Imunodiagnosis adalah diagnosis berdasarkan pada reaksi

antibodi dalam serum darah terhadap antigen (Dorlan, 2002).

Imunodiagnostik merupakan teknik/metode pemeriksaan untuk
menentukan diagnosis suatu penyakit dengan menggunakan
reaksi antigen-antibodi sebagai prinsip/ sarana utama dari tes/uji
yang dilakukan. Antibodi spesifik untuk antigen tertentu dapat
terkonjugasi dengan metode radiolabel, label flurescent, atau
enzim yang membentuk warna,
Beberapa aplikasi dari teknik imunodiagnostik yang banyak dikenal yaitu :

Imunoblotting

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Imunohistokimia

PCR (Polymerase Chain Reaction)

 Immunoblotting (western blotting) adalah tes cepat dan sensitif untuk
mendeteksi dan karakterisasi protein yang bekerja dengan memanfaatkan spesifikasi
yang melekat pada pengenalan antigen-antibodi. Ini melibatkan pelarutan dan
pemisahan elektroforesis protein, glikoprotein, orlipopolisakarida dengan
elektroforesis gel, diikuti oleh transfer kuantitatif dan pengikatan ireversibel ke
nitroselulosa, PVDF, atau nilon. Teknik imunoblot telah berguna dalam
mengidentifikasi antigen spesifik yang dikenali oleh antibodi poliklonal atau
monoklonal dan sangat sensitif (1 ng antigen dapat dideteksi). Unit ini menyediakan
protokol untuk pemisahan protein, menghilangkan protein pada membran,
immunoprobing, dan visualisasi menggunakan substrat chromogenic atau
chemiluminescent (Gallagher et al., 2008).
Blotting adalah visualisasi DNA, RNA & Protein spesifik di antara ribuan molekul
pencemar membutuhkan konvergensi sejumlah teknik yang secara kolektif
disebut transfer BLOT

BLOTTING TEKNIK

Southern Blot Northern Blot Western Blot

Digunakan untuk mendeteksi Digunakan untuk mendeteksi Digunakan untuk mendeteksi
DNA RNA Protein
• Sample diambil dari seluruh jaringan, dari kultur sel, bakteri, virus, atau sample
lingkungan
• Dalam kebanyakan kasus, sample adalah jaringan padat
• Jaringan pertama dipecah secara mekanis dengan blender( (volume besar),
menggunakan homogenier (volume kecil)
• Selanjutnya kombinasi teknik biokimia dan mekanik termasuk berbagai jenis
filtrasi dan sentrifugasi
• Untuk mendorong lisis sel dan untuk melarutkan protei dapat digunakan
deterjen, garam, dan buffer untuk mencegah pencernaan sample dengan
enzymnya sendiri (anti protease dan fosfat)
• Untuk menghindari denaturasi protein-persiapan jaringan sering dilakukan pada
suhu dingin.
 SDS-PAGE (POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS)
SDS-PAGE, elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat, adalah teknik yang banyak
digunakan dalam biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler. Untuk memisahkan protein
sesuai dengan mobilitas elektroforetiknya, untuk memisahkan protein menurut ukurannya, dan tidak
ada ciri fisik lainnya.
SDS (sabun deterjen) memecah area hidrofobik dan melapisi protein dengan muatan negatif
sehingga membanjiri muatan positif dalam protein. Oleh karena itu, jika sel diinkubasi dengan SDS,
membran akan terlarut, semua protein akan dilarutkan oleh deterjen dan semua protein akan
tertutup banyak muatan negatif
• Untaian merah muda adalah protein terdenaturasi yang tercangkup dalam
SDS bermuatan negative
• Berbagai ukuran untaian berkeliling menuju ke positif
• Untaian ini melewati terowongan dan dipisahkan oleh ukurannya
• Jika protein didenaturasi dan dimasukkan ke
dalam medan listrik (saja), mereka semua akan
bergerak menuju kutub positif dengan
kecepatan yang sama, tanpa pemisahan
berdasarkan ukuran.
• Namun, jika protein dimasukkan ke dalam
lingkungan yang memungkinkan protein
dengan ukuran berbeda bergerak dengan
kecepatan berbeda.
• Lingkungannya adalah poliakrilamida
• Seluruh proses ini disebut elektroforesis gel
poliakrilamida (PAGE). Molekul kecil bergerak
melalui hutan poliakrilamida lebih cepat
daripada molekul besar, molekul besar tetap
berada di dekat sumur
Untuk membuat protein dapat diakses oleh deteksi
antibodi, protein dipindahkan dari dalam gel ke
membran yang terbuat dari nitroselulosa atau
polivinilidena difluorida (PVDF). Membran ditempatkan
di atas gel, dan setumpuk kertas saring ditempatkan di
atasnya. Seluruh tumpukan ditempatkan dalam larutan
buffer yang menggerakkan kertas dengan aksi kapiler,
membawa protein bersamanya. Metode lain untuk
mentransfer protein disebut elektrobloting dan
menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel
ke membran.
 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA adalah salah satu uji serologis yang dapat digunakan untuk mengukur
antigen/antibodi. Prinsip utama teknik ELISA adalah penggunaan indikator enzim
untuk reaksi imunologi.
Keunggulan ELISA diagnostik yang :
• Sangat banyak digunakan pada laboratorium diagnostik\
• Teknik ini dapat memeriksa keberadaan antigen(identfikasi Ag) maupun
antibodi baik secara kualitatif (pos/neg) maupun kuantitatif (titer)
• Ekonomis (tidak mahal), cepat, spesifik
• sensitive (pg/ml)
• Tidak memerlukan alat yang mahal (kalau ada bisa membantu seperti :
automatic washer, soft ware computer!)
 Alat dan Bahan yang diperlukan untuk
pengujian ELISA
Alat :
1. ELISA plate
2. Record Sheet
3. Antigen/antibodi yang akan dicoatingkan
4. Dilution Tubes
5. Pipets and tips
6. Sampel yang akan diperiksa (serum atau antigen)
7. Positive control
8. Negative control
9. Wasing buffer (PBS-Tween 20 0,05%)
10. Conjugate (secondary antibody)
11. TMB Substrate
12. Stop solution
FORMAT DASAR PLATE YANG DIGUNAKAN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A
B
C
D
E
F
G
H

Solid phase = 96 / 384-well microplate POLYSTIRENE/POLYVINYL ( mengikat protein yang

dimasukkan)
 Persiapan yang harus dilakukan sebelum melakukan
uji :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 • Disiapkan Record
Sheet untuk
A mencatat sampel
yang dimasukan dan
B hasil pembacaan OD
C
• Catat tgl
D pemeriksaan
E ,no plate, jenis
sampel yang
F diperiksa,pemeriksa
G
H
 Prosedur yang dilakukan :

• Melapisi Pelat
Gunakan 100-200 µl antigen pada konsentrasi 1-5 µg / ml di PBS, pH 7,4 (dapar
1) atau 0,1 M NaHCO3, pH 9,6 (dapar 2). Tambahkan ke setiap lubang pelat
mikrotiter polivinil atau polistiren. Inkubasi pada suhu 4oC semalaman. Untuk
uji penangkapan, gunakan 100-200 µl pada konsentrasi antibodi atau 5-10 µg /
ml.
1. Lapisi fase padat dengan
antigen saat menganalisis antibodi
antibodi saat menganalisis antigen

Analyte = antibody Analyte = antigen

Incubate, wash
2. Memblokir situs mengikat garis. Incubate. Wash.

Analyte = antibody Analyte = antigen

3. Add sample. Incubate. Wash

Analyte = antibody Analyte = antigen

4. Add conjugate. Incubate. Wash.

E E E E

Analyte = antibody Analyte = antigen

5. Add substrate

6. Incubate, stop, mengukur perubahan warna

ENZYME

Colourless

OD

CONCENTRATION
Immunohistochemistry (IHC)
Termasuk deteksi antigen pada bagian jaringan dan sel menggunakan antibodi
monoklonal dan poliklonal. Deteksi melalui visualisasi antigen menggunakan
mikroskop.
Immunohistochemistry (IHC)
Merupakan gabungan antara imunologi, histologi dan sitologi, jika diambil dari
kata immuno yang artinya antigen/antibodi, kata histo berarti sebuah jaringan,
dan chemistry/kimia/sitology berarti adanya reaksi kimia didalam prosesnya.
Adapun protocol dari pewarnaan Immunohistochemistry (IHC) Staining adalah sebagai berikut:
• Deparafinisasi dan Rehidrasi
Proses dewaxing dan rehydration reagen menggunakan Ez-DeWaxTM Solution 3 change,3 min each.
Bebas dari xylene atau xylene substitusi
• Antigen retrieval
Proses untuk mengembalikan komponen protein/antigen yang tertutup pada saat proses fiksasi.
Pengaturan waktu dan kontrol suhu. Cairan yang digunakan adalah EZ-ARTM Solution. Dengan waktu
15 menit dalam suhu 95 derajat C
• Peroxidase blocking
Proses pembilasan dengan phosphate buffered saline (HK091-5K)
• Power block
Proses bloking peroksida 2 tetes dengan waktu 10 menit dengan suhu ruang 20-25°C
• Antibodi primer
biogenex memiliki sekitar 400 antibodi yang tersedia, ditetesi kemudian diamkan selama 30 menit
pada suhu ruang 20-25°C. setelah 30 menit dibilas lagi dengan PBS
• Super enhancer
Proses ini akan meningkatkan reaksi antara antigen dan antibodi, setelah ditetesi ditunggu selama
20 menit dalam suhu ruang 20-25°C kemudian dibilas kembali menggunakan PBS
• Antibodi sekunder
Selanjutnya preparat ditetesi dengan enzyme peroxidase ditunggu selama 30 menit dengan suhu
ruang 20-25°C selanjutnya dibilas lagi dengan PBS
• Kromogen
Selanjutnya ditetesi dengan chromogen DAB:HK130-5K dan AEC:HK139-06K selama 5 menit pada
suhu ruang 20-25°C, proses ini akan menghasilkan warna coklat. kemudiian dibilas dengan PBS
• Counter stain
Pada step ini ditetesi dengan hematoxylin: dengan waktu 1-3 menit pada suhu ruang 20-25°C, bilas
lagi dengan PBS
• Aquenos Mount
Terahir preparat di cover dengan coverslip, kemudian preparat siap diamati di mikroskop.
 Polymerase Chain Reaction

• Definisi: teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu

secara enzimatis melalui mekanisme perubahan suhu
• PCR membuat copy suatu gen (DNA) dalam jumlah yang banyak sekali
untuk memungkinkan mengidentifikasi gen tersebut melalui
elektroforesis dan sequencing.
 3 langkah utama dalam PCR :

• Langkah 1.
Denaturasi pada 94ºC, dimana DNA serabut ganda terurai
menjadi serabut tunggal, dan semua reaksi yang diperantarai
enzim berhenti (misalnya extension dari siklus sebelumnya).
–Denaturasi tidak lengkap---- renaturasi secara cepat,
–denaturasi yang terlalu lama ---- mempengaruhi kerja enzim Taq
polymerase.
• Langkah 2.
Annealing (penempelan) pada 54ºC, dimana primer terputar-
putar oleh gerakan Brown lalu menempel pada template
melalui ikatan ionik. Bila terjadi penempelan yang kuat
ikatannya, maka ikatan itu sifatnya stabil lalu enzim polymerase
melekat dan membuat copy dari template.
• Langkah 3.
Extension (perpanjangan) pada 72ºC yang merupakan temperatur
yang ideal untuk enzim polymerase.
Faktor yang berpengaruh:
• Buffer
• PH
• konsentrasi garam
• molekul DNA target.