LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

TITRASI FORMAL ASAM AMINO

OLEH :

GUSTI AYU KOMANG TRI DHARMA ULAN DEWI

1813081007

KIMIA

MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

2020/2021
 I. JUDUL PRAKTIKUM
Titrasi formal Asam Amino

II. TUJUAN PRAKTIKUM

• Untuk menentukan derajat hidrolisis suatu protein melalui titrasi formal asam
amino
• Untuk menghidrolisis protein dengan enzim protease
• Untuk membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva
mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino.

III. DASAR TEORI

Senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida ialah merupakan protein. Molekul protein mengandung
karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu
molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang
sudah tertentu pula dan bersifat turunan. (Aisjah Girindra: 1986)
Bila suatu protein dihidrolisis akan didapatkan asam aminonya. Hidrolisis
suatu protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dan tripsin.
Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau enzim yang mengkatalisis hidrolisis
protein. Tripsin mengkatalisis hidrolisis ikatan amida di bagian karboksil dari lisin
atau arginin. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam
amino bebas ini ini bila direaksikan dengan formaldehida berlebih akan membetuk
derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik
kehilangan satu proton dari gugus NH3+.
H3N+CHRCOO-(aq)⇌H2NCHRCOO-(aq) + H+(aq)
H2NCHRCOO-(aq) + 2HCHO (aq) ⇌ (HOCH2)2NCHRCOO-(aq)
Ion H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH
sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indikator ekuivalen). Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan
asam amino bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim
proteotik.Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino
bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat
memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis protein. Menurut teori
zwitterion, apabila suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, berarti ion
hidrogen dari ammonium yang dititrasi. Gugus ammonium dari asam amino yang
bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di atas pH 11, sehingga tidak mungkin
dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga terjadi pada gugus karboksil yang
bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak mungkin juga dititrasi dengan basa.
Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan
 tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat
ditentukan dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. (Tika, 2010)
Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah

Gambar 1. Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini terdiri dari 3 buah gelas kimia
100 mL, 3 buah Erlenmeyer 100 mL, 1 set buret dan statif, 1 buah spatula, 1 buah
batang pengaduk, 2 buah labu ukur 100 mL, 1 buah pipet ukur 25 mL, 1 buah kaca
arloji, 1 buah termometer, 1 buah pemanas listrik, 2 buah pipet tetes,dan 1 buah labu
ukur 25 mL.
Bahan-bahan yang digunakan adalah 100 mL larutan gelatin 5%, 100 mL
larutanNaOH 0,2 M, 50 mL larutanHCl 0,1 M, 85 mL indikator PP 1%, 75 mL
larutanformaldehida 40%, 25 mL larutan tripsin 1%, dan 500 mL aquades.
V. PROSEDUR KERJA
a. Penyiapan Larutan Gelatin
Larutan gelatin sebanyak 100 mL ditambahkan 1 mL larutan fenolftalein dan
NaOH 0,2 M tetes demi tetes hingga timbul warna merah muda. Larutan gelatin
yang berwarna merah muda ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl 0,1 M
sampai warna merahnya hilang.

b. Penyiapan Larutan Tripsin

Larutan tripsin sebanyak 25 mL ditambahkan dengan beberapa tetes
indikator fenolftlein dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai timbul
warna merah muda. Larutan tripsin yang berwarna merah muda ditambahkan
tetes demi tetes larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut sampai warna
merahnya hilang.

c. Titrasi Formal Asam Amino

Larutan gelatin sebanyak 100 mL disiapkan dengan melarutkan sebanyak
5,0011 gram padatan gelatin dan ditambahkan akuades sampai volume 100 mL.
Setelah itu, ditambahkan 1 mL larutan indikator PP ke dalam larutan gelatin
kemudian ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes hingga
timbul warna merah muda. Kemudian ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl
0,1 M sampai warna merah muda hilang. Pada tabung lain, 25 mL larutan Tripsin
ditambahkan dengan beberapa tetes indikator PP dan tetes demi tetes larutan
NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah muda. Setelah itu, ditambahkan tetes
demi tetes larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut sampai warna merahnya
hilang. Selanjutnya, ditambahkan larutan tripsin ke dalam larutan gelatin dan
diaduk perlahan. Setelah tercampur merata, diambil 10 mL campuran dan
dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan sebagai kontrol
atau waktu nol). Dilakukan pendidihan untuk merusak enzim kemudian
didinginkan. Kemudian ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3 tetes
fenolftalein kemudian titrasi dilakukan menggunakan NaOH 0,2 M dengan
interval waktu 15, 30, 4, 60, 75, dan 90menit dari waktu nol dilakukan yang sama
seperti pada kontrol.

VI. DATA PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Pada eksperimen ini dilakukan titrasi formal asam amino yaitu titrasi asam
amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehida. Titrasi formal
asam amino ini pada prinsipnya adalah titrasi asama basa, sehingga formalin, tripsin,
dan gelatin yang digunakan pada percobaan harus dinetralkan dulu supaya tidak
mengganggu hasil percobaan nantinya. Kondisi bahan-bahan yang tidak netral dapat
merubah kebutuhan NaOH dalam mentitrasi sampel dan dapat menyebabkan data
yang diperoleh tidak valid. Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan
NaOH 0,2 M hingga warna merah muda timbul dengan tujuan agar larutan gelatin
bersifat basa yang kemudian ditambahkan denganlarutan HCl 0,1 M sampai warna
merah muda larutan hilang (pH 8,0). Larutan gelatin akan mampu bereaksi secara
sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin pada pH 8,0 yang merupakan pH
optimum bagi suatu enzim untuk menghasilkan asam amino. Perlakuan yang sama
juga dilakukan terhadap larutan enzim protease (tripsin). Tahap awal dari praktikum
ini adalah preparasi larutan gelatin. Larutan gelatin dibuat dengan melarutkan serbuk
gelatin yang berwarna kuning ke dalam aquades. Campuran ini kemudian
dipanaskan agar gelatin lebih mudah untuk larut dalam air. Larutan yang terbentuk
setelah dipanaskan adalah larutan berwarna kuning bening.
Larutan gelatin yang sudah larut sempurna kemudian ditambahkan dengan
indikator fenolftalein. Tujuan ditambahkannya indikator fenolftalein adalah untuk
mengetahui perubahan pH yang terjadi pada sistem larutan. Setelah ditambahkan
indikator fenolftalein larutan tidak berubah warna. Larutan gelatin yang sudah
ditambahkan indikator fenolftlein, kemudian ditambahkan dengan larutan NaOH
tetes demi tetes. Penambahan NaOH ini mengakibatkan larutan gelatin berubah
warna menjadi merah muda. Larutan gelatin yang berwarna merah muda kemudian
ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes yang menyebabkan larutan kembali
berwarna kuning bening. Penambahan HCl bertujuan untuk membuat larutan
tersebut mencapai pH 8, karena sebelumnya dilakukan penambahan NaOH yang
membuat larutan bersifat basa. Penambahan HCl hingga pH 8 dilakukan, karena
pada pH ini merupakan pH optimum bagi enzim tripsin untuk bekerja optimal.
Hal yang sama juga dilakukan pada larutan tripsin. Larutan tripsin
ditambahkan dengan indikator fenolftalein. Tujuan ditambahkannya indikator
fenolftalein adalah untuk mengetahui perubahan pH yang terjadi pada sistem larutan.
Setelah ditambahkan indikator fenolftalein larutan tidak berubah warna. Larutan
tripsin yang sudah ditambahkan indikator fenolftlein, kemudian ditambahkan
dengan larutan NaOH tetes demi tetes. Penambahan NaOH ini mengakibatkan
larutan tripsin berubah warna menjadi merah muda. Larutan tripsin yang berwarna
merah muda kemudian ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes yang menyebabkan
larutan kembali ke warna semula. Penambahan HCl bertujuan untuk membuat
larutan tersebut mencapai pH 8, karena sebelumnya dilakukan penambahan NaOH
yang membuat larutan bersifat basa. Penambahan HCl hingga pH 8 dilakukan,
karena pada pH ini merupakan pH optimum bagi enzim tripsin untuk bekerja
optimal.
Proses selanjutnya, larutan tripsin dan larutan gelatin dicampur dan diaduk
perlahan. Penambahan larutan tripsin akan mampu menghidrolisis protein khususnya
gelatin. Digunakan larutan tripsin dalam hidrolisis protein ini karena pada tripsin
terdapat enzim protease yang mampu menghidrolisis protein dengan memotong
ikatan peptida pada sisi C dari gelatin yang menghasilkan asam amino bebas
sehingga dapat dititrasi.
Campuran yang sudah homogen antara larutan gelatin dan tripsin diambil
sebanyak 10 mL, kemudian dipanaskan hingga mendidih. Tujuan dilakukan
pemanasan adalah untuk merusak enzim sehingga reaksi akan terhenti. Larutan ini
kemudian didinginkan dan ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3 tetes
fenolftalein. Larutan ini digunakan sebagai standar karena diambil pada menit ke-
nol. Pengambilan campuran ini diulangi sebanyak 4 kali, dengan interval waktu
tertentu, yaitu pada menit ke-15, menit ke-30, menit ke 45, menit ke-60, menit ke-
75, dan menit ke-90. Masing -masing campuran tersebut diperlakukan sama seperti
kontrol, yaitu dipanaskan hingga mendidih. Tujuan penambahan formalin adalah
agar formalin bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus amonium mem-buffer di daerah pH yang lebih rendah dan
dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Hal
ini dilakukan karena jika tidak ditambahkan dengan formaldehid, gugus amonium
dari asam amino akan bersifat buffer pada daerah pH tinggi, diatas pH11, sehingga
tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga terjadi pada gugus
karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehinga tidak mungkin dititrasi
dengan basa.
Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan menggunakan formalin merupakan
reaksi pembentukan dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi yang terjadi antara
gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat
diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir
titrasi diperoleh tepat, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari bening
menjadi merah muda.
Selama melakukan titrasi formal asam amino volume NaOH yang
diperlukanpada menit ke- 0, 15, 30, 45, dan 60 adalah sebagai berikut.

Table 1. Data Volume NaOH yang digunakan padaTitrasi Formal Asam Amino
Menit ke - (t) Volume NaOH (mL)
0 15,20
15 15,30
30 15,45
45 16,53
60 17,16
75 17,88
90 18,51

Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat kurva hubungan antara volume
NaOH yang diperlukan terhadap waktu yaitu sebagai berikut.
 Kurva Hubungan antara Volume NaOH yang
Diperlukan Terhadap Waktu
20
15 Kurva Hubungan
antara Volume
10
NaOH yang
5 Diperlukan
0 Terhadap Waktu
0 50 100

Gambar 2. Kurva Hubungan antara Volume NaOH yang Diperlukan Terhadap Waktu

Kurva tersebut menunjukan bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka

semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi larutan asam amino
tersebut. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin
menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak.
Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah NaOH yang digunakan pada saat
titrasi juga bertambah. Akan tetapi pada batas waktu tertentu, kurva akan mulai
konstan apabila enzim sudah mencapai titik jenuhnya sehingga tidak mampu lagi
untuk mengikat asam-asam amino yang bebas.
Berdasarkan hasil titrasi tersebut, dapat dibuat kurva mg nitrogen asam
amino terhadap waktu yang diperlukan larutan gelatin untuk bereaksi. mg nitrogen
asam amino menyatakan jumlah asam amino yang dapat dihidrolisis oleh enzim
tripsin. Sebelum membuat kurva, mg nitrogen terlebih dahulu dihitung dengan
ketentuan 1 mL NaOH yang digunakan dalam titrasi ekuivalen dengan 0.28mg
nitrogen asam amino.
Berdasarkan perhitungan diatas, diperoleh data mengenai mg nitrogen
terhadap waktu seperti data sebagai berikut.

Table 2. Data mg Nitrogen yang Dihasilkan Oleh Asam Amino

Menit ke – Volume NaOH (mL) mg Nitrogen Asam
(t) Amino
0 15,20 4,256
15 15,30 4,284
30 15,45 4,326
45 16,53 4,6284
60 17,16 4,8048
75 17,88 5,0064
90 18,51 5,082

Berdasarkan data diatas, dapat dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen yang
dihasilkan oleh asam amino terhadap waktu yaitu sebagai berikut.
 Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap
Waktu
5
5
Kurva Hubungan
5 antara Volume
5 NaOH yang
Diperlukan
4 Terhadap Waktu
4
0 50 100

Gambar 3. Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap Waktu

Kurva di atas menunjukkan peningkatan jumlah mg nitrogen asam amino
seiring dengan bertambahnya waktu kontak antara larutan gelatin dengan larutan
tripsin. Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus
karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak, sehingga nitrogen yang
terdapat pada dimetilol juga ikut bertambah.

VII. SIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan diatas dapat disimpulkan sebagai
berikut :
• Protein (gelatin) dapat dihidrolisis secara enzimatis dengan menggunakan
tripsin.
• Kurva antara volume NaOH yang dihabiskan terhadap waktu menunjukkan
hubungan yang berbanding lurus antara keduanya. Kurva ini menunjukkan
semakin lama waktu hidrolisis maka semakin banyak NaOH yang dihabiskan.
Derajat hidrolisis dari gugus amino pada protein yang diperoleh adalah 0,0327
• kurva antara mg nitrogen asam amino terhadap waktu menunjukkan semakin
lama melakukan hidrolisis maka semakin banyak asam amino yang dihasilkan.

VIII. PERTANYAAN
1. Mengapa asam amino disebut monomer protein?
2. Bila suatu protein dihidrolisis?
3. Mengapa titrasi perlu ditambahkan aldehida
4. Substrast dalam percobaan ini, sebutkan
5. Tuliskan kurva titrasi dalam percobaan ini
6. Pada pH berapa titik akhir titrasi untuk gugus karboksil, mengapa?
7. Buatlah kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil hidrolisis protein
dengan menggunakan enzim protease?
8. Apakah tujuan penambahan formaldehid dan tuliskan reaksinya
Jawab ;
1. Asam amino disebut monomer protein dikarenakan suatu molekul protein
disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah tertentu
pula dan bersifat turunan.
2. Bila suatu protein dihidrolisis, akan didapatkan asam aminonya.
3. Titrasi perlu ditambahkan aldehida yaitu untuk memungkinkan gugus
ammonium membuffer pada pH yang lebih rendah sehingga dapat dititrasi pada
titik akhir.
4. Substrat dalam percobaan ini yaitu gelatin
5. Kurva titrasi asam amino

6. Pada pH rendah karena gugus karboksil bersifat buffer pada pH rendah sehingga
tidak memungkinkan jika dititrasi dengan basa.
7. Kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil hidrolisis protein dengan
menggunakan enzim protease.

Menit ke – Volume NaOH (mL) mg Nitrogen Asam

(t) Amino
0 15,20 4,256
15 15,30 4,284
30 15,45 4,326
45 16,53 4,6284
60 17,16 4,8048
75 17,88 5,0064
90 18,51 5,082
 Kurva Hubungan antara mg Nitrogen
Terhadap Waktu
5
5
Kurva Hubungan
5 antara Volume
5 NaOH yang
Diperlukan
4
Terhadap Waktu
4
0 50 100

8. Formaldehid ditambahkan kedalam larutan asam amino agar bereaksi dengan

gugus amino yang tidak membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat
dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan indicator.
IX. DAFTAR PUSTAKA
Redhana, I Wayan., dkk. 2004. Biokimia I. Singaraja: IKIP Negeri Singaraja

Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas

Pendidikan Ganehsa

Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu
Pendidikan Negeri Singara