Pemilihan Teknik isolasi

Teknik isolasi bakteri yang digunakan adalah teknik cawan sebar dan teknik cawan gores (streak
plate). Hal ini bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campuran. Metode cawan gores
memiliki keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Prinsip teknik isolasi pada agar cawan
adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan
dari organisme lainnya (Putri, dkk., 2017).

Selain itu, untuk isolasi Enterobacter dapat menggunakan teknik stab plate (cara tusukan) dengan
menggunakan medium gelatin. Uji gelatin ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang memiliki
enzim gelatinase yang mampu menghidrolisis gelatin. Untuk hasil positif pada uji ini ditandai dengan
adanya pencairan gelatin. Enterobacter cloacae merupakan bakteri yang dapat mencairkan gelatin
dan membutuhkan waktu inkubasi hingga 1 minggu atau lebih (Barrow dan Feltham, 2003).

Prosedur isolasi

Isolasi bakteri tanah dilakukan dengan metode enrichment untuk mensuplai nutrisi bakteri dan
spread plate. Sebanyak 10 g sampel tanah dimasukkan ke dalam 90 ml medium nutrient broth (NB),
lalu diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C. Setelah itu dilakukan pengenceran menggunakan NaCl
fisiologis 0,8% hingga 10-12. Masing-masing pengenceran diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada
medium nutrient agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Koloni bakteri yang
tumbuh terpisah lalu dimurnikan dengan metode gores pada medium nutrient agar (Lambui dan
Jannah, 2017). Setelah itu, masing-masing isolat diambil menggunakan ose steril lalu digoreskan di
permukaan media MacConkey Agar (MCA), Triple Sugar Ion Agar (TSIA) . Media yang telah digores
tersebut selanjutnya diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37°C selama 24 sampai 48 jam.

Identifikasi bakteri

1. Identifikasi berdasarkan bentuk koloni dan sel ( mikroskopis)

a. Identifikasi mikroskopis
Prosedur untuk karakterisasi mikroskopis dilakukan dengan mengambil isolat bakteri
menggunakan jarum ose dan diletakkan ke atas permukaan gelas objek yang telah ditetesi
aquadest. Lalu, ditetesi dengan crystal violet dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci
dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu, apusan ditetesi dengan larutan iodin dan
didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan alir mengalir dan dikeringkan. Kemudian,
apusan ditetesi dengan alkohol aseton dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci kembali
dengan alir mengalir dan dikeringkan. Apusan yang telah kering ditetesi dengan pewarna
safranin selama 30 detik lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah kering,
apusan diamati di bawah mikroskop ddengan perbesaran yang terkecil hingga perbesaran
terbesar, sampai didapatkan gambar yang jelas (Yulvizar, 2013).
Hasil pewarnaan gram untuk enterobacter adalah bewarna merah yang menunjukkan sifat
gram negatif dan memiliki sel berbentuk batang (Sunatmo, 2009).
2. Identifikasi pada medium indikator
a. Medium MacConkey
Medium Mac Conkey merupakan media khusus untuk menumbuhkan kelompok bakteri gram
negatif berbentuk batang, baik yang dapat memfermentasikan laktosa maupun yang tidak.
Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosan akan berwarna merah muda karena adnaya
 neutral red (indikator pH) yang akan berwarna merah jika pH di bawah 6,8 (Prescott, et
al.,2002). Hasil untuk bakteri spesies Enterobacteriaceae seperti Enterobacter, Klebsiella
pneumoniae, Shigella sp. dan Pseudomonas aeruginosa adalah positif yaitu berwarna merah
muda (Markey, et al., 2013).
b. Medium Triple Sugar Ion Agar
Pada medium TSIA ini dapat membedakan jenis bakteri berdasarkan kemampuan memecah
glukosa, laktosa dan sukrosa. Selain itu, pada medium TSIA ini dapat mengetahui apakah
bakteri menghasilkan gas H2S atau tidak (Holt, et al., 2000). Hasil untuk bakteri Enterobacter
adalah warna kuning dan tidak diproduksi gas H 2S (Markey, et al., 2013).
3. Identifikasi berdasarkan uji biokimia
a. Uji Motil Indol Ornithin (MIO)
Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut motil atau tidak dengan
menggunakan media MIO (Motility Indole Ornithin) (Holt, et al., 2000). Hasil untuk bakteri
Enterobacter adalah bakteri ini bersifat motil (Markey, et al., 2013).
b. Uji Methyl red dan Voges Proskauer
Media uji MR-VP mengandung glukosa sebagai bahan uji kemampuan bakteri dalam
mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol. Bakteri yang mampu mengubah
glukosa menjadi asam organik dan alkohol akan mengubah media menjadi merah setelah
ditambahreagen methyl red, jika tidak maka media akan tetap berwarna kuning. Pada uji
voges proskauer, jika bakteri mampu mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol,
maka setelah ditambahkan dengan alfa naftol dan KOH 40% akan mengubah media menjadi
merah (Holt, et al., 2000). Hasil untuk bakteri Enterobacter pada uji methyl red adalah negatif
dan media tetap berwarna kuning sedangkan untuk uji voges proskauer adalah positif dan
mendia berubah menjadi warna merah (Barrow dan Feltham, 2003).
c. Uji gelatin
Hasil untuk bakteri Enterobacter adalah positif dan dapat menghidrolisis gelatin (Barrow dan
Feltham, 2003).

Putri, M. H., Sukini. dan Yodong. 2017. Mikrobiologi. Jakarta: Kemenkes RI.

Barrow, G. I. Dan Feltham, R. K. A. 2003. Cowan And Steel’s Manual for the identification of medical
bacteria. Cambridge: Cambridge University Press.

Yulvizar. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp. Jurnal Bioproses. Vol
6(2): 1-7.

Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. 2000. Bergey’s Manual Of
Determinative Bacteriology 9th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Walkins.

Sunatmo, T. I. 2009.Mikrobiologi Esensial. Jakarta: Ardy Agency.

Prescott, L. M., Harley, J. P., and Klein, D. A. 2002. Microbiology Fifth Edition. New York: The
McGraw-Hill.

Markey, B., Leonard, F., Marie, A., Cullinane, A., Maguire, D. 2013. Clinical Veterinary Microbiology
Second Edition. London: Elsevier.