Pengembangan vaksin sars cov 2 di sel serangga

Protein spike  RBD, S1, Ektodomain, S2

Gen sisipan disisipkan ke dalam vektor baculovirus (shuttle) pAC ditransform ke e. coli seleksi
transforman (seleksi biru putih, keberadaan DNA sisipan), seleksi antibiotik (ampisilin), hasil
dikonfirmasi dengan analisis migrasi, restriksi dan sekuensing ko-transfeksi plasmid donor dan
bakmid ke sel SD9, seleksi di sel SF9-_> antibiotik karakterisasi
Mekanisme umum ko-transfeksi baculovirus

Transformasi plasmid donor ke e.coli yg telah mengandung bacmid, seleksi koloni, isolasi plasmid
donor dan bacmid, plasmid donor dan bacmid akan berekombinasi. Ko transfeksi ke sel serangga
(SF9/SF21) produksi dari virus stock, high titer recombinant virus stock shgg sel serangga
terinfeksi isolasi protein yang diharapkan

Donor plasmid  ada Gen sisipan yg diinginkan, diapit oleh tn7l dan tn7r yg bisa berekombinasi
dengan bacmid aseptor (ada sisi tn7) dihasilkan plasmid bacmid rekombinan.
Di e coli  ada plasmid donor  seleksi pake ampisilin, deteksi keberadaan dna sisipan  seleksi
biru putih, di situs MCS bacmid ada lacZ ambil koloni warna putih

Di e coli gabungkan DNA sisipan dengan pAC dihasilkan plasmid rekombinan seleksi,
konfirmasi kotransfeksi dengan bacmid.

Ko transfeksi:

Jadi pAC itu akan Bersatu dengan BACMID di sel SERANGGA, bukan di e.coli (ini efisiensinya
gimana??), sbnrnya bisa aja sih masukin 33nya, motong stepnya lebih banyak tinggal diliat
efisiensinya gimana. penggabungan terjadi pada urutan yg homolog (att) di kedua ujung gen sisipan.
Transfeksi pake heat shock, sel yg sudah didapatkan di cek dengan cara diisolasi kromosomnya dan
dicek dengan PCR.

Seleksi keberadaan plasmid pada sel SF9 di gen sisipan ada gen resistensi gentamisin, gentamisin
akan terbawa sampai ke sel SF9, mekanisme kerja: menghambat sintesis protein. Jadi sel yang tidak
membawa gabungan bacmid dan gen sisipan gada resistensi gentamisin-> waktu ditumbuhan
mati.

Integrasi karena pada plasmid donor atau bacmid ga ada ori yg bikin dia bisa direplikasi sebagai
plasmid di insect. Terintegrasi menggunakan urutan transposon, att akan rekombinasi homolog
dengan sel insect.

Produksi protein  strong constitutive promotor polihedrin: dia ga perlu induksi untuk proses
overproduksinya.

Yg di kotransformasi di sel e coli

Transfer plasmid/donor plasmid,Bacmid, Helper

Yg di transfeksi ke sel serangga bacmid rekombinan yg ditransfeksiin.

Mau masukin 33nya ga masalah di e coli transposase diekspresikan dari plasmid donor, tapi
resistensinya harus diliat, resistensi dari 3 plasid, yg bisa diseleksi adalah yg masuk bersama DNA
sisipan, helper plasmid ga bisa di seleksi karena tetrasiklin, gabisa seleksi sel serangga dengan
mekanisme tetrasiklin. Berarti kalau digabung di sel serangga, berarti cuma pake gentamisin
seleksinya. Kalau digabung di e coli, bisa gentamisin, tetrasiklin ,sama ampisilin. Transfeksi
efisiensinya ga sebagus transformasi.

Habis di transfeksi kan dipanen virusnya baculovirus dipakai untuk infeksi sel serangga lagi

Kalau industri ga setiap kali mau produksi melakukan kloning. Sudah dapet sel yg bawa DNA yg
kita inginkan sel yg diperbanyak, disimpe jadi bank sel. Kalau sistem baculovirus, yg disimpen bank
apa? Bank sel serangga, bank baculovirusnya. Sistem ekspresi yg dibawah ==> begitu diekspresi di sel
serangga protein.

Sel bank serangga+ sel bank baculovirus.

Kalau terintegrasi di sel terinfeksi  stable ekspresion -_> bisa disimpen sel nya aja

Tapi kalau transiens (ekspresinya sementara) dia gabisa disimpen

Lacz ga pengaruhi ekspresi gen sisipan komponen translasi start stop dan rbs, bawa promotor dan
terminator sendiri jadi ga ganggu (p dan t mengapit GOI).

Terintegrasi sel insect untuk panen baculovirusnya

T7n t7l ?? ada ga

Sel produser dimodif shgg genom baculovirusnya ada disitu.