BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kehilangan gigi tetap pasca pencabutan gigi tanpa penggantian gigi yang
hilang dapat mengakibatkan gangguan fungsi pengunyahan, estetik dan fonetik..
Penggantian gigi yang hilang dapat dilakukan dengan aplikasi gigi tiruan baik
sebagian maupun lengkap, gigi tiruan cekat ( crown dan bridge ) dan dental
implant. Seiring dengan kebutuhan dan keinginan penderita serta perkembangan
tehnologi dalam bidang kedokteran gigi, implant gigi merupakan alternatif
terbaik. Prosesus alveolaris sangat menunjang dalam pemasangan dental implant.
Pada keadaan yang normal pasca pencabutan gigi terjadi resorbsi tulang alveolaris
dalam arah horizontal dan vertical sehingga mempersulit pemasangan dental
implant.

Diperlukan metoda untuk menghambat proses resorpsi tulang alveolaris

sehingga dimensi soket gigi dapat dipertahankan sampai pada saat pemasangan
implant, disebut dengan prosedur socket preservation. Prosedur socket
preservation dilakukan dengan menempatkan bahan yang dapat mempercepat
proses penyembuhan soket pasca pencabutan gigi sehingga diharapkan dapat
menghambat proses resorpsi tulang alveolaris.

Saat ini banyak penelitian yang telah dilakukan mengenai preservasi soket
dan penyembuhan luka yang memanfaatkan bahan alam. Diantaranya digunakan
obat tradisional sebagai antiinflamasi. Hal ini dikarenakan kepercayaan
masyarakat terhadap kelebihan dari obat tradisional dibandingkan dengan obat
modern yaitu efek samping obat tradisional relatif kecil jika digunakan secara
tepat (Katno, 2007).
Bahan dari alam yang dapat dimanfaatkan untuk penyembuhan tulang
adalah kulit dari buah manggis (Garcinia mangostana) (Chaovanalikit, 2012). Di
dalam kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat merangsang
proliferasi fibroblas. Derivat dari senyawa fenol yaitu antosianin, flavonoid dan
tanin memiliki sifat antioksidan dan antimikroba (Sakagami, 2012). Derivat dari
1
xanthone yaitu α-mangostin memiliki aktivitas sebagai antijamur, antioksidan,
antiviral, antibakteri, serta anti inflamasi (Chaverri, 2008).
Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah
manggis melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah
fibroblast dan proses angiogesis. Angiogenesis merupakan pembentukan
pembuluh darah baru yang terjadi secara alami didalam tubuh baik dalam
kondisi sehat maupun patologi. Pada keadaan terjadi kerusakan jaringan
proses angiogenesis berperan dalam mempertahankan kelangsungan fungsi
berbagai jaringan dan organ yang terkena luka. Hal ini terjadi melalui
terbentuknya pembuluh darah baru yang menggantikan pembuluh darah yang
rusak ( Frisca et al. 2009 )
Ada berbagai macam growth factor pada ostegenesis yakni Osx ( Osterix ),
RUNX-2 ( Runt Related Transcription Factor -2 ) dan ALP Alkali Phosphatase)
yang dapat mempengaruhi proses osteogenesis pada proses penyembuhan
tulang. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh
ekstrak kulit buah manggis terhadap ekspresi Osterix, Runx-2 dan ALP ditingkat
DNA dan Protein kultur sel human gingiva fibroblast sebagai strategi potensial
mempercepat penyembuhan tulang. Dari penelitian ini dapat dilanjutkan dengan
membuat gel ekstrak kulit buah manggis yang diaplikasikan kepada soket pasca
pencabutan gigi untuk mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi infeksi
Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah manggis
melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah Osteoblast
dan proses Osteogenesis. Osteogenesis merupakan proses perkembangan yang
melibatkan pembentukan fibrocartilago dan aktivitas osteogenik dari sel tulang
utama ( Solomon et al, 2010 ). Proses osteogenesis terdiri dari 5 fase, yaitu fase
hematoma, fase inlamasi dan proliferasi seluler, pembentukan callus,
konsolidasi,remodeling(Shapiro,2008) .
Ada berbagai macam marker osteogenesis yaitu Osterix, ALP, RUNX2,
COL1α, dan BSP yang dapat mempengaruhi proses osteogenesis pada proses
penyembuhan tulang. Dan selain itu ada berbagai macam marker inflamasi yaitu
IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP yang berperan dalam proses inflamasi.

2
 Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh
ekstrak kulit buah manggis terhadap ekspresi Osterix, serta marker TNF α pada
media Osteoblastic Cell Line MC3T3-E1 sebagai strategi potensial untuk
menghambat resorpsi tulang pada proses inflamasi post ekstraksi gigi. Dari
penelitian ini dapat dilanjutkan dengan membuat gel ekstrak kulit buah manggis
yang diaplikasikan kepada soket pasca pencabutan gigi untuk mempercepat
penyembuhan luka, dan menghambat proses resorpsi tulang.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah aplikasi ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi
Osterix serta menurunkan marker inflamasi TNF α, yang dievaluasi dengan
realtime PCR dengan media Osteoblastic cell line MC3T3-E1?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Mengetahui dosis optimal ekstrak kulit buah manggis pada Osteoblastic
cell line MC3T3-E1
b. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan
Ekspresi gen Osterix pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1
c. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat menurunkan TNFα
pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah :
.
1. Sebagai model penyembuhan luka untuk memperbaiki atau
mempercepat proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi melalui
proses jalur pencegahan keradangan dan aktivasi proses osteogenesis.
2. Meningkatkan efektifitas pendayagunaan ekstrak kulit buah manggis
sebagai bio-produk yang baik sebagai bahan alternatif untuk
mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi terjadinya resorpsi
tulang alveolar pasca pencabutan gigi.

3
 BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Tulang adalah suatu jaringan ikat vaskular terdiri atas sel-sel dan zat antar sel yang
mengalami kalsifikasi, seperti tulang padat (tulang kompakta) dan seperti spons (tulang
spongiosa). Tulang juga mempunyai banyak fungsi sebagai penyokong, pelindung,
penyimpan mineral pada ujung-ujung persendian dimana tulang rawan sebagai pelapis yang
khusus untuk mempermudah pergerakan (Gartner dan Hiatt, 2012).

Komponen selular dari tulang terdiri dari osteogenic precursor cell, osteoblas,
osteoklas, osteosit, dan elemen hematopoietik dari sumsum tulang. Osteogenic precursor cell
terdapat pada periosteum dan endosteum. Periosteum merupakan jaringan ikat yang menutupi
tulang, kecuali pada permukaan persendian, yang terdiri atas lapisan luar dan lapisan dalam.
Lapisan luar terdiri dari jaringan ikat padat yang iregular sedangkan lapisan dalam disebut
juga osteogenic layer terdiri dari sel-sel osteogenic. Pada endosteum hanya terdapat selapis
sel osteogenic dan tidak mengandung komponen jaringan ikat (Kalfas, Iain 2001).

Ada dua tipe dasar tulang: lapisan luar tulang korteks yang padat (compact) berfungsi
terutama untuk proteksi, dan lapisan dalam tulang kanselus (trabecular, spons) yang terdiri
dari kompartemen sumsum merah di ujung tulang panjang. Lapisan jaringan ikat padat yang
disebut periosteum mengelilingi permukaan luar dari tulang kortikal dan berisi pembuluh
darah yang memberikan nutrisi untuk tulang, fibroblas, pericytes dan sel-sel progenitor
multipoten dengan kapasitas untuk berdiferensiasi menjadi tulang, tulang rawan, lemak, dan
otot (Putri dkk,2013).

Tipe tulang dibagi menjadi tulang imatur dan matur, pada tulang imatur terlihat di
masa janin/embryonic bone, pada penyembuhan patah tulang dan keadaan patologis pada
tulang (tumor atau infeksi dengan tingkat turnover tulang yang tinggi). Tulang matur yaitu
tulang kortikal (kompak) atau tulang kanselus (trabekular, spon). Tulang kortikal membentuk
80% dari keseluruhan tulang dan ditandai oleh sistem Haversian atau osteons. Dimana fibril
kolagen secara paralel membentuk cincin di sekitar kanal Haversian. Osteosit terperangkap di
dalam lakuna yang berkomunikasi satu sama lain dan kanal Haversian melalui kanalikuli. Di
dalam lanal Haversian terdapat anyaman neurovaskular. Kanal Volkmann berjalan tegak
4
lurus dengan kanal Haversian dan bergabung dengan suplai darah periosteal menuju sirkulasi
pusat (Little et al. 2011).

Protein penanda / marker pada proses inflamasi

Inflamasi atau yang sering dikenal dengan istilah radang merupakan suatu kejadian
normal dari tubuh yang berkaitan dengan sistem kekebalan tubuh. Inflamasi ini terjadi akibat
sistem pertahan yang ada dalam tubuh sudah tidak mampu lagi melawan paparan benda asing
dari tubuh (virus dan bakteri) secara biologis tempat tempat yang mendapatkan serangan dari
luar tersebut akan terjadi inflamasi atau peradangan. Beberapa produk gen pro-inflamasi telah
diidentifikasi memiliki peran penting pada penekanan apoptosis, proliferasi, angiogenesis,
invasi, dan metastasis. Di antara produk gen tersebut adalah TNF alfa dan anggota
superfamilinya, IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP (Paulo V, 2015).

Gambar 1. Jalur signal inflamasi ( Paulo V, 2015).

Tumor necrosis factor- alpha (TNF-α)

Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) dikenal sebagai sitokin prototipe dari superfamili TNF
dan merupakan molekul multifungsi dalam regulasi proses proliferasi sel, diferensiasi, apoptosis,
metabolisme lipid, dan koagulasi. TNF-alpha diproduksi terutama oleh makrofag, dan sejumlah besar
sitokin ini dilepaskan sebagai respons terhadap lipopolisakarida, produk bakteri lainnya. Interleukin-1
(IL-1) dan TNF-alpha menghambat fungsi osteoblast dan merangsang osteoblast untuk apoptosis..
TNF-alpha terlibat dalam memerangi tumorigenesis, dengan demikian, dianggap sebagai wawasan
molekuler dalam pengobatan kanker.

5
 TNF-alpha merupakan mediator inflamasi yang memiliki autokrin, parakrin, dan aksi
endokrin., dimana sel adiposite memberikan peranan penting dalam regulasi akumulasi
lemak tubuh. TNF-α menginduksi apoptosis sel ligamen periodontal yang berperan sebagai
sumber prekursor osteoblas. TNF-alpha terlibat dalam tumour-induced resorpsi tulang.,
dimana molekul TNF yaitu RANKL dan reseptornya RANK (receptor activator of NFkB
ligand) yang menyebabkan bone loss spesifik. RANKL dan RANK merupakan regulator
kunci pada remodeling tulang dan esensi utama pada perkembangan dan aktivasi osteoklas.

2.10 Penanda / marker proses osteogenesis

Metabolisme tulang juga dipengaruhi oleh beberapa protein dan faktor pertumbuhan,
yang dilepaskan dari platelets, makrofag, dan fibroblast. Protein-protein ini membantu tulang
untuk membentuk vaskularisasi baru, menjadi padat, bergabung dan berfungsi secara
mekanis. Protein ini juga menginduksi sel-sel dari mesenkimal seperti monosit dan fibroblast,
untuk bermigrasi, berproliferasi dan berdifferensiasi di dalam tulang. Protein yang
meningkatkan penyembuhan tulang meliputi BMP, insulin-like growth faktor, faktor
pertumbuhan transformasi, faktor pertumbuhan yang diturunkan dari platelet dan faktor
pertumbuhan dari fibroblast (Lauing et al. 2013).
Protein yang cukup dikenal adalah BMP, derivat glikoprotein yang berasal dari matriks
tulang. Bone Morphogenesis Proteins (BMP) menginduksi sel-sel mesenkimal untuk
berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang. Meskipun biasanya hadir dalam beberapa saat di dalam
tubuh, beberapa BMP telah disintesis menggunakan teknologi DNA rekombinan dan saat ini
sedang menjalani uji klinik untuk menilai potensinya dalam penyembuhan tulang pada
manusia. Protein-protein yang lain mempengaruhi penyembuhan tulang dengan cara yang
berbeda.

4.1.5 OSTERIX (Osx)

Osterix (Osx) adalah faktor transkripsi khusus osteoblas yang sangat penting untuk

pembentukan tulang. MicroRNAs (miRNAs) adalah RNA nonkoding tanpa ~ 22-nukleotida

6
yang memainkan peran penting dalam regulasi hewan dan tanaman dengan menargetkan

mRNA untuk pembelahan atau represi translasi. Osterix juga dapat mengontrol pembentukan

tulang yang dimediasi osteoblas dan remodeling tulang yang berhubungan dengan osteoklas .

Osx (Osterix) adalah faktor transkripsi yang mengandung zinc finger yang penting

untuk diferensiasi osteoblast dan pembentukan tulang, terutama di ekspresikan pada semua

tulang dalam masa perkembangan. Jika tidak ada osterix maka tidak ada tulang kortikal dan

trabekula yang terbentuk melalui intramembran atau osifikasi endochondral. Selama

pembentukan tulang endochondral yang normal, degradasi matriks tulang rawan yang

termineralisasi oleh osteoclast dan deposisi dari matriks tulang terjadi dengan koordinasi

ketat. Pada kondisi tidak ada Osx, sel mesenkim dari periosteum dengan pembuluh darah

menginvasi matriks mineral dari daerah kondrosit yang mengalami hipertrofi. Sel

mesenkimal yang bermigrasi dengan osteoclast dan pembuluh darah tidak dapat mendeposit

matriks tulang, sehingga tidak terjadi penulangan pada matriks dengan mesenkim (Kazuhisa

et al, 2012).

Penelitian yang dilakukan oleh Ying Cao.,Et al.2008 menunjukan adanya down
regulasi pada level transkripsional oleh Osx terhadap ekspresi dan produksi dari IL-1α, suatu
sitokin yang menstimulasi pembentukan osteoklas dengan memproduksi RANKL oleh sel
stromal sumsum tulang dan osteoblast. Sitokin seperti IL-1α, IL-6, IL-11, dan prostaglandin
E2 menunjukan partisipasi dalam proses bone remodelling dengan menginduksi RANKL dan
pembentukan osteoklas. Karena itu perubahan dari kadar sitokin ini dapat mempengaruhi
bone lysis (Ying Cao et al, 2008).

5.1 Kulit Buah Manggis

7
 Manggis merupakan tanaman buah berupa pohon yang berasal dari hutan tropis yang

teduh dikawasan Asia Tenggara, yaitu hutan belantara Malaysia atau Indonesia.

Manggis memiliki nama latin Garcinia mangostana L dan termasuk ke dalam keluarga

Clusiaceae. Buah manggis dikenal dengan sebutan Queen fruit atau ratunya buah. Hasil

penampisan fitokimia ekstrak kulit buah manggis menunjukkan bahwa ekstrak tersebut

mengandung komponen kimia alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid,

steroid dan glikosida. Dibandingkan dengan buah yang lainnya, kandungan antioksidan

dalam kulit manggis juga jauh lebih tinggi. Kulit manggis pun dapat dipakai untuk

kemoterapi dan untuk mengurangi dampak dari kemoterapi (Lih-Geeng et al, 2008).

Komponen aktif utama dari buah manggis disebut xanthones. Xanthone adalah sejenis

senyawa polifenol yang secara biologis aktif dan secara struktural mirip dengan

bioflavanoids. Senyawa ini jarang terdapat di alam, paling banyak ditemukan hanya dalam

dua keluarga tanaman. 200 jenis xanthones alami yang sejauh ini telah diidentifikasi. Sekitar

40 jenis diantaranya telah ditemukan dalam buah manggis. Xanthone dan turunannya telah

terbukti memiliki beberapa manfaat, termasuk anti-inflamasi dan anti-alergi (Cui et al, 2010).

Berdasarkan studi literatur penelitian Garcinia mangostana L mempunyai aktivitas anti

inflamasi adalah -mangosten dan -mangosten yang merupakan senyawa utama dari

xanthone yang menghambat produksi enzim siklooksigenase(COX) yang merupakan

penyebab radang (Jung dkk, 200. Beberapa uji pra-klinik pada hewan coba tikus

menunjukkan zat aktif gamma mangostin (derivat xanthone) secara langsung menghambat

aktivitas enzim Ikappa B kinase mencegah proses transkripsi gen COX-2 (gen target NF-

kappaB), menurunkan produksi PGE2 dalam proses inflamasi (Middleton, 2000). Penelitian

sebelumnya membuktikan bahwa xanthone dalam ekstrak kulit manggis menghambat

aktivitas ROS intraselular. Inhibisi aktivitas ROS intraselular akan menghambat aktivitas

8
enzim yang mengaktifkan nuclear factor kappa B (NF-kB) untuk translokasi ke dalam

nukleus dan meregulasi mediator pro-inflamasi seperti IL-1, IL-6, TNF-alpha (Ibrahim,

2014).

1 Real-Time PCR

Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan salah satu teknik yang

paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern. RT-PCR memiliki berbagai

keunggulan untuk amplifikasi atau perbanyak DNA fragmen yang dapat diamati secara tepat

untuk menentukan konsentrasi DNA yang terdapat dalam sampel (Vierman, 2004). Prinsip

proses amplifikasi menggunakan real-time PCR dengan cara mengukur peningkatan pewarna

(dye) fluoresen yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Oleh karena sifat

inilah pertumbuhan fragmen DNA hasil amplifikasi sapat diikuti secara seketika, semakin

banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluoresensi yang dihasilkan

Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga

hitungan pictogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi.

Hasil peningkatan fluoresensi digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan 3

fasa yaitu fase awal, fase eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman,

2004).

Terdapat tiga komponen utama dalam instrument RT-PCR yaitu thermal block

cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis

9
data. Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan

menggunakan multiwell plates (Roche, 2008).

8.1. Osteoblastic cell line MC3T3-E1

MC3T3-E1 mewakili garis sel osteoblast popular mewakili fenotip pra osteoblastik.

Beberapa sub-klon telah dibentuk dari yang baru lahir ini garis sel klonal calvaria tikus.

Terdapat 5 diantaranya subklon 4,8,11,14, dan 26. Sub-klon mineralisasi menyatakan tingkat

tinggi mRNA untuk BSP, osteocalcin, dan reseptor PTH/ PTHrP. Dari klon-klon ini hanya

sub-klon 4 dan 14 yang ditunjukkan untuk membuat mineral matriks ekstraseluler kolagen

dan mirip dengan osteogenesis intramembran in vivo.

9.1 Lipopolisakarida (LPS)

Lipopolisakarida merupakan memberan luar bakteri gram negative, yang terdiri dari
kompossi endotoksin terdiri ata rantai polisakarida (Rantai O). Endotoksin bakteri gram
negative mangikat larutan LPS-Binding protein atau membrane luar sel mononukleus.
Pengaruh interaksi antara monosit, makrofag dan netrofil melepas mediator inflamasi seperti
Interleukin (IL), Interferon (IF), Platelet activating factor (PAF) dan Tumor necrosis factor
(Naqvi, 2015).

Gambar 5. Komponen Membran luar gram negative (LPS) (Naqvi, 2015).

10
 Metabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan merangsang
terjadinya inflamasi, di antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS) yang dikandung dinding
sel bakteri gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri mati.8 Bakteri agresif penyebab
periodontitis terutama adaMetabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan
merangsang terjadinya inflamasi, di antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS) yang
dikandung dinding sel bakteri gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri mati. Bakteri
agresif penyebab periodontitis terutama adalah Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis).
P.gingivalis (viable atau konstituennya) teridentifikasi pada plak aterosklerotik manusialah
Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). P.gingivalis (viable atau konstituennya)
teridentifikasi pada plak aterosklerotik manusia (Harazy, 2000).

11
 BAB 4
ROAD MAP PENELITIAN

MC3T3-E1 Osteogenesis

OSTERIX

TNFα
Xanthone Inflamasi

Mangosteen
Pericarp

LPS Keterangan :
: menginduksi
: menghambat
: Kandungan / penanda

12
13