de Almeida dkk.

Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561

http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561

CATATAN TEKNIS Akses terbuka

Evaluasi enam metode ekstraksi DNA yang

berbeda untuk mendeteksi Mycobacterium
tuberculosis melalui PCR-IS6110: studi
pendahuluan
1 1 2
Isabela Neves de Almeida , Wânia da Silva Carvalho , Maria Lúcia Rossetti , Elis Regina
2 3*
Dalla Costa dan Silvana Spindola de Miranda

Abstrak
INTISARI: Latar Belakang: Perkembangan deteksi molekuler dan diferensiasi strain anggota kompleks Mycobacterium tuberculosis terbukti
bermanfaat. Metode ekstraksi DNA mempengaruhi efisiensi amplifikasi, menyebabkan gangguan pada sensitivitas dan masing-masing
inhibitor. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membakukan metode ekstraksi DNA yang sederhana dan cepat, memberikan amplifikasi DNA
dengan IS6110-PCR secara efektif bebas dari gangguan yang tidak semestinya.

Temuan: Efisiensi dari enam protokol berbeda yang diuji pada kultur M. tuberculosis bervariasi dari 75% sampai
92,5%. Studi pendahuluan yang mengevaluasi sensitivitas dan spesifisitas IS6110 PCR ini dikembangkan dalam DNA
yang diekstrak dari slide mikroskop, dan mencapai efisiensi 100%.
Kesimpulan: Ekstraksi DNA dengan metode Chelex + NP-40 dari kedua biakan M. tuberculosis dan sediaan smear
menghasilkan jumlah DNA bebas interferensi yang baik, terutama pada sampel dengan konsentrasi materi genetik
yang rendah; oleh karena itu, teknik tersebut dapat digunakan untuk diagnosis molekuler tuberkulosis.
Kata kunci: M. tuberculosis, IS6110, Ekstraksi DNA, PCR

Latar Belakang alat investigasi; hasil tersebut bervariasi dari 11 hingga

Tuberkulosis (TB) adalah salah satu infeksi bakteri 81% [5]. Ada banyak alasan mengapa sering terjadi
kronis terkemuka, dengan kematian hampir 3 juta dan variabilitas hasil PCR; Namun, penelitian sebelumnya
lebih dari 8 juta kasus baru setiap tahun [1]. Diagnosis menunjukkan bahwa hasil PCR sangat bergantung pada
dini, pengobatan yang efektif, dan penghentian metode ekstraksi DNA [6].
transmisi yang berhasil adalah strategi utama untuk Metode ekstraksi DNA harus efektif, sederhana, dan
pengendalian TB [2]. cepat, juga menghilangkan kehadiran inhibitor PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode selama ekstraksi [6,7].
diagnostik yang cepat dan sensitif untuk mendeteksi Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah
dan mengidentifikasi M. tuberculosis, terutama pada untuk membakukan metode ekstraksi DNA yang
sampel dengan jumlah basil yang buruk [3]; dan sederhana, cepat, dan tidak terlalu kompleks,
penanda molekuler yang paling banyak digunakan menyediakan juga amplifikasi DNA dengan IS6110-PCR
untuk amplifikasi DNA adalah elemen penyisipan bebas dari gangguan yang tidak semestinya.
IS6110; yang spesifik untuk genom spesies kompleks M.
tuberculosis [4].
Beberapa penelitian melaporkan hasil sensitivitas Metode
dan spesifisitas yang berbeda, saat menggunakan Data klinis
teknik PCR sebagai diagnostik
Sampel yang termasuk dalam penelitian ini berasal
* Korespondensi: silvanaspindola@gmail.com
3
Koordinator Kelompok Riset FM / UFMG_REDE-TB, Belo Horizonte, Minas
dari pasien yang dibantu di Rumah Sakit Klinik
Gerais, Brasil Universitas Federal Minas Gerais (UFMG), pada tahun
Daftar lengkap informasi penulis tersedia di akhir artikel 2010 dan 2011. Perawatan pasien hanya terdiri dari
individu yang lebih tua.
© 2013 de Almeida dkk .; pemegang lisensi BioMed Central Ltd. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah
persyaratan Lisensi Atribusi Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), yang mengizinkan penggunaan,
distribusi, dan reproduksi yang tidak dibatasi dalam media apa pun, asalkan karya asli dikutip dengan benar.

de Almeida dkk. Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561 Halaman 2 dari 6

http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561

dari 18 tahun, yang menunjukkan kecurigaan TB dan metode biokimia dasar, di Ezequiel Dias Foundation
belum memulai pengobatan, seperti yang diperlihatkan Reference Center [9].
pada Tabel 1 dan 2. Semua pasien yang menerima
diagnosis TB diobati dengan obat anti-TB .
Ekstraksi
Sampel
Sepuluh pengenceran bakteri M. tuberculosis dalam
media kultur Löwenstein-Jensen telah diuji,
menggunakan pengenceran serial 1/10, 1/100 dan
1/1000; total 230 pengenceran diuji dengan metode
ekstraksi DNA yang berbeda.
Dua suspensi bakteri M. tuberculosis strain H37Rv
digunakan sebagai kontrol positif.
Lima slide dengan bacilloscopy sputum positif (satu +
dan dua ++) dan satu dengan bacilloscopy negatif
dipilih, berasal dari Laboratorium Mikobakteri Rumah
Sakit Klinik, di Universitas Federal Minas Gerais. Slide
diwarnai dengan metode fluoresensi (Auramine O),
untuk diserahkan ke prosedur ekstraksi.
Persiapan sampel
Inaktivasi M. tuberculosis
Untuk ekstraksi DNA dari kultur, suspensi bakteri yang
mengandung 1,5 mL air steril dan sekitar 3 sampai 5
koloni M. tuberculosis strain H37Rv disiapkan dalam
tabung Eppendorf. Suspensi ini diinaktivasi pada suhu
100 ° C selama 30 menit dalam blok termo, kemudian
disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit, pada
suhu 4 ° C. Supernatan dibuang, dan sedimen
digunakan dalam Protokol Ekstraksi 1, 2, 3, 4, dan 5.
Untuk Protokol Ekstraksi 6, tahap awal berbeda dan
akan dijelaskan lebih lanjut.
Persiapan dan pewarnaan slide noda
Pap dilakukan sebelum sampel ' deconta- mination
langkah dengan 0,5% N-asetil-L-sistein / 2% NaOH
(NaLC / NaOH) [8]. M. tuberculosis dan Non-tuberculous
Mycobacteria (NTM) spesies dikonfirmasi setelah
pertumbuhan di media kultur Löwenstein-Jensen , dan
diidentifikasi oleh
Tabel 1 Data klinis dari pasien termasuk dalam protokol
ekstraksi dari kultur
PasienJenis kelaminAsal Hipotesis / Gejala
3 m Menangkal Batuk untuk memperjelas
4 m Rawat JalanTB
5 m Menangkal Demam untuk memperjelasTidak
6 f Menangkal TB
7 m EU TB
8 m Menangkal TB
9 f Menangkal TB
10 m Menangkal TB
m = laki-laki; f = perempuan; EU = unit darurat; TB = tuberkulosis; HIV = Manusia
Virus Immunodeficiency.
de Almeida dkk. Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561
http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561
Tabel 2 Data klinis pasien yang termasuk dalam protokol ekstraksi dari slide mikroskop
Pasien Jenis kelamin
1 m
2 f
3 m
4 f
5 f
m = laki-laki; f = perempuan; TB = tuberkulosis tuberkulosa; HIV = Human Immunodeficiency Virus.
disentrifugasi pada 12.000 g selama 15 menit. Super
natant digunakan sebagai sumber DNA untuk PCR [12].
Protokol ekstraksi 5 - ekstraksi menggunakan Chelex 100 + 70%
Alkohol
Ekstraksi DNA kultur M. tuberculosis
Protokol ekstraksi 1 - ekstraksi menggunakan fenol-kloroform
DNA dari strain M. tuberculosis dibuat sebagai berikut,
setelah dinetralisir: pelet dari 400 μ L larutan lisozim (10
mg / mL) ditambahkan pada suspensi, dan diinkubasi
selama 1 jam pada suhu 37 ° C. Setelah itu, 20 μ L EDTA
(50 mM) + 400 μ L larutan proteinase K (10 mg / mL)
ditambahkan, dan campuran diinkubasi pada 60 ° C
selama 1 jam. Kemudian, larutan disimpan pada
suhu -20 ° C semalaman, dan DNA diekstraksi dengan
fenol-kloroform dan etanol. Setelah beku, larutan dibagi
menjadi dua bagian, dan 400 μ L dari fenol-kloroform
ditambahkan di setiap tabung vortex dan disentrifugasi
pada 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan
kemudian dipindahkan ke tabung lain, dan 0,6 volume
isopropanol dan 1/10 volume natrium asetat
ditambahkan; dihomogenisasi kemudian larutan sampai
warna putih hilang. Larutan kemudian disimpan
kembali pada suhu -20 ° C, selama 30 menit. Setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit, dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dua
kali dengan 500 μ L etanol 70%, dan setelah penguapan
sempurna, 20 μ L TE (Tris 100 μ M + EDTA 50 μ M)
ditambahkan ke dalamnya. DNA disimpan pada 2-8 ° C,
sampai perkembangan PCR. Metode ini dianggap
sebagai metode standar [10].
Protokol ekstraksi 2 - ekstraksi menggunakan alkohol 70%
500 μ L dari 70% Etanol ditambahkan ke pelet dalam
tabung, dan diinkubasi selama 2 jam. Sel mikobakteri
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10
menit, supernatan dibuang, dan pellet dicuci dua kali
dengan akuades steril. Setelah pencucian, let pel-
disuspensikan dalam 500 μ L air suling steril dalam
tabung Eppendorf 1,5 mL, yang kemudian digunakan
untuk PCR [11].
TB masa laluH
Protokol ekstraksi 3 - ekstraksi menggunakan Chelex 100+
Nonidet P-40 (NP-40)
Tidak Iy
200 μl larutan ditambahkan ke pelet dari suspensi
Tidak T
Chelex yang mengandung 5% Chelex-100, 1% Nonidet
TP-40, 1% Tween 20, dan air suling. Setelah
Tidak T
pencampuran dengan cermat, sampel dipertahankan
selama 30 menit pada suhu 100 ° C. Sampel kemudian
Tidak T
disentrifugasi selama 10 menit pada 13.000 g, dan
Iya Iylarutan dipindahkan ke tabung microcentrifuge segar
Tidak T
dan digunakan untuk PCR [8].
Tidak T
Protokol ekstraksi 4 - ekstraksi menggunakan Chelex 100
200 μ L larutan yang mengandung 40 mg Chelex 100 +
100 ml air ditambahkan ke pelet, dan material yang
dihasilkan dipertahankan pada 95 ° C selama 20 menit.
Lalu itu
Halaman 3 dari 6
Asal Hipotesis / Gejala TB masa lalu HIV
Menangkal Demam untuk memperjelas Tidak Iya
Rawat Jalan Batuk untuk memperjelas Tidak Tidak
Rawat Jalan TB Iya Iya
Rawat Jalan Batuk dan kekurusan untuk memperjelas Tidak Tidak
Rawat Jalan TB atau nocardiosis Iya Tidak
Sebuah volume 25 μ L dari suspensi yang
mengandung 5% Chelex-100, 1% Nonidet P-40, 1%
Tween 20, dan air digarap dis itu tersebar di slide
smear dengan ujung pipet. Cairan dipindahkan ke
tabung Eppendorf dan 75 μ L suspensi yang sama
ditambahkan. Setelah pencampuran secara
Sebanyak 150 μ L etanol 70% dingin ditambahkan ke
tabung, dicampur secara menyeluruh, dan
dipertahankan dalam es ( - 20 ° C) selama 20 menit.
Suspensi kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm
selama 5 menit, dan 200 μl larutan Chelex 20%
ditambahkan ke pelet. Campuran tersebut kemudian
diaduk kuat-kuat dengan shaker, dan diinkubasi pada
suhu 55 ° C selama 1 jam. Itu kemudian ditempatkan di
pusaran lagi, dengan kecepatan tinggi, selama 10 - 20
detik. Tabung dipertahankan pada suhu 100 ° C selama
15 menit. Kemudian tabung disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, pada suhu 4 ° C.
Setelah itu, penyuplai dipindahkan ke tabung baru dan
digunakan untuk PCR [6].
Protokol ekstraksi 6 - ekstraksi menggunakan kloroform +
CTAB (N-setil-N, N, Ntrimetil amonium bromida)
Beberapa bakteri loopfuls yang disuspensi kembali
dalam 400 μ L dari TE 1X buffer, dan kemudian tidak
aktif pada 80 ° C selama 20 Mi- nutes. 50 μ L larutan
lisozim ditambahkan ke pusaran dan diinkubasi pada
37 ° C selama minimal 1 jam, sambil diaduk. 70 μ L dari
SDS 10% dan 5 μ L dari proteinase K ditambahkan ke
pusaran, dan diinkubasi pada 65 ° C selama 10 menit.
100 μ L dari NaCl 5 M dan 100 μ L larutan CTAB / NaCl
ditambahkan ke pusaran sampai tenda con cair
menjadi putih; kemudian, diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 65 ° C. 750 μ L kloroform / alkohol isoamil
(24: 1) ditambahkan ke pusaran selama 10 detik, dan-
abad trifuged pada suhu kamar selama 5 menit, di
14.000 g. Supernatan dipindahkan ke tabung bersih
dan
0,6 volume isopropanol ditambahkan. Itu diinkubasi
pada -20 ° C selama 30 menit, dan disentrifugasi selama
15 menit pada 14.000 g. Supernatan dibuang dan pelet
dicuci dengan 1 mL etanol 70% dan disentrifugasi
selama 5 menit pada 14.000 g. Untuk mengendapkan
DNA, 20 - 30 μ L dari TE ditambahkan [13].
Ekstraksi DNA M. tuberculosis dari sediaan apus sputum
Chelex 100 + Nonidet P-40 (NP-40) pada slide
Apusan dahak pada slide dikirim ke ekstraksi Chelex
100 + Nonidet P-40 (NP-40) , karena ini adalah metode
yang paling efektif di antara enam metode yang diuji.
menyeluruh, sampel diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 100 ° C. Sampel kemudian disentrifugasi selama
10 menit pada 13.000 g, dan larutan dipindahkan ke
tabung microcentrifuge baru; kemudian, 5 μ L
digunakan untuk PCR [8].
PCR dan elektroforesis
PCR dilakukan dalam volume akhir 50 μ L contain- ing
7.0 μ L dari Buffer (10x), 3.0 μ L dari MgCl 2 (50 mM),
0,2 μ L DNTP (25 mM), 25 pmol dari setiap
oligonukleotida (IS1- 5 ′ CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG
3 ′ dan IS2- 5 ′ CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG 3 ′ ) dan 0,5
μ L dari Taq DNA Polymerase (500 U) Invitrogen®.
Amplifikasi dilakukan selama 40 siklus, masing-masing
terdiri dari denaturasi awal pada 94 ° C selama 2 menit,
denaturasi pada 94 ° C selama 30 detik, anil pada 64 ° C
selama 2 menit, ekstensi pada 71 ° C selama 1 menit.
menit, diikuti dengan perpanjangan terakhir pada 72 °
C selama 10 menit. Produk PCR dianalisis dengan
elektroforesis gel dalam gel agarosa 2%. Fragmen DNA
target dari seratus dua puluh tiga pasangan basa (bp)
dilihat di bawah sinar UV.
Penilaian kuantitatif DNA yang diekstraksi
Dosis DNA dilakukan dengan spektrofotometri
(SpectraMax Plus®). Absorbansi dan konsentrasi DNA
(ideal 5 - 100 ng / μ L) dievaluasi sebagai indikasi
kemurnian asam nukleat (rasio ideal: A 260 / A 280 ≥ 1. 8
dan A 260 / A 230 = 2) [14, 15].
Sebuah volume 5 μ L dari DNA terkonsentrasi, dan
pengenceran ive respect- (1/10, 1/100, dan 1/1000),
diserahkan ke reaksi PCR, dan tertutup dalam
spektrofotometer Spectra- Max Plus ® (menggunakan 2
μ L per produsen ' instruksi s).
Temuan
DNA M. tuberculosis dosis konsentrasi dipamerkan
mulai dari 1,048 ng / μ L; 4,33 ng / μ L; 47,78 ng / μ L;
182,5 ng / μ L; 112,3 ng / μ L; 7,0 ng / μ L dalam protokol
1, 2, 3, 4, 5, dan 6, masing-masing (Gambar 1) .
Nilai rata-rata rasio A 260 / A 280 dan A 260 / A 230
ditunjukkan pada Tabel 3.

de Almeida dkk. Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561 Halaman 4 dari 6

http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561

Tabel 4 Amplifikasi setelah ekstraksi sepuluh kultur M.

ng / tuberculosis
µL
DNA kultur tuberkulosis
         
1 (PC) 2 3 4 5 6 7 8 9 10
                       
Protokol Pekat + + + - + + + + + +
1 Pengenceran 1:10 + + + - + + + - + +
Pengenceran 1: 100 - + + - + + + + + -
 
Pengenceran 1: 1000- + - + + + - + + -
 
Protokol Pekat + + + - + + + + + +
2 Pengenceran 1:10 + - + - + + + + - +
Gambar 1 Dosis DNA yang diekstraksi menggunakan enam Pengenceran 1: 100 + - + + + + + + - +
 
metode berbeda. DNA terkonsentrasi. "Kotak biru".
Pengenceran 1: 1000+ - + + + + - + - -
 

Protokol Pekat + + + + + + + + - +
Efisiensi Protokol Ekstraksi 1, 2, 3, 4, 5 dan 6, 3 Pengenceran 1:10 + + + + + + + + + +
dikembangkan di M. tuberculosis.
Pengenceran 1: 100 + + + - + + + + - +
Budaya masing-masing terdiri dari: 75% (30/40), 75%  

(30/40), 90% (36/40), 75% (30/40) 77,5% (31/40), dan Pengenceran 1: 1000+ + + - + + + + + +
 
92,5% (37 / 40). Protokol Pekat + + + + + + + + - +
Metode yang menunjukkan kinerja yang lebih baik adalah
Extrac- tion Protocols 3 dan 6 (90% dan 92,5%); namun, 4 Pengenceran 1:10 + + + - + + + + - +
protokol 3 tidak menunjukkan hasil negatif bahkan dalam
Pengenceran 1: 100 + + + - - + + + - +
pengenceran 1/1000.  
Hasil amplifikasi setelah ekstraksi DNA dari sepuluh Pengenceran 1: 1000+ - + - - + + - + +
kultur M. tuberculosis ditunjukkan pada Tabel 4.  
Protokol Pekat + + + + + + + + + +
Gambar 2 menunjukkan elektroforesis amplifikasi
5 Pengenceran 1:10 + + + + + + + + + +
yang dilakukan dengan Protokol Ekstraksi 3. Pengenceran 1: 100 + + + - + + + + - +
Terjadi amplifikasi pada 4 slide dengan kultur M.  
tuberculosis positif, dan slide dengan kultur M. kansasii Pengenceran 1: 1000+ - - - + + - - - -
 
tidak diamplifikasi dengan IS6110-PCR. DNA yang Protokol Pekat + + + - + + + + + +
diekstraksi dari slide smear menggunakan Protokol
6 Pengenceran 1:10 + + + + + + + + + +
Ekstraksi 3 ditunjukkan pada Tabel 5. Elektroforesis
dari amplifikasi slide smear ditunjukkan pada Gambar Pengenceran 1: 100 + + + + + + + + + +
 
3. Pengenceran 1: 1000+ + + - - + - + + +
 

Diskusi PC: kontrol positif; + positif; - negatif.

Dosis DNA dari kultur setelah ekstraksi merupakan

yang membuktikan bahwa metode ekstraksi tidak
parameter penting untuk mengukur jumlah yang
memberikan pengaruh langsung terhadap
diekstraksi dan mengevaluasi kualitasnya (kemurnian); efektivitas IS6110-PCR .
Namun, sebagaimana dibuktikan dalam hasil kami, ini
Jumlah tahapan dan reagen, serta sifat reagen kimia
bukan parameter absolut [16,17], karena variasi besar telah
(enzim proteolitik, pelarut organik, alkohol, dan resin)
diverifikasi baik dalam nilai ' konsentrasi DNA ' atau '
yang digunakan menunjukkan perbedaan antara
absorbansi ' , tanpa hubungan dengan
keenam metode ekstraksi. Protokol Ekstraksi 1 dan 6
Penelitian
amplifikasi ini mendemonstrasikan
PCR-IS6110 . penerapan
(Fenol-kloroform dan Kloroform + CTAB) menggunakan
beberapa metode ekstraksi DNA, dan menemukan
lisozim dan proteinase K pada fase ekstraksi pertama,
variasi efisiensi antar metode 75% hingga 92,5% dari
yang menyebabkan pecahnya membran sel dan
PCR-IS6110,
pelepasan komponen sitoplasma, akibat pencernaan
oleh enzim proteolitik. Pelarut organik seperti fenol
Tabel 3 Absorbansi rata-rata dengan protokol ekstraksi
dan kloroform juga digunakan untuk memisahkan DNA
A 260 / A A 260 / A
280 230
dari lipid dan senyawa biokimia lainnya; penambahan
(≥1.8) (<2.0) etanol oc-
Protokol 1 1.96 1,69 juga dikurung, untuk memulihkan dan memurnikan DNA.
Menggunakan
Protokol 2 1.24 −0,74 CTAB diizinkan untuk meningkatkan sensitivitas, seperti yang
Protokol 3 1.28 dimilikinya
Tindakan 0,62 lebih baik pada pemurnian DNA [14].
Protokol 4 0.46
0.13 Ekstraksi Protokol 2 dan 5 (70% Alkohol dan Chelex
Protokol 5 1.26 100 + 70% Alkohol) menggunakan alkohol 70% dengan
0.46
Protokol 6 −1,13 tujuan pemurnian DNA. 70% alkohol membantu
menghilangkan organik
0,21 limbah yang dapat bertindak sebagai penghambat PCR [10]. Di
dalamnya

de Almeida dkk. Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561 Halaman 5 dari 6

http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561    

      

123bp

Gambar 2 Elektroforesis gel agarose dilakukan amplifikasi dengan protokol 3. Jalur 1 = Penanda molekul 100 bp, Jalur 2 = Kontrol Negatif,
Jalur 3 = Kontrol Positif, Jalur 4 = Sampel 8, Jalur 5 = Sampel 6, Jalur 6 = Sampel 7, Jalur 7 = Contoh9, Jalur 8 = Sampel 5, Jalur 9 = Sampel
10, Jalur 10 = Sampel 4, Jalur 11 = Sampel 3, Jalur 12 = Sampel 1, Jalur 13 = Sampel 2.

dua protokol, penghapusan sejumlah besar limbah
organik dalam sampel terkonsentrasi dibuktikan
melalui aksi alkohol 70%, yang paling baik ditunjukkan
dalam Protokol Ekstraksi 5, karena semua kultur
terkonsentrasi diamplifikasi, dan resin (Chelex 100)
digunakan untuk membantu pengambilan DNA dari
dalam sel [6].
Protokol Ekstraksi 3 dan 4 (Chelex + NP-40 dan Chelex
100) menggunakan resin Chelex 100 sebagai reagen
utama untuk ekstraksi DNA, yang terkait dengan
kejutan termal dan NP-40 untuk memurnikan DNA.
Protokol ekstraksi ini cepat; Namun, Protokol Ekstraksi
3, yang menggunakan NP-40, memiliki efisiensi yang
lebih tinggi ketika DNA diamplifikasi (90%),
menunjukkan kemungkinan penggunaannya untuk
mengkonsumsi lebih sedikit reagen, menyajikan hasil
yang mirip dengan yang dari protokol yang lebih
kompleks (Protokol Ekstraksi 6), menyajikan juga
efisiensi yang lebih tinggi dengan konsentrasi DNA
yang lebih rendah (1/1000). Protokol 3 telah digunakan
oleh beberapa penulis, karena tidak menggunakan
pelarut organik, menghilangkan beberapa tahap
pemurnian, dan hanya menggunakan dua tabung
Eppendorf per sampel, sehingga mengurangi biaya dan
waktu yang dihabiskan [7].
Para penulis menggunakan Protokol Ekstraksi 3
(Chelex + NP-40) untuk ekstraksi DNA dalam slide
smear, karena efisiensi yang lebih tinggi antara
protokol yang diuji dalam kultur. Kinerja PCR yang baik
yang ditunjukkan dalam sampel yang diekstraksi oleh
menghemat waktu dibandingkan dengan Protokol
Ekstraksi 1 (Fenol Kloroform), yang telah dijelaskan
oleh beberapa penulis sebagai standar emas untuk
ekstraksi DNA [18].
Ekstraksi Protokol 3 menyajikan hasil kultur terbaik
dalam ekstraksi; jadi, menggunakan protokol ini dalam
smear slide memungkinkan pemulihan DNA M.
tuberculosis dalam jumlah yang lebih kecil
(pengenceran 1/1000), mengonsumsi lebih sedikit
reagen, dengan tahapan yang lebih sedikit, dan tanpa
inhibitor; Jadi, cara ini efektif, praktis, dan cepat.
Dalam pekerjaan ini, kami telah memperhatikan
bahwa protokol yang lebih sederhana (Protokol
Ekstraksi 3), menyajikan lebih sedikit tahapan dan
Tabel 5 Hasil amplifikasi setelah ekstraksi DNA dari lima smear
pada slide sputum
AFB AU PCR
Contoh 1 ++ pos
Contoh 2 + pos
Contoh 3 - pos
Contoh 4 ++ pos
Contoh 5 + neg
+ dan ++ positif; pos = positif; neg = negatif; PCR = Reaksi Rantai Polimerase;
AFB AU = Asam-cepat basil oleh Auramine.
de Almeida dkk. Catatan Penelitian BMC 2013, 6: 561
http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/561
deterjen dengan kapasitas tinggi untuk memutus
interaksi lipid-protein , sehingga sel melisis dan
memfasilitasi pelepasan DNA darinya; yang
menghasilkan ekstraksi yang baik dan mengurangi
keberadaan inhibitor PCR. Selain itu, ini adalah metode
ekstraksi satu tahap, menghilangkan sehingga
kehilangan DNA yang terjadi saat menggunakan
beberapa tahap.
Ini adalah studi pendahuluan dengan jumlah sampel
yang rendah; namun, karena tes molekuler sangat
mahal di negara berkembang dan, oleh karena itu,
tidak secara rutin diperlukan sebagai alat diagnostik
oleh dokter, implantasi protokol ini di negara tersebut
dapat menjadi alternatif yang valid untuk menyelidiki
TB; Selain itu, kasus yang termasuk dalam penelitian
ini diduga memiliki TB dan, efektif, kasus tersebut
berasal dari rumah sakit sistem kesehatan masyarakat
dengan kompleksitas tinggi.
Batasan slide smear membutuhkan penggunaan
panel besar dalam penelitian, untuk mengkonfirmasi
nilai sensitivitas dan spesifisitas; Jadi, Protokol
Ekstraksi 3 akan ideal untuk laboratorium di mana
hanya dilakukan bacilloscopy, seperti halnya di
beberapa lokasi di Brasil. Selain itu, ini akan
menghilangkan ' masalah keamanan hayati ' selama
pengangkutan slide ke laboratorium biologi molekuler.
Relevansi amplifikasi DNA yang diekstraksi langsung
dari slide smear adalah karena bacilloscopy tidak
membedakan spesies bakteri, sedangkan amplifikasi
urutan IS6110 memungkinkan identifikasi cepat dari
mikobakteri ini, karena ini adalah urutan spesifik MTC,
membedakannya dari MNT. Oleh karena itu, metode
ekstraksi “ in-house ” yang baru harus distandarisasi
dan diuji, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian
ini.
Kesimpulan
Hasil penelitian ini memberikan kesimpulan bahwa
metode Chelex + NP-40 (Ekstraksi Protokol 3) untuk
ekstraksi DNA M. tuberculosis dari kultur dan slide,
mampu menghasilkan jumlah DNA bebas interferensi
yang baik, terutama pada sampel dengan kadar DNA
rendah. konsentrasi materi genetik; yang
Chelex + NP-40 dapat dikaitkan dengan fakta bahwa
NP-40 adalah
Budaya
M. tuberculosis
123bp
M. tuberculosis
M. tuberculosis
M. tuberculosis
M. kansasii Gambar 3 Elektroforesis amplifikasi slide smear. Jalur 1 = Marka Molekuler
100 bp, Jalur 2 = Kontrol Negatif, Jalur 3 = Kontrol Positif, Jalur 4 = Sampel
1, Jalur 5 = Sampel 5, Jalur 6 = Sampel 3, Jalur 7 = Sampel 3, Jalur 8 =
Sampel 4.
Halaman 6 dari 6
Detail penulis
1 2
Universitas Federal Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.
3
Yayasan Negara untuk Produksi dan
Penelitian Kesehatan (FEPPS), Porto Alegre, Brasil. Koordinator Kelompok Penelitian
FM / UFMG_REDE-TB, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.
Diterima: 30 Mei 2013 Diterima: 16 Desember 2013
Diterbitkan: 28 Desember 2013
Referensi
1. Amim I, Idrees M, Awan Z, Shashid M, Afzal S, Hussain A: PCR bisa menjadi metode
pilihan untuk identifikasi tuberkulosis paru dan ekstra paru. Catatan Penelitian BMC 2011,
4: 332.
2. RUPS Van Der Zandem, Te Koppele Vije EM, Vijay Bhanu N, Van Soolingen D, Schouls LM:
Penggunaan Ekstrak DNA dari Slide Bernoda Ziehl Neelsen untuk Deteksi Molekuler
Resistensi Rifampisin dan Spoligotipe Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2003,
41 (3): 1101-1108.
3. Haldar S, Chakravorty S, Bhalla M, Majumdar DS, Tyagi SJ: Deteksi yang disederhanakan dari
Mycobacterium tuberculosis dalam dahak menggunakan mikroskop smear dan PCR dengan
molecular beacon. J Med Microbiol 2007, 56 (10): 1356–1362.
4. Kolk AHJ, Noordhoek GT, De Leeuw O, Van Emden JDA: Strain Mycobacterium
smegmatis untuk deteksi Mycobacterium tuberculosis oleh PCR digunakan sebagai
kontrol internal untuk penghambatan amplifikasi dan untuk kuantifikasi bakteri. J Clin
Microbiol 1994, 32 (5): 1354–1356.
5. Barani R, Saranga G, Antony T, Periyasami S, Kindo AJ, Srikanth P: Peningkatan deteksi
Mycobacterium tuberculosis menggunakan dua target PCR independen di sebuah pusat
perawatan tersier di India Selatan. J Infect Dev Ctries 2012, 6 (1): 46–52.
6. Nagdev KJ, Kashyap RS, Deshpande PS, Purohit HJ, Taori GM, Daginawala HF: Penentuan
efisiensi reaksi berantai polimerase untuk diagnosis meningitis tuberkulosis pada sampel
DNA yang diekstraksi Chelex-100® .
Int J Tuberc Lung Dis 2010, 14 (8): 1032–1038.
7. Suresh N, Arora J, Pant H, Rana T, Singh UB: Spoligotyping DNA Mycobacterium
tuberculosis dari Archival Ziehl – Neelsen-stained sputum smears. J Microbiol Methods
2007, 68 (2): 291-295.
8. Van Der Zanden RUPS, Hoeilmann FGC, Weltevred EF, Schouls LM, Van Embden JDA:
Deteksi simultan dan diferensiasi strain kompleks Mycobacterium tuberculosis dalam
jaringan yang tertanam lilin parafin dan preparat mikroskopis yang diwarnai. J Clin Pathol
1998, 51 (4): 209–214.
9. da Saúde M: Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da tuberculose e
outras Micobactérias. Brasília: Ministério da Saúde; 2009.
10. Otal I, Martin C, Frebault LVV, Thierry D, Gicquel B: Analisis polimorfisme panjang
fragmen batasan menggunakan IS6110 sebagai penanda epidemiologi pada
tuberkulosis. J Clin Microbiol 1991, 29 (6): 1252–1254.
11. Elbir H, Mushin A, Babiker A: Laporan singkat: metode satu langkah berbasis DNA PCR
untuk mendeteksi kompleks Mycobacterium tuberculosis yang ditanam pada media
Lowenstein-Jensen . Am J Trop Med Hyg 2008, 78 (2): 316–317.
12. Al-Mutairi NM, Ahmad S, Mokkadas E: Perbandingan kinerja empat metode
untuk mendeteksi strain Mycobacterium tuberculosis resisten multidrug . Int J
Tuberc Lung Dis 2011, 15 (1): 110–115.
13. Leao SC, Martin A, Mejia GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MAS, Portaels F:
Buku pegangan Pratical untuk identifikasi fenotip dan genotipik dari mikobakteri.
Bagian II - Prosedur Metodologi 2004, 115–116. Dicetak oleh Vanden B. Brugues.
14. Sambroock J, Fritsch EF, Maniats T: Molecular Cloning - manual laboratorium di web. Bab 8.
Amplifikasi DNA In Vitro oleh Reaksi Rantai Polimerase. Diedit oleh Cold Spring Harbor
Laboratory Press. AMERIKA SERIKAT; 2001: 696.
15. Sambroock J, Russell DW: Spektrofotometri DNA atau RNA. Molekuler
Kloning 2001, A8: 20–21. Edisi ketiga.
16. Mesquita RA, Anzai EK, Oliveira RN, Nunes FD: Avaliação de três métodos de ekstraksi DNA
de material parafinado para amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR. Pesqui
Odonto Bras 2001, 15 (4): 314–319.
17. Barea JA, Pardini MIMC, Gushiken T: Metode ekstraksi DNA dari bahan arsip
dan sumber langka untuk pemanfaatan dalam reaksi polimer. Rev bra Hematol
membenarkan penggunaannya dalam diagnosis Hemoter 2004, 26 (4): 274–281.
18. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger EC, Bodmer T: Identifikasi cepat mikobakteri
molekuler TB. hingga tingkat spesies dengan reaksi rantai polimerase dan analisis enzim restriksi. J Clin
Microbiol 1993, 31 (2): 175–178.

Singkatan doi: 10.1186 / 1756-0500-6-561

M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis; TB: Tuberkulosis; Kutip artikel ini sebagai: de Almeida et al .: Evaluasi enam metode ekstraksi DNA yang
MTC: Mycobacterium tuberculosis complex; PCR: Reaksi berantai polimerase. berbeda untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis melalui PCR-IS6110: studi
pendahuluan. Catatan Penelitian BMC 2013 6: 561.

Minat yang bersaing

Penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.

Kontribusi penulis
SSM, WSC dan INA merencanakan dan merancang percobaan. INA melakukan percobaan. SSM,
WSC dan INA menganalisis data. SSM, WSC, INA, MLR dan ERDC menulis makalahnya. Semua
penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.

Ucapan Terima Kasih

Yayasan Penelitian Minas Gerais (FAPEMIG) dan departemen Pascasarjana Fakultas
Kedokteran, Universitas Federal Minas Gerais atas dukungan keuangannya. Kepada para
kolaborator: Lúcia Tavares Paradizi, Ana Lethícia Figueiredo dan Lida Jouca, dan semua
karyawan laboratorium terintegrasi.