LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

Oleh :
Nama : Bramassetyo Aji
NIM : B1A017051
Rombongan :I
Kelompok :1
Asisten : A. Dimas Cahyaning Furqon

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2019
 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

A. Tujuan

Membekali mahasiswa dengan meningkatkan pemahaman terhadap

proses Polymerase Chain Reaction (PCR).

B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel DNA

Holothuria atra, gel agarosa, akuades, loading dye, dan larutan buffer TBE.
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikropipet, tip,
parafilm waterbath, vortex, sentrifugator, microtube, alat PCR (Polymerase
Chain Reaction), dan seperangkat alat elektroforesis (power supply, UV
illuminator, sisiran (comb), wadah (chamber), dan cetakan gel).

C. Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan dalam praktikum ini adalah:

1. Pemrograman PCR
a. Pra-denaturasi dilakukan selama 3 menit pada suhu 95° C.
b. Dilakukan siklus 35 kali ( Denaturasi dilakukan selama 15 detik pada suhu
95° C, Annealing dilakukan selama 15 detik pada suhu 31° C, Ekstensi
dilakukan selama 10 detik pada suhu 72° C).
c. Final ekstensi dilakukan selam 5 menit pada suhu 72° C.
d. Penyimpanan dilakukan selama 1 jam pada suhu 8° C.
2. Running Elektroforesis
a. Dilakukan running pada seperangkat alat elektroforesis pada voltase 50V,
kuat arus 250 mA, selama 30 menit.
b. Dilakukan visualisasi pada UV illuminator.
D. Hasil dan Pembahasan

a
3.

b 3.

1—2—3—4—5—6-- 7

Gambar 3.1 Visualisasi DNA Holothuria atra

Keterangan : (a) sumuran, (b) pita DNA dan (c) gel agarosa.
1. Sampel 1
2. Sampel 2
3. Sampel 3 1.
4. Sampel 4
5. Sampel 5
6. Sampel kontrol positif
7. Sampel kontrol negatif

Berdasarkan gambar di atas menunjukkan bahwa DNA yang terlihat

dari 7 sampel yang diuji memperlihatkan pita DNA pada gel agarose. Selain
itu, pada sampel nomor 1, 4, 5 dan 6 tampak adanya smear pada bagian
bawah pita DNA. Smear yang muncul pada gel agarose menandakan adanya
materi selain DNA yang ikut terisolasi, sehingga memunculkan smear di
bawah pita DNA (Anam, 2010). Sampel 2, 3 dan 7 menunjukkan visualisasi
clear. Hal, Ini sesuai dengan hasil yang didapatkan pada uji kualitatif dengan
menggunakan spektrofotometer dimana DNA yang dihasilkan tergolong
murni. Selain itu adanya pita DNA yang muncul juga memperlihatkan
ketebalan pita DNA yang beragam. Sebagian besar sampel menunjukkan pita
DNA yang tebal dan tampak jelas, dan ada beberapa sampel yang terlihat
sangat tipis. Hal ini, berkaitan dengan hasil uji kuantitas DNA yang
menunjukkan nilai kemurnian masing – masing sampel yang beragam.
Menurut Triana et al (2010) kemurnian DNA dan keutuhannya sangat
berpengaruh terhadap keberhasilan amplifikasi PCR. Apabila DNA cetakan
tidak murni (banyak kontaminan), akan mengganggu penempelan primer
pada situsnya dan akan menghambat aktivitas enzim polymerase DNA.
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
DNA templat, sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang
mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida
DNA templat, dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR,
magnesium klorida (MgCl2), dan enzim polimerase DNA. DNA templet
yaitu mempunyai fungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA
baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA
plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut
mengandung fragmen DNA target yang dituju. Primer berfungsi sebagai
pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk
proses eksistensi DNA. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) merupakan
suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP
(deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP
(deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP
akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai
baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal
dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan (Campbell, 2000).
Buffer PCR berfungsi untuk menjamin pH medium. Selain buffer
PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari MgCl2.
MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas
DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi
primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP
(senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada
spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung
senyawa MgCl2yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl 2
dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi
konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan. Enzim Polimerase DNA berfungsi
sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini
diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang
digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau
 hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai
temperatur 95o C. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari
bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10 kali lebih kuat
dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri
Thermus aquaticus) (Muladno, 2002).

Master mix PCR dapat digunakan untuk pengkodean amplifikasi dan

penghapusan uracil-DNA glycosylase (UDG). Master mix PCR juga akan
memudahkan dalam visualisasi DNA karena mempermudah alat dalam mendeteksi
sinyal flouresen. Master mix PCR tidak berlaku pada reaksi eksonuklease 5’-
3’(Chua et al., 2016). Pra amplifikasi melibatkan peningkatan sinyal positif secara
acak pada saan menggunakan DNA polimerase. Master mix PCR TaqMan
Genotyping secara konsisten mendeteksi sejumlah kecil sinyal positif palsu dalam
kontrol gDNA. Taq polimerase selama langkah pra amplifikasi kemungkinan
merupakan sumber dari alel mutan dari DNA uji. Langkah pra amplifikasi dapat
menghambat pembacaan dPCR (Jackson et al., 2016).
DAFTAR REFERENSI

Anam, K., 2010. Isolasi DNA genom.Bioteknologi. Bogor: Sekolah Pascasarjana

Institut Pertanian Bogor.
Campbell, N. A., Jane, B. R. & Lawrence, G. M., 2000. Biologi Jiid 1 Edisi Kelima.
Jakarta: Erlangga
Chua, K. H., Ping, C. L., & Hwa, C. C., 2016. Development of Insulated Isothermal
PCR for Rapid On-site Malaria Detection. Malaria journal, 15(134), pp.
1-10.
Jackson, J. B., Daniel, S. C., James D. L., Arjun P., Anders, S., & Tony, E., G., 2016.
Multiplex Preamplification of Serum DNA to Facilitate Reliable
Detection of Extremely Rare Cancer Mutations in Circulating DNA by
Digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, 18(2), pp. 235-243.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha
muda.
Triana, S. H., Gani, M. S., Malina, A. C., & Hamka., 2010. Analisis Keragaman
Genetik Dalam Seleksi Mendapatkan Induk Kerapu Macan
(Ephinephelus fuscoguttatus) Yang Tahan Bakteri Vibrio
parahaemolitycus Dan Toleran Salinitas Rendah Serta Salinitas Tinggi.
Lembaga Penelitian Dan Pengembangan Sumberdaya. Makassar:
Universitas Muslim Indonesia.

3.