellini.
Gastelbondo B. Gene expression of collagen type I alpha 2 and its relationship with dental
fluorosis. Journal Oral and Craniofacial Sciences. 2018; 7(6):172-175.
doi:10.17126/joral res.2018.056
Soong R et al (2001) Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Detection of Cytokeratin 20 in Noncolorectal Lymph Nodes. Clinical Cancer
Research, 7: 3423–3429.
Hoongbao M et al, Application of Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The

Journal of American Science, 2(3), 2006, Ma, et al., Real-time Polymerase Chain
Reaction. P 1-14
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring

of DNA amplification reactions. Biotechnology (NY). 1993;11(9):1026-30.
Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Panduan
Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini, Penerbit Andi,
Yogyakarta
76

Laporan Kemajuan Penelitian Corected 21 Okt ARA 2019

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Laporan Kemajuan Penelitian Corected 21 Okt ARA 2019

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

LAPORAN KEMAJUAN

RISET KOLABORASI MITRA LUAR NEGERI

PRESERVASI RESIDUAL RIDGE TULANG

Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM / NIDN 0023098101

Judul Penelitian: : Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui

Lama Penelitian Keseluruhan : 1 Tahun

Mengetahui, Surabaya, 21 Oktober 2019

Menyetujui Wakil Rektor 3

Prof. Ir Moch. Amin Alamsjah, M.Si., Ph.D

Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan

Kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat

Kulit buah manggis mengandung Xanthone yang mempunyai efek

Tujuan jangka panjang peneliti adalah menghasilkan suatu produk Gel

1.1 Latar Belakang

Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan

Diperlukan metoda untuk menghambat proses resorpsi tulang alveolaris

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan Penelitian

1.4 Manfaat Penelitian

1.5 Rencana Target Capaian Tahunan

2.1 Penyembuhan Luka

2.2 Penyembuhan Luka Pasca Ekstraksi Gigi

Tahapan-tahapan angiogenesis dapat dijelaskan sebagai berikut:

2.4 Vascular Endothelial Growth Factor - A (VEGF-A)

2.5 Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2)

2.7 Platelet-derived growth factor - B ( PDGF-B )

2.8 Transforming Growth Faktor – beta1 ( TGF-β1 )

2.9 Protein penanda / marker pada proses inflamasi

Jalur pro inflammatory signaling dipengaruhi oleh zinc. Mirip dengan

2.9.1 Interleukin-1 (IL-1)

Merupakan mediator inflamasi yang berikatan dengan IL-8 yang berperan

2.9.2 Interleukin-6 (IL-6)

Merupakan mediator inflamasi yang berkembang pada hiperinsulinemia yang

2.9.3 Interleukin-10 (IL-10)

Merupakan mediator inflamasi yang diproduksi oleh sel T-helper , limfosit, B-

2.9.4 Tumor necrosis factor- alpha (TNF-α)

Merupakan mediator inflamasi yang memiliki autokrin, parakrin, dan akssi

2.10 Penanda / marker proses osteogenesis

Metabolisme tulang juga dipengaruhi oleh beberapa protein dan faktor

Osteoblas dan osteoklas terdapat pada permukaan tulang kompak dan

Pada remodelling tulang dimulai oleh perubahan muatan mekanis yang

Pada proses sel progenitor (MSC) berpotensi proliferasi dan diferensiasi

2.10.1 Bone Sialoprotein (BSP)

Osteoblas yang telah dewasa/matang secara metabolik aktif merupakan

2.10.2 Alkali Phosphatase (ALP)

1. Obat-obatan seperti glukokortikoid dan antikonvulsan.

3. Penyakit-penyakit seperti gangguan hepatobilier, hyperadrenocorticism,

2.10.3 Run-related transcription factor 2 (RUNX2)

Protein runx2 pertama kali terdeteksi pada preosteoblas, dan ekspresi

2.10.4 Collagen 1 Alpha 1 (Coll11)

Gen Coll11 memberikan instruksi untuk membuat bagian dari molekul

2.10.5 OSTERIX (OSX)

2.11 Kulit Buah Manggis

2.12 Methyl-Thiazol-Tetrazolium atau MTT Assay

2.14 Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.15 Real-Time PCR

2.16. Osteoblastic cell line MC3T3-E1

2.17 Lipopolisakarida (LPS)

Lipopolisakarida merupakan memberan luar bakteri gram negative, yang

Gambar 5. Komponen Membran luar gram negative (LPS) (Naqvi, 2015).

Metabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian merupakan penelitian experimental laboratories.

3.2 Rancangan Penelitian