Optimalisasi vaksin konjugat metamfetamin untuk produksi

antibodi pada tikus

ABSTRAK
Masih ada obat yang tidak disetujui untuk mengobati pasien yang menyalahgunakan
metamfetamin. Vaksin aktif untuk mengobati penyalahgunaan nikotin dan kokain sedang dalam
studi klinis, tetapi belum terbukti efektif karena produksi antibodi anti-obat yang tidak memadai.
Studi saat ini bertujuan untuk mengoptimalkan komposisi, bahan pembantu, dan rute pemberian
vaksin konjugat metamfetamin, ICKLH-SMO9, pada tikus dengan tujuan menghasilkan tingkat
antibodi yang secara signifikan lebih tinggi. Berbagai jenis kepadatan epitop dibandingkan,
seperti adjuvan Alhydrogel dan agonis reseptor 4 baru (TLR4) yang seperti Toll yang disebut
GLA-SE. Walaupun kepadatan metamfetamin tidak mempengaruhi dengan kuat respon antibodi,
adjuvan itu sangat mempengaruhi. Glucopyranosyl lipid A dalam emulsi minyak dalam air yang
stabil (GLA-SE) menghasilkan tingkat antibodi yang jauh lebih tinggi dalam menanggapi
imunisasi dibandingkan dengan Alhydrogel; imunisasi dengan GLA-SE juga menghasilkan
antibodi dengan afinitas yang lebih tinggi untuk metamfetamin. GLA-SE telah digunakan dalam
studi manusia pada vaksin untuk influenza antara lain dan seperti beberapa agonis TLR4 klinis
lainnya, itu aman dan memunculkan respon imun yang kuat. Vaksin adjuvant GLA-SE biasanya
diberikan dengan injeksi intramuskuler dan ini juga terbukti efektif dalam studi tikus ini. Studi
klinis dari vaksin metamfetamin ICKLH-SMO9 yang diadaptasi dengan GLA-SE memiliki potensi
untuk menunjukkan kemanjuran dengan menghasilkan tingkat antibodi yang jauh lebih tinggi
daripada vaksin-penyalahgunaan-zat yang tidak berhasil menggunakan bahan pembantu berbasis
aluminium.

MATERI & METODE

2.1 Obat-obatan dan Reagen
(+) - Metamfetamin hidroklorida (METH) dan bentuk TRIT yang dinamai METH ([3H]
-METH) diperoleh dari Program Pasokan Obat NIDA. Alhydrogel berasal dari Brenntag
Biosector (Frederikssund, Denmark), Sigma Adjuvant System® (SAS) dari Sigma Aldrich (St.
Louis, MO), dan pembantu GLA-SE berasal dari Immune Design Corp. (Seattle, WA). Sulfo-
SMCC (Sulfosuccinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) crosslinker dan
TCEPHCl (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) dibeli dari Thermo Fisher Scientific
Inc. (Pierce, Rockford, IL). Immunocyanin, dua monomer murni dari keyhole limpet
hemocyanin (KLH) yang disebut ICKLH, diperoleh dari Biosyn Corp. (Carlsbad, CA).
2.2 Produksi Vaksin
Semua vaksin dibuat dengan mengkonjugasikan hapten mirip-METH (SMO9) ke
immunocyanin untuk membuat vaksin konjugasi METH yang disebut ICKLH-SMO9. Prosedurnya
mirip dengan metode Peterson et al. Singkatnya, ICKLH diaktifkan dengan penambahan
crosslinker Sulfo-SMCC, kemudian dihapus untuk menghapus tautan yang tidak digunakan.
Secara terpisah, dimer hapten mirip METH direduksi menjadi monomer menggunakan TCEP-
HCl. Hapten yang telah dikurangi lalu ditambahkan ke IC KLH yang telah teraktivasi dan diaduk
selama 2 jam untuk memungkinkan konjugasi terjadi. Akhirnya, bahan terkonjugasi dicampur
dengan sistein direduksi berlebih untuk membatasi setiap situs aktivasi yang tersisa. Semua
reaksi dilakukan dengan overlay gas Argon. Produk akhir didialisis menjadi 50 mM natrium
fosfat, pH 7,3 dengan 5% laktosa.
Konjugasi terpisah menghasilkan tiga lot vaksin dengan kepadatan hapten 13, 16, dan 23
molekul SMO9 per monomer KLH sebagaimana diukur dengan metode yang dilaporkan dalam
Peterson et al. Ini masing-masingnya diberi label ICKLH-SMO913, ICKLH-SMO916, dan ICKLH-
SMO923.
2.3 Protokol Imunisasi dan Pengambilan Sampel
Tikus Balb / c betina dibeli dari Laboratorium Charles River dan diimunisasi dengan
injeksi subkutan (SC) atau intramuskuler (IM) dengan 20 μg IC KLH-SMO9 di salah satu dari tiga
bahan pembantu seperti dijelaskan dalam setiap percobaan (Tabel 1). Suntikan booster diberikan
pada 3 dan 9 minggu dengan suntikan tambahan diberikan pada minggu 15 untuk kelompok 1-4.
Semua boosts adalah ulangan dari imunisasi asli. Delapan (8) hewan ditentukan untuk masing-
masing kelompok; seekor tikus dalam kelompok 3 dikorbankan pada minggu ke-23 karena sakit.
Sampel darah diambil dengan cara ekornya dipotong dan dibekukan selama 1 jam pada
suhu kamar; darah dari ekor dikumpulkan pada saat terminasi. Setelah sentrifugasi pada 14.000 ×
g selama 10 menit, serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -30°C hingga nanti dicairkan
untuk analisis. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan Panduan NIH untuk Perawatan
dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan
Institusional Universitas Arkansas untuk Ilmu Kedokteran.
2.4 Karakterisasi Respon Antibodi
2.4.1 ELISA Titer Terinterpolasi
Konsentrasi relatif antibodi poliklonal anti-METH dalam sampel serum ditentukan oleh
titer ELISA yang diinterpolasi menggunakan campuran 6 antibodi monoklonal anti-METH yang
diproduksi di rumah sebagai standar. Pertama, 96-sumuran lempeng dilapisi dengan 0,25 μg/mL
ovalbumin yang diikat dengan hapten seperti-METH. Kedua, lempengan diblokir dengan
SuperBlock (Pierce Biotechnology, Inc.). Ketiga, sampel serum tikus, kurva standar, kontrol
kualitas, dan sampel kosong ditambahkan ke sumur masing-masing lempeng dalam rangkap dua.
Keempat, reagen deteksi, antibodi anti-tikus (khusus-Fc) yang dilabeli dengan alkaline
phosphatase, ditambahkan sebanyak 1 μg/mL. Setiap langkah setelah pelapisan diinkubasi pada
suhu kamar selama 1 jam dengan mengguncang pengocok lempengan. Antara langkah 2 sampai
4, pelat dicuci dengan fosfat buffer saline yang mengandung 0,1% Tween 20 (buffer cuci) untuk
menghilangkan bahan yang tidak terikat. Akhirnya, larutan substrat kromogenik ditambahkan ke
sumur, plat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit dan kemudian dibaca dengan pembaca
plat.
Setiap sampel uji diencerkan 1: 4000 dalam 50% SuperBlock dalam buffer cuci dan
dengan serum tikus naif ditambahkan sehingga konsentrasi akhir adalah 1%. Kurva standar,
sampel kontrol kualitas, dan blanko disiapkan dalam buffer yang sama dengan serum 1%.
Kriteria penerimaan dan ketepatan diterima untuk semua data yang dilaporkan. Konsentrasi yang
dilaporkan relatif terhadap kurva standar spesifik yang digunakan dan hanya boleh digunakan
untuk perbandingan di sini.
2.4.2 Dialisis Keseimbangan untuk Mengukur Ikatan Antibodi Terhadap METH
Seperti yang dijelaskan dalam Rüedi-Bettschen et al., sampel serum dari masing-masing
tikus diencerkan 1:100 dalam buffer dan dicampur dengan 3H-METH (akhir 5 nM) sebelum
ditambahkan ke satu ruang insert dalam perangkat dialisis kesetimbangan cepat (Pierce ,
ThermoScientific, Rockville, IL). Buffer hanya ditambahkan ke ruang lain dan seluruh plat
diinkubasi semalam pada suhu 4°C untuk menyeimbangkan. METH berlabel di setiap ruang
diukur untuk menentukan jumlah 3H-METH yang terikat oleh serum uji.
2.4.3 Radioimmunoassay untuk Menentukan Konstanta Disosiasi
Radioimmunoassay berbasis manik yang diterbitkan digunakan untuk menentukan nilai
Kd yang mengikat METH untuk sampel serum pada titik waktu tertentu.
2.4.4 Analisis Statistik
Konsentrasi antibodi dan persentase nilai pengikatan 3H-METH (pengenceran 1:100)
dibandingkan dengan analisis varians pengukuran berulang dua arah (hari × kelompok
perlakuan), diikuti oleh Bonferroni Multiple Comparison test (Gambar 1–3 dan 5). Afinitas rata-
rata antibodi yang dihasilkan dalam kelompok 4 dan 6 pada minggu ke 11 ditemukan
terdistribusi secara normal dengan uji Shapiro-Wilk dan karenanya dibandingkan dengan uji-t
yang tidak berpasangan (Gambar 4). Analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak
GraphPad Prism versi 6.0 (La Jolla, CA). Perbedaan dianggap signifikan secara statistik pada p <
0,05.

HASIL
Dua percobaan dilakukan dengan tujuan mengoptimalkan vaksin konjugat METH, IC KLH-
SMO9. Vaksin yang dioptimalkan pertama memiliki kepadatan hapten sementara yang kedua
berfokus pada bahan pembantu. Desain eksperimental dirangkum dalam Tabel 1. Grup 1-4
diselesaikan sebelum inisiasi kelompok 5-7. Hewan untuk sesi studi 1 dibeli dalam batch
pertama; hewan untuk sesi 2 dibeli dalam batch kedua.
3.1 Perbandingan Kepadatan Hapten
Studi pertama vaksin dibandingkan dengan kepadatan hapten yang berbeda (kelompok 1-
3); semua diberikan dengan SAS sebagai adjuvan yang diberikan oleh injeksi SC. Seperti GLA-
SE, SAS adalah agonis TLR4 yang mengandung monophosphoryl lipid A dalam emulsi minyak-
dalam-air yang stabil. Namun, tidak seperti GLA-SE, yang merupakan senyawa sintetis tahap
klinis, SAS diisolasi dari Salmonella Minnesota dan hanya disetujui untuk penggunaan hewan.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam
konsentrasi antibodi yang ditimbulkan atau kapasitas pengikatan METH di antara kelompok,
tetapi konsentrasi antibodi rata-rata terbesar ditimbulkan oleh MCV kepadatan hapten tertinggi,
ICKLH-SMO923, dengan 23 haptens per molekul KLH (panel atas, grup 3).
Gambar 1. Rata-rata konsentrasi antibodi relatif (panel atas) dan fungsi (% 3H-METH terikat,
panel bawah) + atau −SD dari waktu ke waktu dari MCV dengan kepadatan hapten yang berbeda
dan SAS sebagai bahan pembantu. Panah menunjukkan waktu imunisasi berulang. Poin data
sedikit diimbangi dan bilah kesalahan adalah campuran dari plus dan minus rata-rata untuk
kejelasan visual, tetapi sampel diambil pada tanggal yang sama. Analisis varians pengukuran
berulang dua arah (kelompok × hari perawatan), diikuti oleh Bonferroni Multiple Comparison
digunakan untuk perbandingan statistik; tidak ada perbedaan yang dicatat.
Gambar 2. Rata-rata konsentrasi antibodi relatif (panel atas) dan fungsi (panel bawah) + atau −
SD dari waktu ke waktu ditimbulkan oleh adjuvan yang berbeda. Semua kelompok diimunisasi
dengan MCV dengan 23 haptens per molekul KLH, diberikan dengan adjuvant yang diberi label.
Panah hitam menunjukkan peningkatan untuk semua grup. Poin data sedikit diimbangi untuk
grup 1 μg GLA-SE untuk kejelasan visual. Analisis varians pengukuran berulang dua arah
(kelompok × hari perawatan), diikuti oleh Bonferroni Multiple Comparison digunakan untuk
perbandingan statistik; * p < 0,05 untuk 5 μg GLA-SE vs SAS, ** p < 0,05 untuk 1 μg GLA-SE
vs SAS.
Gambar 3. Fungsi ikatan METH rata-rata dari waktu ke waktu oleh adjuvan klinis. Kedua
kelompok diimunisasi dengan MCV dengan 23 haptens per molekul KLH, diberikan dengan
adjuvant yang diberi label. Panah solid menunjukkan peningkatan (boost) untuk kedua grup
dengan panah putus-putus hanya untuk grup Alhydrogel. Analisis varians pengukuran berulang
dua arah (kelompok × hari perawatan), diikuti oleh Bonferroni Multiple Comparison digunakan
untuk perbandingan statistik; * p < 0,05.
Gambar 4. Afinitas antibodi rata-rata pada minggu ke 11. Afinitas yang diukur untuk METH
dalam sampel serum dari minggu ke 11 digambarkan dari masing-masing tikus dengan rata-rata
dan batang SD yang ditunjukkan. T-test tidak berpasangan digunakan untuk perbandingan
statistik; * p <0,05.
Baik konsentrasi antibodi dan fungsi ikatan METH meningkat pada semua kelompok
setelah peningkatan (boost) kedua pada 9 minggu, tetapi tidak ada peningkatan lebih lanjut yang
diamati setelah peningkatan (boost) ke-3 pada 15 minggu (Gbr. 1). Bahkan, sedikit penurunan
konsentrasi antibodi, tetapi tidak berfungsi, terlihat pada minggu ke 33. Ini dihipotesiskan
sebagai hasil dari pematangan afinitas di mana antibodi afinitas rendah berhenti diproduksi,
menghasilkan konsentrasi antibodi total yang lebih rendah. Tetapi, karena antibodi afinitas yang
lebih tinggi masih ada, fungsi ikatan METH dipertahankan. Hewan dalam kelompok 4 juga
diimunisasi dengan injeksi SC dengan ICKLH-SMO923, tetapi diberikan dengan Alhydrogel
untuk menunjukkan konsentrasi antibodi yang lebih tinggi yang dihasilkan oleh adjuvan agonis
TLR4. Setelah peningkatan pertama pada 3 minggu, konsentrasi antibodi yang diinduksi
Alhydrogel mendekati hasil SAS (~ 100 μg / mL), tetapi peningkatan selanjutnya tidak
menghasilkan peningkatan yang signifikan dan tingkat antibodi relatif tetap stabil di bawah 200
μg / mL melalui minggu 33 (data tidak ditampilkan). Pada semua titik waktu, kapasitas ikatan
METH serum dari hewan yang diimunisasi Alhydrogel lebih rendah dari pada hewan yang
diimunisasi SAS.
3.2 Peningkatan Respons dari Adjuvan yang Lebih Baik
Menggunakan ICKLH-SMO923, tiga kelompok tikus (kelompok 5-7) diimunisasi dalam
penelitian kedua menggunakan adjuvan yang berbeda: SAS dan GLA-SE pada dua konsentrasi, 1
atau 5 μg. Immune Design Corp. merekomendasikan agar adjuvan GLA-SE diberikan dengan
injeksi intramuskuler, oleh karena itu imunisasi komparator dengan SAS juga diberikan dengan
injeksi IM.
Konsentrasi antibodi rata-rata pada setiap titik waktu digambarkan pada Gambar. 2 (panel
atas). Jumlah antibodi tertinggi dihasilkan dari bahan pembantu GLA-SE, dengan 5 μg GLA-SE
agak lebih produktif daripada 1 μg GLA-SE. Baik GLA-SE dan SAS menunjukkan efek
peningkatan yang pasti dalam serum pada 5 dan 11 minggu setelah imunisasi di minggu 3 dan 9.
Selain itu, imunisasi yang diberikan pada minggu ke 37 terhadap kelompok 5 μg GLA-SE
menghasilkan peningkatan konsentrasi antibodi yang rendah dua minggu kemudian (data tidak
ditunjukkan).
Fungsi ikatan METH rata-rata dari respons imun umumnya mengikuti bentuk grafik
konsentrasi-waktu (Gbr. 2, panel bawah), namun, korelasi antara konsentrasi antibodi hewan
individu dan hasil fungsi adalah yang terbaik (~ 50%) pada titik waktu segera setelah
peningkatan (boost) (minggu 5 dan 11). Kemudian, hasilnya kurang berkorelasi, sekali lagi
menunjukkan bahwa sebagai pematangan afinitas terjadi secara berbeda pada setiap hewan, lebih
sedikit antibodi mungkin diperlukan untuk mempertahankan fungsi. Misalnya, pada minggu ke
33, konsentrasi antibodi rata-rata hampir sama dengan minggu ke 5, tetapi kapasitas pengikatan
METH tetap lebih tinggi di titik waktu kemudian.
Perbandingan tambahan dibuat antara dua adjuvan klinis, Alhydrogel dan GLA-SE.
Selain jumlah antibodi yang dibuat menjadi jauh lebih besar dengan vaksinasi adjuvan GLA-SE
(data tidak ditunjukkan), kapasitas untuk mengikat METH secara signifikan lebih besar di semua
titik yang diukur setelah peningkatan (boost) pertama (Gbr. 3). Bahkan peningkatan (boost)
ketiga pada minggu ke 15 untuk kelompok Alhydrogel tidak mempengaruhi hasil.
3.3 Afinitas Respon Antibodi oleh Adjuvant
Poin waktu yang dipilih dari kelompok 6 yang menerima vaksin ICKLH-SMO923 dengan 5
μg GLA-SE, dari kelompok 3 yang mendapat vaksin IC KLH-SMO923 dengan SAS, dan dari
kelompok 4 yang mendapat vaksin ICKLH-SMO923 dengan Alyhydrogel dianalisis dengan
radioimmunoassay untuk mengamati pematangan afinitas dari waktu ke waktu. Ketika campuran
IgG dianalisis dengan metode ini, KD (konstanta disosiasi untuk ikatan METH) dari antibodi
dengan afinitas tertinggi (nilai KD terendah) diamati. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2,
rata-rata afinitas yang diukur dari kelompok 5 μg GLA-SE meningkat setelah dua peningkatan
(boost) pertama pada minggu 3 dan 9. Pada minggu ke 11, afinitas tampaknya telah matang ke
tingkat yang stabil.
Pada minggu ke 11 variabilitas antar hewan jauh lebih besar ketika Alhydrogel
digunakan. Gambar. 4 menunjukkan hasil afinitas dari minggu 11 membandingkan respon dari
hewan yang menerima vaksin pembantu dengan Alhydrogel secara subkutan (kelompok 4)
versus 5 μg GLA-SE secara intramuskuler (kelompok 6). Kedua adjuvan yang digunakan secara
klinis menghasilkan antibodi dengan afinitas yang berbeda secara signifikan untuk METH,
dengan GLA-SE menghasilkan afinitas yang lebih tinggi dan respons antibodi yang lebih dapat
direproduksi.
3.4 Rute Pemberian Memengaruhi Tingkat Respon Awal
Dari data yang dikumpulkan ini, perbandingan dibuat dari efek rute pemberian pada imunisasi
dengan ICKLH-SMO923 dan SAS sebagai adjuvan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5,
suntikan intramuskular (IM) (kelompok 7) memperoleh konsentrasi antibodi rata-rata yang lebih
tinggi setelah peningkatan (boost) awal dan kedua (minggu 3 dan 9) dibandingkan dengan injeksi
subkutan (SC) (kelompok 3). Protokol imunisasi berbeda setelah 11 minggu, jadi tidak ada
perbandingan lebih lanjut dibuat.
DISKUSI
Studi optimasi vaksin yang disajikan di sini dilakukan pada tikus untuk memilih calon
vaksin, adjuvan, dan rute pemberian untuk pengujian lebih lanjut. Seperti yang ditunjukkan oleh
perbandingan vaksin dengan kepadatan yang berbeda, kisaran kepadatan diuji antara
13 dan 23 haptens per monomer KLH tidak menunjukkan perbedaan dramatis, menunjukkan
bahwa kumpulan vaksin yang dibuat dalam kisaran ini mungkin sama efektifnya.
Adjuvan agonis TLR4, SAS dan GLA-SE, dihasilkan respons antibodi yang jauh lebih
kuat daripada Alhidrogel yang biasa digunakan sebagai adjuvant. Perbandingan antara vaksin
adjuvant SAS dan Alhydrogel diberikan oleh injeksi SC menunjukkan peningkatan sekitar 50%
sebagai tanggapan dari SAS atas Alhydrogel. Ketika SAS dibandingkan dengan GLA-SE dengan
vaksin yang diberikan dengan injeksi IM, GLA-SE diproduksi sekitar dua kali jumlah antibodi
oleh SAS. Tingkat antibodi yang tinggi ini bertahan tanpa meningkatkan untuk waktu yang lama
waktu, tersisa di atas 600 μg / mL dari minggu 11 sampai akhir periode yang diukur pada
minggu ke 33 (Gbr. 2). Padahal tidak bisa dibandingkan karena perbedaan dalam metode
kuantitasi, SAS disesuaikanVaksin METH diuji oleh Moreno et al. konsentrasi antibodi yang
dihasilkan 150-220 μg / mL [1]. Selanjutnya, vaksin nikotin yang kemudian masuk uji klinis
menghasilkan b200 μg / mL pada tikus ketika diberikan ajuvan Freund sangat kuat yang tidak
diizinkan dalam studi manusia. Bersama-sama, data ini sangat menyarankan agar GLA-SE
disesuaikan ICKLH-SMO9 harus merangsang tingkat antibodi anti-METH yang lebih tinggi
subyek manusia dari Alhydrogel. Jika kadar antibodi memang merupakan faktor penting untuk
kemanjuran vaksin, diukur dengan kapasitas untuk mengurangi tingkat kambuh untuk
penggunaan narkoba, kombinasi ICKLH-SMO9 dengan GLA-SE mungkin lebih sukses.
Perbandingan antara bahan adjuvant menunjukkan perbedaan dalam tingkat antibodi
yang diproduksi, afinitas antibodi yang dihasilkan tidak terpengaruh. Dihipotesiskan bahwa
kombinasi hapten-carrier dan jadwal imunisasi memiliki efek terbesar pada afinitas sedangkan
ajuvan memiliki pengaruh terbesar pada konsentrasi; data ini mendukung kesimpulan itu.
Dalam persiapan untuk studi yang diatur oleh FDA, rencana telah dibuat produksi
toksikologi dan batch klinis MCV dalam skala yang lebih besar. Temuan rentang dosis dan
toksikologi yang sesuai dengan Praktek Laboratorium Baik studi akan dilakukan sebelum studi
keselamatan Fase 1 pada sukarelawan sehat. Karena sekarang telah dioptimalkan komposisi
kimia MCC dan memilih bahan pembantu yang unggul, produk ini memiliki potensi besar untuk
menghasilkan dalam vaksin manusia yang aman yang cocok untuk mengurangi efek buruk
METH sambil membantu pasien menahan tantangan binges (sindrom penyimpangan perilaku
makan) dan kambuh, yang dapat menyebabkan residivisme selama program perawatan.