Isolasi CDS tatAd

Komponen PCR

Kemungkinan polimerase yang dapat

1. Template DNA (Kromosom) digunakan :
2. DNA polimerase
3. dNTPS 1. KAPA HIFI
4. Primer ( For_Nco1_tatAd dan
2. Pfu
Rev_tatAd)
5. Buffer/ MgCl 3. Kod Neo Plus
6. Air PCR

TM Primer forward dan reverse : 62,6⁰C.

Suhu Annealing digunakan : 55-57⁰C.

Produk hasil PCR : 244 pb.

Konsentrasi kromosom yg didapat : 197,115 ng.

A. KAPA HI-FI

Alasan penggunaan KAPA :

 Terdapat dalam disertasi Kak Saad (untuk penambahan situs restriksi yaitu NcoI dan NheI
komponen polimerase yang digunakan adalah KAPA).
 High Proofreading
 Dapat memberikan fidelitas yg tinggi sehingga produk hasil PCR yang diberikan spesifik.

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 21,95 42,375
5X KAPA HiFi Buffer 5 12,5
10mM dNTP Mix 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer For 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer Rev 0,75 (0,3 µM) 1,875
Template DNA 10-50 ng ( 0,3 -
µL)
1 U/µL KAPA HiFi Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 24,7 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 0,3 µL cetakan DNA
(kromosom). Dalam kontrol negatif ditambahkan 0,3 µL air PCR.
3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing 55⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan :

1. Cetakan DNA

Konsentrasi hasil isolasi kromosom = 197,115 ng/µL

Konsentrasi target = 60 ng.

197,115 ng = 1 µL

60 ng = x µL -> x = 0,304 µL.

2. Primer Forward, Reverse, dNTPs.

Mis. Working stock dan dNTPs = 20 µM

V1 M1 = V2 M2

V1. 20 µM = 25 µL. 0,3 µM

V1 = 0,75 µM

B. Pfu

Alasan :

 High proofreading
 Baik untuk sekuens pendek <1 kb
 Digunakan untuk menghasilkan produk amplifikasi yang bersifat blunt-end.
 Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 13,21 33,025
10X Pfu buffer dgn MgSO4 5 12,5
2mM dNTP Mix 2,5 (0,2 mM) 6,25
20 µM Primer For 0,625 (0,5 1,5625
µM)
 20 µM Primer Rev 0,625(0,5 µM) 1,5625
Template DNA 500 ng -
(2,54µL)
2,5 U/ µL Pfu Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 22,46 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 2,54 µL cetakan DNA (kromosom).
Dalam kontrol negatif ditambahkan 2,54 µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing 55⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.

C. Kod-Plus-Neo

Alasan :

 High proofreading, error rate rendah

 Produk PCR tidak memiliki overhang A

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 13,985 34,9625
10X Buffer Kod Plus Neo 2,5 6,25
25mM dNTPs 2,5 (0,2 mM) 6,25
25 mM MgSO4 1,5µL 3,75
20µM Primer For 1,5µL 3,75
20µM Primer Rev 1,5µL 3,75
Template DNA 200 ng -
(1,015µL)
1 U/ µL Kod Neo Polimerase 0,5 1,25

2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 23,985 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 1,015 µL cetakan DNA
(kromosom). Dalam kontrol negatif ditambahkan 1,015 µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus
Pre-Denaturasi 94⁰C; 2 menit 1
Denaturasi 98⁰C; 10 detik 35
Annealing 55⁰C; 1 menit
Elongasi 68⁰C; 2,5 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 10 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.

Isolasi CDS tatCd

Komponen PCR

1. Template DNA (Kromosom) Kemungkinan polimerase yang dapat

2. DNA polimerase digunakan :
3. dNTPS
1. KAPA HIFI
4. Primer ( For_tatCd dan
Rev_XhoI_tatCd) 2. Pfu
5. Buffer/ MgCl
6. Air PCR 3. Kod-plus Neo

TM Primer forward : 53,8⁰C.

TM Primer reverse : 70,1⁰C.

Suhu Annealing digunakan : 53 ⁰C.

Produk hasil PCR : 758 pb.

Konsentrasi kromosom yg didapat: 197,115 ng.

A. KAPA HI-FI

Alasan penggunaan KAPA :

 Terdapat dalam disertasi Kak Saad (untuk penambahan situs restriksi yaitu NcoI dan NheI
komponen polimerase yang digunakan adalah KAPA).
 High Proofreading
 Dapat memberikan fidelitas yg tinggi sehingga produk hasil PCR yang diberikan spesifik.

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 21,95 42,375
5X KAPA HiFi Buffer 5 12,5
10mM dNTP Mix 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer For 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer Rev 0,75 (0,3 µM) 1,875
Template DNA 10-50 ng ( 0,3 -
µL)
1 U/µL KAPA HiFi Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 24,7 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 0,3 µL cetakan DNA
(kromosom). Dalam kontrol negatif ditambahkan 0,3 µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing 53⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan :

1. Cetakan DNA

Konsentrasi hasil isolasi kromosom = 197,115 ng/µL

Konsentrasi target = 60 ng.

197,115 ng = 1 µL

60 ng = x µL -> x = 0,304 µL.

2. Primer Forward, Reverse, dNTPs.

Mis. Working stock dan dNTPs = 20 µM

V1 M1 = V2 M2

V1. 20 µM = 25 µL. 0,3 µM

V1 = 0,75 µM

B. Pfu

Alasan :

 High proofreading
 Baik untuk sekuens pendek <1 kb
 Digunakan untuk menghasilkan produk amplifikasi yang bersifat blunt-end.
 Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 13,21 33,025
10X Pfu buffer dgn MgSO4 5 12,5
 2mM dNTP Mix 2,5 (0,2 mM) 6,25
20 µM Primer For 0,625 (0,5 1,5625
µM)
20 µM Primer Rev 0,625(0,5 µM) 1,5625
Template DNA 500 ng -
(2,54µL)
2,5 U/ µL Pfu Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 22,46 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 2,54 µL cetakan DNA (kromosom).
Dalam kontrol negatif ditambahkan 2,54 µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing ???⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.

C. Kod-Plus-Neo

Alasan :

 High proofreading, error rate rendah

 Produk PCR tidak memiliki overhang A

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 13,985 34,9625
10X Buffer Kod Plus Neo 2,5 6,25
25mM dNTPs 2,5 (0,2 mM) 6,25
25 mM MgSO4 1,5µL 3,75
20µM Primer For 1,5µL 3,75
20µM Primer Rev 1,5µL 3,75
Template DNA 200 ng -
(1,015µL)
1 U/ µL Kod Neo Polimerase 0,5 1,25

2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 23,985 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 1,015 µL cetakan DNA
(kromosom). Dalam kontrol negatif ditambahkan 1,015 µL air PCR.
3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 94⁰C; 2 menit 1
Denaturasi 98⁰C; 10 detik 35
Annealing 53⁰C; 1 menit
Elongasi 68⁰C; 2,5 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 10 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.

Isolasi tatAdCd

Komponen PCR

1. Template DNA (hasil PCR tabung Kemungkinan polimerase yang dapat

1 dan 2 digunakan :

2. DNA polimerase 1. KAPA HIFI

3. dNTPS 2. Pfu

4. Primer ( For_Nco1_tatAd dan

Rev_Xho_tatCd)

5. Buffer/ MgCl

6. Air PCR

TM Primer forward : 62,6⁰C.

TM Primer reverse : 70,1⁰C.

Suhu Annealing digunakan : 57⁰C.

Produk hasil PCR : 1027 pb.

Konsentrasi produk hasil PCR : tatAd = x ng ; tatCd = y ng.

A. KAPA HI-FI

Alasan penggunaan KAPA :

 Terdapat dalam disertasi Kak Saad (untuk penambahan situs restriksi yaitu NcoI dan NheI
komponen polimerase yang digunakan adalah KAPA).
 High Proofreading
 Dapat memberikan fidelitas yg tinggi sehingga produk hasil PCR yang diberikan spesifik.

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 21,95 42,375
5X KAPA HiFi Buffer 5 12,5
10mM dNTP Mix 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer For 0,75 (0,3 µM) 1,875
10 µM Primer Rev 0,75 (0,3 µM) 1,875
Template DNA 10-50 ng -
1 U/µL KAPA HiFi Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet (sesuaikan) µL dari
campuran master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan (sesuaikan) µL
cetakan DNA (produk hasil PCR). Dalam kontrol negatif ditambahkan (sesuaikan) µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing 57⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan :

1. Cetakan DNA

Konsentrasi hasil PCR = x+y ng/µL

Konsentrasi target = 60 ng.

Masukkan sesuai konsentrasi hasil produk PCR

2. Primer Forward, Reverse, dNTPs.

Mis. Working stock dan dNTPs = 20 µM

V1 M1 = V2 M2

V1. 20 µM = 25 µL. 0,3 µM

V1 = 0,75 µM

B. Pfu

Alasan :

 High proofreading
 Baik untuk sekuens pendek <1 kb
 Digunakan untuk menghasilkan produk amplifikasi yang bersifat blunt-end.
 Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR 13,21 33,025
10X Pfu buffer dgn MgSO4 5 12,5
 2mM dNTP Mix 2,5 (0,2 mM) 6,25
20 µM Primer For 0,625 (0,5 1,5625
µM)
20 µM Primer Rev 0,625(0,5 µM) 1,5625
Template DNA 500 ng -
2,5 U/ µL Pfu Polymerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet 22,46 µL dari campuran
master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan 2,54 µL cetakan DNA (kromosom).
Dalam kontrol negatif ditambahkan 2,54 µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 95⁰C; 5 menit 1
Denaturasi 94⁰C; 1 menit 35
Annealing 57⁰C; 1 menit
Elongasi 72⁰C; 1 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 5 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.

Isolasi pDCSB_cer

Komponen PCR

Kemungkinan polimerase yang dapat

1. Template DNA (plasmid digunakan :
pDCSB_cer)
1. Kod-Neo-Plus
2. DNA polimerase

3. dNTPS

4. Primer (For_Xho1_pDCSBcer dan

Rev_Nco1_pDCSB)

5. Buffer/ MgCl

6. air PCR
TM Primer forward : 60,9⁰C.

TM Primer reverse : 59,2⁰C.

Suhu Annealing digunakan : 56⁰C.

Produk hasil PCR : 5163 pb.

Konsentrasi produk hasil PCR :-

A. Kod-Plus-Neo

Alasan :

 High proofreading, error rate rendah

 Produk PCR tidak memiliki overhang A

Persiapan reaksi PCR :

1. Total reaksi untuk PCR adalah 2,5 X 25 µL. (@ 25 µL untuk tes, kontrol negatif). Total volume
campuran master yang akan disiapkan adalah 62,5 µL dengan tujuan untuk meminimalkan salah
pemipetan. Tidak ditambahkan sampel pada campuran master.

Reagen Volume (µL) Volume (µL) untuk

u/ 25 µL campuran master
Air PCR Ad to 25 Ad to 62,5
10X Buffer Kod Plus Neo 2,5 6,25
25mM dNTPs 2,5 (0,2 mM) 6,25
25 mM MgSO4 1,5µL 3,75
20µM Primer For 1,5µL 3,75
20µM Primer Rev 1,5µL 3,75
Template DNA 200ng -
1 U/ µL Kod Neo Polimerase 0,5 1,25
2. 3 tabung PCR disiapkan dan diberi label untuk sampel, +, dan -. Pipet (sesuaikan) µL dari
campuran master ke setiap tabung PCR. Dalam tabung sampel ditambahkan (sesuaikan) µL cetakan
DNA (kromosom). Dalam kontrol negatif ditambahkan (sesuaikan) µL air PCR.

3. Buat Program pada thermo cycler:

Tahap Kondisi Siklus

Pre-Denaturasi 94⁰C; 2 menit 1
Denaturasi 98⁰C; 10 detik 35
Annealing 56⁰C; 1 menit
Elongasi 68⁰C; 2,5 menit
Pemanjangan Akhir 72⁰C; 10 menit 1
Penyimpanan 4⁰C ~

Perhitungan : sama dengan sebelumnya.