BAB 5

HASIL YANG DICAPAI

5.1 Pembuatan ekstrak kulit manggis

Pembuatan ekstrak kulit manggis dilakukan di UPT Laboratorium Herbal Materia

Medica Batu dengan metode maserasi dengan pelarut DMSO 0,1%. Pembuatan ekstrak
kulit manggis ini bertujuan untuk kelompok perlakuan pada sel fibroblast dan sel
osteoblast.

5.2 Hasil MTT assay

5.3 Hasil wound healing assay fibroblast

Wound healing assay dilakukan pada sel fibroblast yang telah diberi Ekstrak kulit
manggis dibandingkan kelompok control selama 24 dan 48 jam. Pada pengamatan sel
fibroblast yang telah diberi ekstrak kulit manggis selama 24 dan 48 jam didapatkan
perbedaan dimana sel fibroblast yang dilakukan perlakuan didapatkan migrasi sel
secara individu ke tengah. Hal ini disebut sebagai single cell migration. Berbeda hasil
pada sel fibroblast yang tidak diberi perlakuan selama 24 dan 48 jam didapatkan sel
yang bergerak Bersama sama yang sering dinamakan collective cell migration.

Gambar 5.3.1 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 0 jam
Gambar 5.3.2 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 24 jam
dengan diberi ekstrak kulit manggis

Gambar 5.3.3 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 48 jam
dengan diberi ekstrak kulit manggis
 Gambar 5.3.4 sel fibroblast sudah dilakukan uji scratch assay wound healing 48 jam
tanpa diberi ekstrak kulit manggis

5.4 Hasil PCR fibroblast without wound healing

Gambar 5.4.1
A. Hasil pembacaan TGFβ-1 pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24
jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48 jam.
B. Ekspresi GAPDH (a) kontrol 24 jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d)
perlakuan 48 jam.
 Gambar 5.4.2
A. Hasil pembacaan PDGF-B pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24
jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48 jam.
B. Ekspresi GAPDH (a) kontrol 24 jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d)
perlakuan 48 jam.

Gambar 5.4.3
A. Hasil pembacaan FGF-2 pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24 jam,
(b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48 jam.
B. Ekspresi GAPDH (a) kontrol 24 jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d)
perlakuan 48 jam.

Gambar 5.4.4
A. Hasil pembacaan VEGF-A pada gel elektroforesis menggunakan gel doc. (a) kontrol 24
jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d) perlakuan 48 jam.
B. Ekspresi GAPDH (a) kontrol 24 jam, (b) perlakuan 24 jam, (c) kontrol 48 jam, (d)
perlakuan 48 jam.
 Gambar 5.4.5 Diagram perbandingan kelompok TGFβ-1 kontrol dan perlakuan 24 dan 48
jam menggunakan Image J

Gambar 5.4.6 Diagram perbandingan kelompok PDGF-B kontrol dan perlakuan 24

dan 48 jam menggunakan Image J

Gambar 5.4.7 Diagram perbandingan kelompok FGF-2 kontrol dan perlakuan 24 dan 48 jam
menggunakan Image J
 Gambar 5.4.8 Diagram perbandingan kelompok VEGF-A kontrol dan perlakuan 24 dan 48
jam menggunakan Image J

Ekstrak kulit manggis memiliki xanthone dan flavonoid yang merupakan antioksidan dalam
kulit manggis. Antioksidan dapat menetralisir radikal bebas dengan cara menyumbangkan
elektronnya pada radikal bebas yang berperan menurunkan ROS sehingga stimulasi makrofag
tidak terhambat. Makrofag akan mensekresi growth factor seperti FGF, PDGF, TGFβ, dan
VEGF yang dapat menarik lebih banyak fibroblas ke daerah luka dan mensintesis kolagen serta
meningkatkan proliferasi pembuluh darah kapiler.

Hal ini dapat menjelaskan peningkatan TGF-β1 pada kelompok perlakuan. Namun
perbedaan pendaran band TGF-β1 pada kelompok perlakuan 24 jam tidak signifikan bila
dibandingkan dengan kelompok 48 jam. Hal tersebut dikarenakan fase inflamasi dimulai pada
hari ke-2. Pada fase inflamasi, sel melepaskan faktor pertumbuhan seperti platelet derived
growth factor (PDGF) dan transforming growth factor ß (TGF ß), granulocyte colony
stimulating factor (G-CSF), C5a, TNFα, IL-1 dan IL-8.
Xanthone dapat dihubungkan dengan peningkatan ekspresi kelompok perlakuan
VEGF-A karena xanthone dapat berikatan dengan suatu unsur radical superoxide (O2- ) dan
kemudian akan melepaskan suatu unsur free Nitric Oxide (NO). Dalam jumlah kecil, NO dapat
meningkatkan ekspresi VEGF melalui jalur PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)-Akt yang
mentransduksi sinyal intraseluler sehingga gen HIF-1α akan teraktivasi. Dimana Hipoksia-
inducible factor (HIF-1) merupakan regulator transkripsi kunci untuk beberapa faktor
angiogenik. Kemudian sinyal tersebut akan mempengaruhi nukleus yang didalamnya terdapat
gen VEGF. Nukleus akan mengekspresikan VEGF didalam sel dan dikeluarkan dari dalam sel
berbentuk suatu protein VEGF yang nantinya mempengaruhi peningkatan angiogenesis dan
diharapkan akan mempengaruhi percepatan penyembuhan luka. Peningkatan ekspresi VEGF
pada hasil PCR menunjukkan adanya kemungkinan bahwa jumlah NO pada penelitian ini kecil,
dan dihubungkan dengan kadar ekstrak kulit manggis yang optimal yakni 800 µg/ml.
Sebaliknya, jika kadar ekstrak kulit manggis lebih dari 800 µg/ml dan jumlah NO besar maka
ekspresi VEGF dapat menurun. Penelitian ini melihat kondisi sel secara normal yang tidak
mengalami inflamasi serta diharapkan mampu menunjukkan peningkatan ekspresi VEGF
setelah pemberian ekstrak kulit manggis. Salah satu faktor dalam penyembuhan luka yaitu
VEGF ini memang lebih poten pada aktivitas mitogen yang terbatas pada sel endotel vaskular.
Peningkatan ekspresi VEGF pada kelompok perlakuan 24 jam dan 48 jam sudah menunjukkan
bahwa aplikasi ekstrak kulit manggis menghasilkan aktivitas proliferasi fibroblas yang lebih
baik.
Penurunan PDGF-B pada kelompok perlakuan dapat dijelaskan oleh kandungan ekstrak
kulit manggis yaitu flavonoid yang diketahui menghambat reseptor PDGFR-β yang merupakan
reseptor dari PDGF-B. Flavonoid memutuskan ikatan PDGFR- β pada transduksi sinyal tingkat
molekul yaitu Ras GAP, SHP-2 (Phosphotyrosine Phosphatase), PI3K (Phophatidylinositol 3-
Kinase), PLCγ (Phospholipase Cγ1). Flavonoid juga menghambat aktivasi Erk dan induksi gen
awal serta proliferasi dan migrasi. Penurunan kelompok kontrol PDGF-B 48 jam disebabkan
PDGF muncul pada awal fase penyembuhan luka yaitu fase hemostasis, kemudian akan
mengalami penurunan dan muncul kembali pada fase inflamasi kronis 72 jam kemudian.
Pada FGF-2, flavonoid dapat meningkatkan pelepasan Nitric Oxide (NO) dari Vascular
Smooth Muscle Cell (VSMC) sehingga terjadi peningkatan FGF-2. Didapatkan hasil bahwa
tingginya kadar NO yang dilepaskan oleh VSMC mengakibatkan pelepasan FGF-2 sehingga
merangsang proliferasi sel endotel. NO yang dilepaskan dari VSMC menjadi sinyal penting
pada interaksi seluler antara sel endotel dan VSMC. Sinyal interaksi seluer ini melibatkan
transkripsi Early growth response-1 (Egr-1) melalui mekanisme Mitogen Activated Protein
Kinase (MAPK). Aktivasi dari jalur MAPK akan mengaktifkan Endotelin-3 (ET-3) lalu
ditranskripsi oleh EGR-1, transkripsi ini mempengaruhi nucleus yang didalamnya terdapat
FGF-2. Kemudian nucleus mengekspresikan FGF- 2 didalam sel yang nantinya mempengaruhi
peningkatan ekspresi FGF-2.
Kandungan lain dari ektrak kulit manggis adalah saponin yang dapat meningkatkan
proliferasi monosit sehingga dapat meningkatkan jumlah makrofag yang menstimulasi sekresi
growh factor. Saponin akan mengaktifkan fungsi dari TGFβ-1. TGFβ-1 memiliki beberapa
fungsi seperti sintesis matriks ekstraseluler, migrasi sel, diferensiasei sel, dan sebagai
imunosupresor.12
Ada beberapa mekanisme aktivasi TGFβ oleh saponin; (1) saponin menstimulasi sintesis,
sekresi, dan aktivasi TGFβ-1 pada sel fibroblas, (2) saponin mengubah ekspresi reseptor TGFβ,
(3) saponin memodifikasi sistem transduksi sinya pada post-reseptor TGFβ. Perubahan
ekspresi reseptor TGFβ adalah sebuah hal penting karena dalam percepatan sintesis fibronectin
dari fibroblas disebabkan oleh saponin.

5.5 Hasil PCR fibroblast dengan wound healing assay

Gambar 5.5.1. Visualisasi hasil PCR.

1, 2: kontrol 24 jam ; 3, 4: perlakuan 24 jam ; 5, 6: kontrol 48 jam ; 7,8: perlakuan 48 jam ;

M: marker
 PDGF-B
14000
12340
11537
12000

10000 9098 8884

8000 7294 7509

6798 6673

6000

4000

2000

0
Kontrol 24 Perlakuan 24 Kontrol 48 Perlakuan 48

Sampel 1 Sampel 2

Gambar 5.5.2 Grafik ekspresi PDGF-B dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software
ImageJ

TGF-β1
13500 13279 13302
13022
13000 12765

12500

12000 11883 11851

11668 11723

11500

11000

10500
Kontrol 24 Perlakuan 24 Kontrol 48 Perlakuan 48

Sampel 1 Sampel 2

Gambar 5.5.3 Grafik ekspresi TGF-1 dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software
Image J
 FGF-2
9000 8426

8000

7000 6240
6000

5000 4557 4783

4000

3000 2564
2073
2000
1026 1018
1000

0
Kontrol 24 Perlakuan 24 Kontrol 48 Perlakuan 48

Sampel 1 Sampel 2

Gambar 5.5.4 Grafik ekspresi FGF-2 dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software
ImageJ

VEGF
35000
30301 31211 31534
30000
26344
25000 22136
20952
19340
20000
14921
15000

10000

5000

0
Kontrol 24 Perlakuan 24 Kontrol 48 Perlakuan 48

Sampel 1 Sampel 2

Gambar 5.5.5 Grafik ekspresi VEGF dari hasil kalibrasi dengan menggunakan software
ImageJ

Kandungan ekstrak kulit manggis yang berpengaruh dalam peningkatan ekspresi growth
factor adalah xanthone, flavonoid, tanin, saponin. Xanthone dan flavonoid berfungsi sebagai
anti-inflamasi dengan cara menghambat kerja enzim siklooksigenase dengan lebih cepat dan
ditandai dengan proliferasi sel fibroblas yang meningkat. Proliferasi fibroblast yang meningkat
ini menunjukkan adanya keterlibatan dari reseptor PDGF-B yaitu PDGFR-β. PDGFR-β
memiliki peran penting pada proliferasi, transformasi, dan sekresi kolagen dari fibroblas. Pada
beberapa penelitian tentang perbaikan vaskular dan angiogenesis, ditemukan bahwa PDGFR-
β berfungsi melalui jalur pensinyalan PI3K/Akt, yang aktivasinya diketahui ikut terlibat pada
regulasi dari proliferasi, migrasi, diferensiasi dan angiogeneis pada sel. PDGF-B menginduksi
tirosin fosforilase dari PDGFR-β dan meningkatkan produksi inositol trifosfat, kemudian
PDGFR-β merekrut PI3K, fosfolipase Cg1, Src family kinase, dan fosfotirosin fosfatase SHP-
2. PI3K kemudian mengaktifkan Akt yang berfungsi sebagai regulator multifungsi pada
pertumbuhan dan ketahanan sel serta menstimulasi proliferasi, migrasi dan angiogenesis.
Kandungan ekstrak kulit manggis xanthone juga diketahui dapat meningkatkan proses
angiogenesis melalui ekspresi VEGF. Antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak kulit
manggis atau di dalam xanthone dapat berikatan dengan suatu unsur radical superoxide (O2-)
dan kemudian akan melepaskan suatu unsur free Nitric Oxide (NO). NO dapat meningkatkan
ekspresi VEGF melalui jalur PI3K (Phosphoinositide 3-kinase)-Akt yang mentransduksi sinyal
intraseluler sehingga gen HIF-1a akan teraktivasi. Dimana Hipoksia-inducible factor (HIF-1)
merupakan regulator transkripsi kunci untuk beberapa faktor angiogenik. Kemudian sinyal
tersebut akan mempengaruhi nukleus yang didalamnya terdapat gen VEGF. Nukleus akan
mengekspresikan VEGF di dalam sel dan dikeluarkan dari dalam sel berebentuk suatu protein
VEGF yang nantinya mempengaruhi peningkatan angiogenesis dan diharapkan akan
mempengaruhi percepatan penyembuhan luka.
Flavonoid dalam kandungan ekstrak kulit manggis dapat mempengaruhi ekspresi FGF-2
yang lebih tinggi pada kelompok perlakuan 24 jam. Hal ini berhubungan dengan adanya
peningkatan kadar Nitric Oxide (NO) yang dipengaruhi oleh adanya flavonoid. Mekanisme ini
diawali dengan proses direct signaling FGF-2, yaitu transfer molekul dari satu sel ke sel
lainnya melalui membran sel. Terikatnya FGF-2 ekstraselular terhadap reseptornya yaitu
FGFR-2 yang ada pada permukaan membran sel fibroblas, dengan heparan sulfat proteoglikan
(HSPG) sebagai kofaktor, akan membentuk formasi kompleks berupa FGF-FGFR-HSPG.
Kompleks ini kemudian mengaktifkan domain tirosin kinase FGFR-2 intraselular melalui
fosforilasi dari residu tirosin. Reseptor yang telah aktif akan memberi sinyal melalui jalur Ras-
MAPK (mitogen-activated protein kinase). Aktivasi dari reseptor tersebut menginduksi
peningkatan konsentrasi sitosolik dari Ca2+ melalui produksi inositol-1,4,5-trifosfat oleh
fosfolifase Cγ dan Ca2+ yang dikeluarkan dari retikulum endoplasma yang diperantarai oleh
aktivasi kanal Ca2+. Peningkatan Ca2+ akan membentuk kompleks Ca2+-kalmodulin
(Ca2+/CaM) yang akan mengakibatkan aktivasi eNOS, yaitu enzim yang akan menyintesis NO.
Kemudian NO yang telah disintesis akan mengaktifkan sitosolik guanilil silase yang akan
menginduksi cGMP. cGMP kemudian mengaktivasi protein kinase G (PKG) yang akan RAF
kinase. RAF kinase akan berfosforilasi, lalu mengaktifkan MEK yang akan berfosforilasi juga
dan mengaktifkan MAPK. MAPK akan mengaktifkan Etv4 dan Etv5 yang merupakan anggota
dari famili faktor transkripsi DNA, yang akan berpengaruh pada proses transkripsi dari ekspresi
FGF-2 di dalam nukleus.
Tanin dan Saponin dalam ekstrak kulit manggis berpengaruh pada peningkatan ekspresi
dari TGF-β1. Kandungan tanin dalam ekstrak kulit manggis dapat merangsang TGF-β untuk
stimulasi proliferasi fibroblas. Tannin merupakan antioksidan yang memiliki ikatan dengan
protein dan polisakarida yang mampu membentuk kompleks kuat sehingga dapat
meningkatkan ekspresi dari TGF-β1. Kandungan saponin dalam kulit manggis akan
mengaktifkan fungsi dari TGF-β. Saponin mengaktifkan reseptor TGF-β yaitu TGF-βR1 untuk
menstimulasi peningkatan dari TGF-β1 pada reseptor fibroblas. Peningkatan TGF-β1 dapat
menstimulasi migrasi sel ke arah perlukaan dan meningkatkan proliferasi fibroblas.22
Mekanisme saponin mengaktivasi TGF-β yaitu saponin menstimulasi sintesis, sekresi, dan
aktivasi pada sel fibroblas, lalu saponin mengubah ekspresi reseptor TGF-β, dan saponin
memodifikasi transduksi sinyal pada post-reseptor TGF-β.
Pada penelitian ini, ekspresi PDGF-B dan FGF-2 pada kelompok sampel 48 jam, baik
kontrol maupun perlakuan mengalami penurunan dibanding kelompok sampel 24 jam. Hal ini
kemungkinan berhubungan dengan selesainya proliferasi dari kultur sel HGF pada penelitian
in vitro ini. Sel fibroblas berhenti tumbuh setelah membentuk selapis tunggal yang rata
(confluent monolayer) di bagian dasar media kultur karena adanya contact inhibition. Sel akan
menghentikan proliferasinya pada saat sel tersebut sudah berkontak dengan sel lainnya. PDGF-
B yang berperan pada proses wound healing meningkat pada fase awal penyembuhan luka,
kemudian akan mengalami penurunan apabila proses neovaskularisasi telah selesai serta
perfusi di area luka telah kembali normal. Selain itu, hal yang kemungkinan berperan terhadap
rendahnya ekspresi FGF-2 pada waktu 48 jam adalah efek dari konsentrasi 800 μg/ml ekstrak
kulit manggis yang pengaruhnya bersifat sementara. Jika ekpresi FGF-2 terjadi terus menerus
maka akan terjadi overekspresi yang pada akhirnya bisa mengakibatkan tumbuhnya berbagai
macam sel kanker seperti kanker prostat, melanoma, dan karsinoma hepatoselular.
5.6 Kultur Sel Osteoblast

Gambar 5.6.1 Kultur sel Osteoblast

5.7 Submit jurnal ke Q3 Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e clinica

Integrada
 5.8 Rencana tahap berikutnya

1. Ekstraksi RNA
Sel Osteoblast dilakukan kultur sampai dengan 80% confluent dan di beri LPS (
Lipopolysaccharides ) kemudian diberi treatment ekstrak kulit manggis selama 24.
Setelah 24 jam dilakukan ekstraksi RNA dengan menggunakan kit Purelik RNA Mini
kit. Proses ekstraksi RNA dilakukan sesuai dengan data sheet dari perusahaan. Dan
untuk menghitung kemurniaan dari RNA dilakukan pengecekan dengan nano drop.
Dikatakan RNA murni apabila nilai A260/A230 pada nano drop menunjukkan angka
 ratio 2,1. Dan apabila angka menunjukkan lebih tinggi dari 1,8 masih dapat diterima.
Apabila angka <1,8 maka RNA berpotensi untuk tercampur DNA atau protein.
2. Pembuatan cDNA
Setelah didapatkan RNA murni ( single stranded ) maka perlu dilakukan pembuatan
komplemen DNA atau cDNA. cDNA merupakan DNA untai tunggal sintetik atau
buatan yang disalin dari untaian mRNA menggunakan tehnik PCR dengan
memanfaatkan enzim reverse transcriptase. Pada pembuatan cDNA ini menggunakan
iScript cDNA Synhtesis kit.
3. Melakukan real time PCR
Setelah didapatkan cDNA maka dilakukan real time PCR dengan menggunakan reagen
SsoFast EvaGreen Supermix. Adapun primer yang diperiksa adalah TNF, CRP, IL-1,
IL-6, IL-10, OSterix, Runx2, ALP, BSP, Coll11.
4. Pengumpulan data dan statistik data
Dari hasil pemeriksaan real time PCR tersebut selanjutnya dilakukan pengumpulan data
dan analisis statistik

5. Pembahasan
Dari pengumpulan data dan hasil analisis statistik akan dilakukan pembahasan dan
kesimpulan penelitian

6. Penyusunan draft artikel ilmiah

Draf artikel ilmiah akan disubmit pada jurnal internasional Q3.

5.9 Kendala yang dihadapi

1. Pemesanan alat dan bahan untuk real time yang membutuhkan waktu 3 bulan
2. Ketersediaan kamera mikroskop yang tidak tersedia di Riset senter di FKG Unair
 5.10 Solusi penyelesaian

1. Menunggu 3 bulan untuk melakukan penelitian

2. Mencari tempat ketersediaan kamera mikroskop di tempat lain

5.10. Perkiraan riset dapat diselesaikan

1. April 2019

5.11. Rincian biaya yang dikeluarkan

1. Alat dan bahan 19 juta dengan rincian kuitansi terlampir