III.

Teori Dasar
3.1. Definisi Isolasi
Isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba
lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat
dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan
membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur, I. dan Asnani, 2007).
Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakkan
campuran menjadi biakan murni. (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel
individu) (Lim, 1998).
Menurut Dwiyana (2011), terdapat beberapa cara untuk mengisolasi
mikroba yakni
1. Teknik Piringan Goresan (Streak plate method)
Medium agar dicairkan, didinginkan pada suhu 45 C, dituang ke dalam
cawan petri steril (cawan gelas dengan garis tengag tiga inci) dan dibiarkan sampai
menjadi padat. Kemudian dengan kawat gelang menginokulasi yang penuh dengan
biakan campuran (misalnya specimen ludah atau bahan lain), goresan dilakukan
diatas permukaan agar. Ada beberapa metode penggorean yang berbeda, namun
kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organism pada
beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan
kawat gelang kian kemari dari satu bagian ke bagian lain. Cawan petri, bakteri yang
tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika dilakukan secara sempurna,
goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual cukup terpisah satu sama lain,
sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari bakteri
individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal
dapat ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni.
2. Metode Tuang (pour-plate method)
Terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji yang
mengandung agar mencair yang telah didinginkan pada suhu 450c. isinya diaduk
untuk memencarkan bakteri keseluruh medium. Campuran itu kemudian ditungkan
kedalam cawan petri steril dan dibiarkan padat pertumbuhan koloni terjadi baik
dalam medium tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan bakteri satu
sama lain sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni yang terpisah
didalam medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari satu koloni
untuk mendapatkan biakan murni. Dalam praktek, sering piringan kedua digores
kembali dengan organisme yang berasal dari koloni yang diisolasi untuk menjamin
bahwa hasil yang diperoleh adalah biakan murni.
Sebelum diinokulasi tangan dan tempat kerja disemprot dengan alkohol
dengan menggunakan metode aseptik, jarum inokulasi disterilkan dengan
membakarnya, dengan api sampai jarum tersebut pijar (Pradika, 2008).
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah
metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati (Afrianto, 2004).
Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara
lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri
kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari
satu spesies (Dwidjoseputro, 2005).
Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk
memperoleh biakan murni yaitu :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan
waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan
menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang
telah dicairkan dan didinginkan ( ±50 oC ) yang kemudian dicawankan. Karena
konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui
sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga
sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di
atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan waktu
namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.
Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan
waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang
lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang
dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya
 mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali
dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah
tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores
sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung
untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan
sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990).
Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-
agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai
berikut :
1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan
tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur,
serupa akar, serum kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar,
timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah.
Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang
bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting.
2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi
koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa
duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar.
3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin.
Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk
koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni
yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan
berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat
serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis.
Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan
estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam
bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan
mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga
pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990).
Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang
menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah
menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida,
N., 2000).
3.2. Teknis Isolasi
Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba
diluar dari lingkungan alamiahnya. Mikroorganisme dapat diperoleh dari
lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan
hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, jamur, kapang dll.
Populasi mikroba di lingkungan sangan beranekaragam sehingga dalam
mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh
koloni tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk
suatu tujuan penelitian misalnya untuk mengisolasi DNA mikroba yang dapat
mendeteksi mikroba yang telah resistem terhadap suatu antibiotik.atau untuk
mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
 Teknik Pemindahan Biakan
Tujuan dari pemindahan biakan untuk menguasai teknik pemindahan
biakan bakteri dari satu wadah ke wadah lain, secara aseptik sehingga hanya biakan
murni yang diharapkan yang tumbuh. Hal ini sangat penting dalam tahap awal
pekerjaan isolasi mikroba terutama yang berasal dari stok kultur ( bukan dari
substrat). Kegagalan dalam hal pemindahan biakan dapatmenyebab
kankontaminasi dari pertumbuhan mikroba yang tidak diharapkan (Dwyana dan
As’adi, 2012).
Pemindahan bakteri dari medium lama kemedium baru memerlukan
banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat-alat
yang kan digunakan untuk mengerjakan medium dan pengerjaan inokulasi benar-
benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroba lain
yang tidak diinginkan sehingga biakkan yang tumbuh di dalam medium adalah
benar-benar biakan murni ( Dwidjoseputro, 1990).
 Teknik Pertumbuhan Mikroorganisme
1. Teknik Piringan Goresan (Streak plate method)
Medium agar dicairkan, didinginkan pada suhu 45 C, dituang ke dalam cawan
petri steril (cawan gelas dengan garis tengag tiga inci) dan dibiarkan sampai
menjadi padat. Kemudian dengan kawat gelang menginokulasi yang penuh dengan
biakan campuran (misalnya specimen ludah atau bahan lain), goresan dilakukan
diatas permukaan agar. Ada beberapa metode penggorean yang berbeda, namun
kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organism pada
beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan
kawat gelang kian kemari dari satu bagian ke bagian lain. Cawan petri, bakteri yang
tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika dilakukan secara sempurna,
goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual cukup terpisah satu sama lain,
sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari bakteri
individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal
dapat ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni. (Dwiyana,
2011)
2. Metode Tuang (pour-plate method)
Terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji yang
mengandung agar mencair yang telah didinginkan pada suhu 450c. isinya diaduk
untuk memencarkan bakteri keseluruh medium. Campuran itu kemudian ditungkan
kedalam cawan petri steril dan dibiarkan padat pertumbuhan koloni terjadi baik
dalam medium tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan bakteri satu
sama lain sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni yang terpisah
didalam medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari satu koloni
untuk mendapatkan biakan murni. Dalam praktek, sering piringan kedua digores
kembali dengan organism yang berasal dari koloni yang diidolasi untuk menjamin
bahwa hasil yang diperoleh adalah biakan murni (Dwiyana, 2011).
3. Teknik Sebar (spread plate)
Teknik isolasi dan mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada
permukaan media yang akan digunakan (Trianda, 2011).
4. Teknik Pengenceran (dilution method)
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-
macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil
pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut.
Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu
medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang
akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan
memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan
piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh
tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran
dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Trianda, 2011)
5. Teknik Micromanipulator
 Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam mikro
manupulator, kemudian ditempatkan dalam mikromanupulator. Kemudian
ditempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan ( Trianda, 2011).
Menurut Admin (2008), terdapat berbagai cara untuk mengisolasi mikroba
yakni :
1. Isolasi pada cawan
Prinsip pada metode isolasi pada cawan adalah mengencerkan mikroorganisme
sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya.
Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi
berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada
cawan, yaitu : metode gaores kuadran dan metode agar cawan tuang. Metode gores
kuadran , bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari setiap sel. Metoe agar tuang
berbeda dengan metoe gores kuadran, cawan tunag menggunakan medium agar
yang dicairkan dan didinginkan yang kemudian dicawankan, pengenceran tetap
perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni
yang terpisah di atas permukaan atau di dalam cawan.
2. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur
cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengencaran dengan beberapa serial
pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar .
3. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tiak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium
cair, sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan pembesaran sekitar 100 X,
kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat
halus ataupun micromanipulator yang dilakukan secara aseptik.
Daftar Pustaka

Ani Murniati, 2002. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi.Bogor: IPB Press.

Dwidjoseputro, D. 1992. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Imagraph.

Afrianto, L., 2004, Menghitung Mikroba Pada Bahan Makanan, Cakrawala

(Suplemen pikiran rakyat untuk iptek), Farmasi FMIPA ITB : Bandung.

Djida, N., 2000, Metode Instrumental dalam Mikrobiologi Umum, UNHAS. Press
: Makassar.

Dwidjoseputro, 1980, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan : Jakarta.

Dwyana Z,. Nurhaedar. 2011. Mikroobiologi Dasar. Universitas Hasanuddin.

Makassar

Dwyana Z,. Abdullah. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Universitas

Hasanuddin. Makassar

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia, Jakarta

Hadioetomo, R. S., 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia : Jakarta.

Lim, D. 1998. Microbiology. WCB McGraw-Hill. Missouri.

Nur Indriyani, Asnani, 2007, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Akuatik, Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan, Unhalu : Kendari.

Ratna, Sri, 1990, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Jakarta : Gramedia

Volk. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta.