Analisis Kualitatif

dan Kuantitatif
SECARA
Spektrofotometri
UV-Vis
 Prinsip Dasar

 Pengukuran suatu interaksi antara radiasi

elektromagnetik dengan molekul atau
atom dari suatu zat kimia
 Daerah pengukuran serapan :
UV = 190-380 nm
Vis = 380-800nm
 Absorbsi eksitasi elektron
Spektrum Elektromagnetik (1)
Spektrum Elektromagnetik (2)
 Prinsip Dasar Spektrofotometri
 Serapan molekul berkaitan dengan :
- Eksitasi elektron sigma (σ): memerlukan energi
yang relatif besar (daerah UV jauh; panjang
gelombang 100-200 nm).
- Elektron phi () :elektron pada ikatan rangkap
dua atau tiga;
- Elektron n (non bonding) : dapat dieksitasi pada
daerah UV dekat (panjang gelombang 200-380
nm)
Transisi Elektron
 Transisi Elektron
Transisi elektron yang berkaitan dengan
absorbansi radiasi ultraviolet dan sinar
tampak adalah :
σ σ*
π π*
n σ*
n π*

2/22/11
Spektrofotometri UV-Vis
 Komponen Instrumen
1. Light Source
UV = Deuterium
Vis = Tungsten/ Wolfram
2. Wavelength selector
3. Sample container
4. Detektor
5. Signal Processors
Skema Komponen Spektrofotometer
 Kriteria Senyawa Yang Dapat Dianalisis

Adanya kromofor pada suatu struktur senyawa

kimia zat yang akan dianalisis

Kromofor :
Ikatan atau gugus fungsi spesifik dalam molekul
yang bertanggung jawab atas penyerapan cahaya
pada panjang gelombang tertentu.

 ikatan rangkap terkonjugasi

 gugus karbonil
 gugus anorganik
 Ikatan Rangkap Terkonjugasi
Dua ikatan rangkap terkonjugasi akan
memberikan gugus kromofor.
Panjang gelombang serapan maksimum
dan koefisien ekstingsi molar akan
bertambah dengan bertambahnya jumlah
ikatan rangkap terkonjugasi
 Gugus Karbonil dan
Gugus Anorganik
 Gugus karbonil
Pada gugus karbonil aldehida dan keton
dapat dieksitas baik dengan peralihan
n* atau *.
 Gugus anorganik
memiliki transisi elektron n*
seperti nitrat (313 nm), nitrit (360 dan 280
nm), dan tritiokarbonat (500 nm)
 Auksokrom
 Gugus fungsi dalam suatu molekul yang
mempunyai elektron bebas, seperti : OH; -
O; -CH3
 Terikatnya gugus auksokrom pada gugus
kromofor akan mengakibatkan:
* pergeseran pita absorbsi menuju panjang
gelombang lebih besar (pergeseran
batokromik)
*peningkatan intensitas absorbsi radiasi
(efek hiperkromik)
  Kromofor :
 Gugus fungsi yang menyerap radiasi
di daerah UV dan derah tampak

   [Molekul organik yang mempunyai
ikatan tak jenuh]
n
 C C C C
  [Molekul organik yang tidak
 mempunyai atom pasangan
elektron sunyi]
C=O; C-S; C-N; C-C
Auksokrom : n 
Gugus yang tidak menyerap radiasi pada panjang gelombang
> 200 nm, menyerap kuat di daerah UV jauh -OH, -NH2; -Cl
Auksokrom terikat pada kromofor,
Bila serapan bergeser pada panjang gelombang
yang lebih panjang (Efek Batokrom)

Bila serapan bergeser pada panjang gelombang

yang lebih pendek (Efek Hipsokrom) 18
Hendig W
 Penggunaan
Spektrofotometer UV/Vis
(1) Analisis Kualitatif
(a) Analisis Struktur
(b) Pemeriksaan Kemurnian
(c) Identifikasi

(2) Analisis Kuantitatif

Penetapan Kadar

2/22/11
 ANALISIS KUALITATIF

2/22/11
 ELUSIDASI STRUKTUR
Spektrum absorpsi  informasi adanya gugus
kromofor dan gugus fungsi melalui:
Profil spektrum absorpsi
Posisi λ maks
Absortivitas dalam pelarut tertentu
Berdasarkan kaidah woodward
Harus dilengkapi data analisis unsur, spektrum
IR, dan NMR
KAIDAH WOODWARD
KAIDAH WOODWARD
 DETEKSI GUGUS FUNGSIONAL
Spektrum absorpsi pada daerah tampak
dan UV  deteksi keberadaan gugus
fungsi tertentu yang berperan sebagai
kromofor.
Absorbsi lemah pada 280-290 nm 
adanya gugus karbonil
Absorpsi lemah pada 260 nm (indications
of vibrational fine structure)  cincin
aromatik
2/22/11
 PEMERIKSAAN KEMURNIAN

Penetapan harga absorban maksimum

Penetapan rasio absorban yang diukur pada
dua λ yang berbeda
 Hasil yang diperoleh dibandingkan
dengan persyaratan pada literatur
 PENGUJIAN IDENTITAS

Identifikasi senyawa ditentukan melalui:

pembuatan spektrum absorpsi
λ maksimum
nilai absortivitas molar senyawa asli/turunan

Hasil pengukuran dibandingkan dengan pustaka

atau dengan larutan pembanding
ANALISIS KUANTITATIF

2/22/11
 HAL-HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN

(1)Pelarut
(2)Reagen
(3)Panjang gelombang

2/22/11
 PELARUT
- Harus memenuhi kriteria untuk menjamin
keberhasilan analisis dan hasil yang akurat
- Melarutkan sampel
- Kompatibel dengan bahan cuvette
- Transparan
- Tidak digunakan pada area dimana pelarut
tersebut memberikan serapan (cut off
wavelength)
- Murni
2/22/11
Pelarut yang Umum Digunakan (1)

Solvent Cut-off (nm)

Hexane 199
Heptane 200
Isooctane 202
Diethyl ether 205
Ethanol 207
Propan-2-ol 209
Methanol 210
Cyclohexane 212
Acetonitrile 213
Dioxan 216
Dichloromethane 233
Tetrahydrofuran 238
Pelarut yang Umum Digunakan (2)

Solvent Cut-off (nm)

Trichloromethane 247
Tetrachloromethane 257
Dimethyl sulphoxide 270
Dimethyl formamide 271
Benzene 280
Pyridine 306
Propanone 331
 REAGEN
(1) Stabil dalam larutan
(2) Rapid and Reproducible Reaction
(3) Reproducible Rate of Reaction
(4) Selectivity or Specificity of the reagent-
analyte solution
(5) Solvent Compatibility
(6) Linear Calibration

2/22/11
 Pemilihan Panjang gelombang
 Panjang gelombang yang mempunyai absorbansi
maksimum
- kepekaan maksimum  perubahan absorbansi
untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling
besar
- Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk
kurva absorbansi datar sehingga hukum Lambert-
beer akan terpenuhi
- Perbedaan absorban sangat minimum sehingga
kesalahan pengukuran sangat kecil
 Pemilihan Panjang Gelombang

The wavelength maximum absorbance,

is quickly ascertained from a
wavelength scan, and this wavelength
usually is the most suitable.

2/22/11
 Perbedaan Pengukuran Absorbansi yang Dilakukan
pada Panjang Gelombang Maksimal dan Tidak Maksimal

Perbedaan pengukuran absorbansi pada panjang

gelombang maksimal dan tidak pada panjang gelombang
maksimal
PELARUT

 Umumnya dipakai etanol 95% yang transparan sampai

210 nm. Etanol absolut mengandung residu benzen yang
mengabsorpsi pada daerah UV.

 Pelarut lain: sikloheksana, senyawa hidrokarbon lain.

 Makin kurang polar makin kecil interaksi dengan molekul

yang diukur.

22
 Parameter yang Menentukan Panjang
Gelombang Absorbsi Max

 Jenis kromofor
 Pelarut
 Gugus substituen pada kromofor
 Geometri kromofor
 PENGARUH PELARUT
   *
Pelarut yang lebih polar akan menaikkan max.
Misal : max (dlm etanol) > max (dlm n-heksana)
(red shift antara 10 – 20 nm).
 n  *
Misal : untuk keton, transisi n  *
 dipengaruhi oleh terbentuknya ikatan hidrogen
antara pelarut dng gugus karbonil.
max aseton = 279 nm (dlm pelarut heksana)
= 270 nm (dlm pelarut etanol)
= 264,5 nm (dlm pelarut air)
(air dan gugus C=O membentuk ikatan hidrogen, shg terjadi
blue shift).
23
 Pengaruh Pelarut
 Solvatasi Molekul : mengubah tingkat energi elektron
kromofor dan derajat solvatasi molekul pada tingkat
dasar dan tereksitasi yang seringkali berbeda.
 Jika molekul tingkat dasar tersolvatasi tereksitasi lebih
kuat daripada molekul tereksitasi, terjadi pergeseran
panjang gelombang yang diabsorbsi ke panjang
gelombang yang lebih pendek  efek hipsokrom atau
geseran biru
 Jika tingkat tereksitasi tersolvatasi lebih kuat, terjadi
pereseran panjang gelombang yang diabsorbsi ke
panjang gelombang lebih besar  efek batokrom atau
geseran merah
 Pergeseran Panjang Gelombang
yang Diabsorbsi

Bathochromic Hypsochromic

Hypochromic Hyperochromic

2/22/11
 DEFINISI – DEFINISI
Auxochrome (auksokrom)
Suatu substituen pd kromofor yg memiliki “litle UV absorption”, dan dpt
menyebabkan red shift/blue shift (i.e. -OH, -OR, -NR2, halogen)
Misal: konjugasi pasangan elektron sunyi pada atom N dari enamin
menggeser absorbsi maksimum ikatan rangkap 2 terisolasi dari 190
nm menjadi 230 nm  substituen nitrogen adalah auxochrome.
H
N max190 nm  230 nm
C C R

Suatu auksokrom merubah suatu kromofor menjadi

kromofor baru.

24
 DEFINISI-DEFINISI (lanjutan)

Red Shift (bathochromic effect) :

Pergeseran absorpsi maksimum ke arah panjang gelombang
yang lebih besar. Dapat terjadi karena pergantian medium/
pelarut, atau karena adanya auxochrome
Blue shift atau hypsochromic effect :
Pergeseran ke arah  yg lebih pendek.
Anilin: max 230 nm
dlm larutan asam bergeser  203 nm (pergeseran biru).

Hypochromic effect :
Efek yg menyebabkan menurunnya intensitas absorbsi.
Hyperchromic effect :
Efek yg menyebabkan meningkatnya intensitas absorbsi.

25
 PENETAPAN KADAR SENYAWA TUNGGAL

Membuat satu seri larutan  diukur pada λ,

suhu dan pelarut sama  catat
absorbansi
Membuat grafik absorban terhadap C 
tentukan regresi liniernya  kurva
kalibrasi
Memenuhi hukum Lambert-Beer
A = mC dengan m = gradien
 Hukum Lambert-Beer
 Peningkatan Konsentrasi ~ Peningkatan absorbansi
Rumus untuk menghitung banyaknya cahaya hamburan
:

Rumus untuk menghitung absorbansi :

Dimana Hukum Beer dapat ditulis sebagai :

2/22/11
Keterangan :
A= absorbansi
b = tebal kuvet (umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi
larutan dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi
larutan dalam ppm)

2/22/11
 Hukum Lambert-Beer

2/22/11
KURVA KALIBRASI
 PENETAPAN KADAR SENYAWA TUNGGAL

Menghitung berdasarkan absorbtivitas molar yang

diketahui :
Cu =Au
a.b
Au = absorban larutan uji
b = tebal kuvet
a = absorbtivitas molar/absorbtivitas jenis
 PENETAPAN KADAR SENYAWA TUNGGAL

Metode one point

Larutan uji dibandingkan terhadap larutan
baku (kadar dan Kemurniannya diketahui)
Syarat : λmaks, suhu, pelarut, alat harus
sama
Cu = Au . Cb
Ab
 PENENTUAN KADAR SENYAWA
MULTIKOMPONEN

Dapat dilakukan bila spektrum absorpsi kedua

komponen berbeda  λmaks beda

Kadar masing-masing dihitung dengan mengukur

absorban campuran pada kedua λmaks

Pada λ1  A1 = A1x + A1y

 PENENTUAN KADAR SENYAWA
MULTIKOMPONEN

Aplikasi Hukum Beer’s untuk menghitung

senyawa multikomponen:
Atotal = A1 + A2 + A3 + An
= ɛ1bc1 + ɛ2bc2 + ….+ ɛnbcn

2/22/11
PENENTUAN KADAR SENYAWA
MULTIKOMPONEN
PENENTUAN KADAR SENYAWA
MULTIKOMPONEN
 PENETAPAN TETAPAN
KESETIMBANGAN ASAM BASA (1)
 Pengukuran pKa dapat dilakukan apabila ada
pergeseran UV yang tergatung pH
 Rumus :

Keterangan :
A = absorbans terukur dalam suatu dapar yang pH nya
diketahui pada λ yang dipilih
Ai = absorbans spesies terionisasi sempurna
Au = absorbans spesies tak terionisasi
 PENENTUAN
TETAPAN LAJU REAKSI KIMIA
 PENETAPAN TETAPAN
KESETIMBANGAN ASAM BASA (2)

Absorbans konsentrasi tetap fenilefrin pada 292 nm

diketahui sebesar 1,224 dalam NAOH 0,1 M dan 0,02
dalam HCl 0,1 M. Absorbans dalam dapar pada pH 8,5
diketahui 0,349. Hitung nilai pKa gugus hidroksil fenolik
yang bersifat asam?

Penyelesaian :

2/22/11
 PUSTAKA (1)
Creswell, C.J., O.A. Runquist, M.M. Campbell, 2005, Analisis
Spektrum Senyawa Organik Ed. 3, terjemahan K. Padmawinata &
Ny. Iwang Soediro, Penerbit ITB, Bandung, hal. 26-59.
Day, R.A, A.L. Underwood, 1999, Analisis Kimia Kuantitatif,
terjemahan Iis Sopyan, Penerbit Erlangga, Jakarta, hal. 396-415
Harvey, David., 2000, Modern Analytical Chemistry, Mc. Graw Hill
International Edition, Singapore, p.376-392
Kemp, W., Organic Spectroscopy
Roth, H.J, Analisis Farmasi, hal. 353, 367
Satiadarma, K, M. Mulja., D.H. Tjahjono, R.E. Kartasasmita., 2004,
Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Airlangga University
Press, Surabaya, hal 87-97
 PUSTAKA (2)

Gandjar I.G.,Rohma A.,Kimia Farmasi Analisis, p.220-264

Watson D.G, 2005, Pharmaceutical Analysis, Elsevier, United
Kingdom
Denny, Ronald C., Sinclair R., Visible and Ultraviolet
Spectroscopy
http://www.hellma-worldwide.com
http://www.wikipedia.com

2/22/11
 JAWABAN PERTANYAAN

2/22/11
 Bagaimana Kalibrasi
untuk Spektrofotometer
UV-Vis ?

2/22/11
 KALIBRASI INSTRUMEN

• Monograf Farmakope biasanya mendasarkan pada nilai

standar
• Sebelum digunakan dikalibrasi dengan baik
- skala panjang gelombang
- skala absorbansi
• Untuk Kalibrasi instrumen
- penentuan resolusi (daya pisah) spektrofotometer
- penentuan adanya sesatan sinar (Stray Radiation)
 Kalibrasi Skala Absorbansi

Kalibrasi skala absorbansi spektrofotometer UV-

Vis dapat dilakukan dengan menggunakan
kalium bikromat 0,0005% dalam 0,05 M
untuk mengkalibrasi skala absorban pada
spektrofotometri UV
Hubungan antara panjang gelombang
dengan nilai

Tabel hubungan antara λ dan kisaran nilai

λ (nm)

235 122,9 - 126,1

257 142,4 – 145,7

414 47,0 – 50,3

350 104,9 – 108,2

Spektrum UV larutan kalium bikromat 0,0005%
pada λ 220-350 nm
 Kalibrasi Skala λ

Kalibrasi skala panjang gelombang spektroskopi

UV-Vis dilakukan dengan menggunakan larutan
holmium perklorat 5% b/v
Toleransi untuk kalibrasi panjang gelombang
adalah 241 ± 1 nm ; 287,15 ±1 nm; dan 361,5 ±
1 nm
Skala absorbansi larutan holium
perklorat 5% b/v
 Penentuan Resolusi
Penentuan resolusi dilakukan dengan kontrol
lebar celah, menggunakan pelarut toluen 0,02%
b/v dalam heksan.
Farmakope Inggris mensyaratkan bahwa rasio
antara absorbansi larutan ini pada 269 nm
terhadap absorbansi pada 266 nm harus ≥ 1,5
 Penentuan Adanya Sesatan Sinar (1)

•Sesatan sinar adalah sinar yang sampai ke

detektor tetapi tidak melewati sampel
•Sesatan sinar dapat memberikan absorbansi
palsu seakan akan sampel memberikan
absorbansi yang rendah
•Hal ini berbahaya untuk sampel yang
absorbansinya > 2
Penentuan Adanya Sesatan Sinar (2)

•Sesatan sinar ditentukan dengan menggunakan

larutan KCL 1,2% b/v dalam air terhadap blanko
air pada λ 200 nm.
•Jika absorbansi larutan ini <2 maka terjadi
sesatan sinar dan spektrofotometer harus
diganti
 UV-Visible Absorption Spectra

When sample molecules are exposed to light having an

energy that matches a possible electronic transition
within the molecule, some of the light energy will be
absorbed as the electron is promoted to a higher
energy orbital
Results  absorbance (A) versus wavelength
Absorbance usually ranges from 0 (no absorption) to 2
(99% absorption), and is precisely defined in context
with spectrometer operation.
Terminology of Absorption Shifts

Nature of Shift Descriptive Term

To Longer Wavelength Bathochromic
To Shorter Wavelength Hypsochromic
To Greater Absorbance Hyperchromic
To Lower Absorbance Hypochromic
Why?
Pergeseran Hipsokromik - Batokromik

Saat sifat kepolaran pelarut yg digunakan tinggi,

terjadi perubahan transisi dari n π* sehingga
terjadi pergeseran ke panjang glombang yang
lebih pendek (efek hipsokromik).
Efek hipsokromik terjadi karena meningkatnya
proses pelarutan pasangan elektron bebas 
menurunkan energi orbital n.

2/22/11
Efek hipsokromik yang sangat jelas, terlihat
pada pelarut polar seperti air atau alkohol,
dimana terjadi pembentukan ikatan hidrogen
ekstensif antara proton pelarut dan pasangan
elektron bebas.
Kebalikannya, pergeseran batokromik (ke arah
panjang gelombang yang lebih besar) terjadi
karena transisi π  π*

2/22/11
 Mengapa Muncul Kurva Naik, Puncak,
kemudian turun lagi?

2/22/11
Eksitasi hanya dapat terjadi bila proses elektronik dimana satu
atau lebih elektron dari suatu atom pindah ke tingkat energi
yang lebih tinggi. Proses menuju eksitasi ditunjukkan dalam
kurva yang menaik, dimana terjadi peregangan molekul terlebih
dahulu hingga terjadi eksitasi elektron yang menyebabkan
terjadinya puncak absorpsi.
Namun, proses eksitasi tidak akan terjadi selamanya, karena
akan terjadi proses relaksasi yang menyebabkan atom atau
molekul akan kembali ke tingkat dasarnya, yang digambarkan
dengan kurva menurun.
Panjang gelombang dimana terjadi kurva naik, puncak, dan
kurva turun tergantung dari sifat spesifik senyawa yang
dianalisa, artinya kurva ini sangat spesifik untuk tiap senyawa.

2/22/11
TERIMA KASIH

2/22/11