Seleksi biru - putih

IPTG-XGal
2

Phagemid
Figure 4.11

Dapat disimpan

sebagai

Plasmid
Bakteriofag
M13

Infeksi
dengan virus
pembantu
M13KO7

f1 ori = ori dari ssDNA

bakteriofag

BAC
(Bacterial Artificial Chromosome)
BAC dibuat dari plasmid F

DNA sisipan 100 - 350 kb

Di sebelah kiri dan kanan DNA asing diberi urutan

DNA tertentu agar dapat dideteksi pada bagian mana

DNA asing telah terintegrasi di kromosom bakteri.
BAC stabil berada dalam kromosom

Tidak ada penyusunan kembali (rearrangement) DNA

asing.

Dibandingkan YAC, BAC mempunyai:

Efisiensi kloning yang jauh lebih tinggi
Fidelitas lebih baik
Penanganannya lebih mudah.

parA & parB diperlukan untuk segregasi ke sel anak

YEp (yeast episomal plasmid),

Mengandung

plasmid 2

6 kb
70-200 kopi per sel

ori dari plasmid 2.

YEp dapat ditransformasi
dengan frekuensi yang tinggi
Tidak stabil apabila sel yang
mengandung plasmid
tersebut dikultur dalam skala
besar.

YRp (yeast replicative plasmid),

Memiliki ARS (autonomously replicating

sequence) dari DNA kromosom

Transforman yang mengandung plasmid dengan
ARS kurang stabil.

YIp (yeast integrative plasmid,

plasmid integratif),
Plasmid bakteri yang ditambahkan dengan gen dari ragi.
Tidak dapat bereplikasi sendiri di dalam sitoplasma atau inti sel ragi
Terintegrasi di dalam kromosom sel inang dengan cara rekombinasi
homolog. .
Efisiensi transformasi rendah

sekali, sekitar 1-10 transforman

per mg DNA.

Dapat ditingkatkan 10 50 kali

apabila YIp yang berbentuk
lingkaran dipotong dengan
enzim restriksi di bagian gen ragi
sehingga plasmidnya berbentuk
linear.

Umumnya hanya terintegrasi di

satu tempat dalam genom sel

inang,
Produksi proteinnya rendah.
Stabil pada waktu mitosis
Tidak stabil pada waktu meiosis

Integrasi YIp berbentuk lingkaran

ke kromosom sel inang

AOX1 = gen dari kromosom bakteri

GOI = gene of interrest, gen yang

mau diklon

TT = terminator transkripsi
HIS4 = gen untuk sintesis histidin
10

Integrasi YIp berbentuk linear ke

kromosom sel inang

RE
= pemotongan enzim restriksi
AOX1 = gen dari kromosom bakteri
GOI = gene of interrest, gen yang

TT = terminator transkripsi
HIS4 = gen untuk sintesis histidin

mau diklon
11

YCp (yeast centromere plasmid)

YCp mengandung

ARS
sentromer (CEN).
Pada elemen genetik CEN
terdapat tiga daerah lestari
(daerah I, II dan III)
Diperlukan agar YCp dapat
disegregasi dengan baik ke sel
anak.
Terdapat 1 - 3 kopi plasmid/sel.
YCp dapat bersegregasi ke sel
anak baik pada mitosis maupun
pada meiosis.

12

Kromosom ragi buatan

(Yeast Artificial Chromosome, YAC).
Kromosom eukariot memiliki

Sentromer: distribusi kromosom yang betul ke kedua sel anak

Dua telomer:

Replikasi kedua ujung kromosom berjalan sempurna

Mencegah penguraian DNA oleh eksonuklease.

Asal replikasi (ARS).

YAC umumnya terdiri dari

Plasmid E.coli seperti pBR322,

Beberapa gen ragi untuk marker seleksi,
ARS
Sentromer
Telomer.

DNA sisipan harus besar (100 kb s/d > 500 kb) sebelum dapat bereplikasi di

dalam sel ragi.

YAC sangat stabil.
Kelemahan dari YAC adalah terjadinya penyusunan kembali (rearrangement)
DNA sisipan yang cukup sering.
13

YAC

14

Vektor biner (binary

vector) Agrobacterium

EcoR I (1)
Sac I (11)
Kpn I (17)
Sma I (19)
lacZ alpha
BamH I (22)
Xba I (28)
Sal I (34)
Pst I (44)
Sph I (50)
Hind III (52) T-Border (right)

Bst XI (8716)
Plasmid kecil
CaMV35S promoter
mengandung

Left border dan right

Xho I (7929)
border T-DNA

Gen sintesis
hygromycin (R)
hormon dan opin
dihilangkan

Ada gen untuk

Xho I (6835)
seleksi di tanaman
pCAMBIA1300
CaMV35S polyA
Plasmid Ti disarmed
8958 bp
T-Border
(left)

T-DNA dihilangkan
Sac II (6317)

Gen-gen yang tidak

terlibat transfer
DNA dihilangkan
kanamycin (R)

Terdapat dalam
strain
Agrobacterium
pBR322 ori

Sph I (389)

pVS1 sta

Nhe I (3392)

pVS1 rep

pBR322 bom
15

Tranformasi Tanaman Via Agrobacterium

16

Transposon
Mutasi polar

Mutasi yang mempengaruhi gen-gen di

sebelah hilir mutasi

Bila suatu plasmid dimasukkan ke dalam

bakteri yang mempunyai mutasi polar, gengen dalam plasmid juga mengalami mutasi
polar

Mutasi dapat loncat dai satu molekul DNA ke

molekul DNA yang lain Transposon
17

Transposon
Fragmen DNA yang dapat pindah-pindah tempat di

genom
Dua macam transposon
Transposon yang langsung pindah sebagai DNA
Transposon yang membuat kopi DNA dari RNAnya dan
baru pindah (retroposon)
Dapat menyebabkan penyusunan kembali DNA
Delesi, inversi, translokasi
Berperan sebagai substrat bagi rekombinasi homolog

18

Tipe transposon
Bakteri
Elemen IS
Transposon majemuk (composite)

Transposon tipe Tn3

Tn5, Tn9, Tn10

Tn3, Tn501, TnA

Fag yang dapat transposisi

Mu, D108

Ragi
Retroposon

Elemen Ty
19

Elemen IS (Insertion sequences)

Transposon paling

sederhana

0,7 1,5 kb
Gen transposase
Pengulangan terbalik

Bagian normal dari genom

bakteri

E. coli mempunyai < 10

kopi

Cara penulisan lokasi insersi dengan tanda ::

::IS1 = elemen IS1 terinsersi bakteriofag

20

Transposon
majemuk
Terdiri dari:
2 elemen IS di ujung
Gen lain di tengah
DNA apa saja yang terletak

antara 2 elemen IS dapat

dipindahkan
Jarak antara elemen IS

makin jauh frekuensi

transposisi menurun
21

TnA
TnpA = transposase
Terikat IR
TnpR = resolvase
Rekombinasi sisi spesifik
pada ko-integrat pada res
(resolusi)
Terikat sisi I, II & III
Represor tnpA & tnpR
res pada sisi I
22

Transposisi bakteriofag Mu
Infeksi sel: Mu integrasi ke kromosom dengan

cara transposisi non-replikatif

Mu bereplikasi dengan cara transposisi replikatif
Transposase MuA

Sisi pengikatan MuA pada ujung DNA

Urutan konsensus 22 pb
L1, L2 & L3
R1, R2 & R3

Sisi aktif memotong DNA yang tidak

diikatnya

MuB

Menentukan target DNA

jarak antar target > 10 15 Kb

23

Rekombinasi akibat transposon

24

Proses transposisi

25

cointegrate

Transposisi
Tn3

resolvase
26

Tn10 : transposisi nonreplikatif

(transposisi konservatif)

27

Regulasi transposisi
Tn10
Ada 2 promoter

Pin = promoter lemah

Transkripsi transposase

Pout = promoter kuat

Antisense RNA

Multicopy inhibition

Transposisi dihambat bila

jumlah kopi elemen IS10R
ada banyak
Transposase
Cis preference
Transposisi terjadi waktu
replikasi DNA

28

Transkripsi dan
translasi Ty
Ty (transposon yeast) 6,3

kb
TyA = DNA binding
protein
TyB RT, protease,
integrase
kiri dan kanan

urutannya sama
kiri promoter aktif
kanan terminator aktif

Pergeseran kerangka

baca

Stop kodon tidak

ditemukan

29

Transposisi melalui
RNA
Ty termutasi di dalam

plasmid
kanan: substitusi basa
TyAB diberi promoter
GAL & intron
Sel ragi ditransformasi
Induksi transposisi
dengan galaktosa
Hasil transposisi
Tidak ada intron
Kedua = termutasi

VLP (virus-like particle)

muncul bila transposisi Ty
diinduksi

30

31

Transposon mutagenesis
Transposon pindah ke tengah-tengah suatu gen

Gen termutasi & menjadi tidak aktif

Tempat insersi transposon terjadi secara acak

Seleksi klon dengan gen yang inaktif (mis. mutan auksotrof)

Tumbuhkan semua klon

Ambil masing-masing klon dengan tusuk gigi, gesek ke dua
macam medium

Medium lengkap
Medium minimal

Koloni yang dicari tumbuh dalam medium lengkap, tetapi tidak

tumbuh dalam medium minimal
Bila di tengahnya ada gen resisten antibiotik, dapat dipilih bakteri
yang tumbuh dalam medium yang mengandung antibiotik
Gunakan transposon yang mengandung gen resistensi antibiotik
Tn5 : gen resistensi kanamisin & neomisin
Tn10: gen resistensi tetrasiklin

32

33