PENENTUAN WAKTU RETENSI PARACETAMOL DAN EFISISENSI

KOLOM DENGAN MENGGUNAKAN HPLC

I. Tujuan

1. Mahasiswa mengetahui prinsip dasar analisa sampel dengan alat HPLC.

2. Mahasiswa dapat menentukan waktu retensi larutan standar paracetamol
3. Mahasiswa dapat menentukan efisiensi dari kolom HPLC.
4. Melatih mahasiswa membuat persamaan regresi dari pengukuran HPLC.

II. Dasar Teori

KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian ( impurities)
dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT
paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino,asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan
fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-
lain(Cresswell, 2005).
Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pemanasan
dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic
teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang
mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer.
Kelebihan KCKT antara lain:
1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.
2. Resolusinya baik.
3. Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi.
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.
5. Dapat digunakan bermacam-macam detector.
6. Kolom dapat digunakan kembali.
7. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar.
8. Ideal untuk molekul besar dan ion.
9. Dapat dilakukan pada suhu kamar
10. Mudah dioperasikan secara otomatis.
 Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan
lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit
diperoleh. Berikut skema kerja alat yang digunakan dalam HPLC (Supardani
2011).
Larutan sampel yang akan dianalisis diinjeksi kemudian sampel akan
turun ke dalam kolom dan di elusi oleh eluen yang disediakan. Lalu detector
akan mendeteksi waktu retensi dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram
itu kita dapat meganalisis sampel (Ibnu Ghalib, 2012).
HPLC memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh bahkan untuk
komponen-komponen yang berhubungan sangat erat; pemisahan penukar ion
yang sukses dari logam tanah yang langka dan asam-asam amino telah
memperlihatkan ini. Komposisi fase gerak dalam HPLC memberikan suatu
dimensi untuk memanipulasi eksperimen yang tidak dijumpai dalam
kromatografi gas.
Dalam kromatografi gas faktor pemisahan untuk sepasang komponen
sampel tergantung pada sifat dasar stationer, sedangkan dalam HPLC faktor itu
juga bergantung pada fase gerak. Seringkali pelarut campuran merupakan fase
gerak yang lebih baik dari cairan murni untuk memisahkan senyawa rumit dan
pengoptimasian komposisi pelarut dengan cara coba-coba dapat menjadi lebih
rumit (Khopkar, 1990).
Pemilihan detektor pada HPLC umumnya didasarkan pada persyaratan
sensitivitas, jenis senyawa yang ada di dalam sampel dan faktor lainnya seperti
biaya. Detector yang paling umum didasarkan pada indeks bias dan eluat
kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan
indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni (Day, 2002).

Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase
gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder. 
1. Tandon (Reservoir)
Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi
untuk gas terlarut dalam solven. Degassing dilakukan dengan mengalirkan
gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Degassing
 dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan
pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum.
2. Pompa 
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke
dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus
memenuhi persyaratann seperti dapat memberi tekanan sampai 6000 psi
(360 atm), tekanan yang dihasilkan bebas pulsa, dapat mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit, dapat mengalirkan fase
gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi, tahan terhadap korosi (biasanya
terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain : 
a. Reciprocating pump
b. Displacement Pump
c. Pneumatic Pump
3. Katup Injector
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk
selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4. Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan
analisis sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk
memisah-misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom
terbuat dari stainless steel yang dibor halus atau dari gelas. Ada dua jenis
packing kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu
berupa partikel porous dan partikel pelliculer. 
5. Detektor 
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya
akan terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-
beda. Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan
melewati suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang
digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis yaitu :
a. Detektor UV
 b. Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi.
Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Panjang
gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. 
c. Detektor Fluoresensi
d. Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Detektor ini
lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser
akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Derivatisasi
sering dilakukan terhadap asam amino. 
e. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)
f. Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel
dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias
yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk
hampir semua zat. 
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor
kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan.
Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC
dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas
kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya. 
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar
senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode
HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya
adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari
awal kolom sampai ke detektor”. Semakin lama analit berinteraksi dengan
fase diam, semakin lama ia keluar tR semakin besar. Sehingga ada suatu
konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam.
Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan
distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas
relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak : Kd = Kadar senyawa
dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak
III.Prosedur Kerja
3.1 Alat Dan Bahan
1. Alat
a. Peralatan HPLC
b. Spatula
c. Labu ukur 50 ml
d. Labu ukur 10 ml
e. Neraca analitik
f. Corong
g. Pipet tetes
h. Gelas ukur 50 ml
i. Ultrasonic vibrator
j. Pipet gondok (1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, dan 5 ml)
k. Ball fillter
l. Filter membran selulosa nitrat
m. Botol vial, dll

2. Bahan
a. Kafein standar
b. Asetolnitril
c. KH 2 PO 4
d. Isopropil alkohol
e. Metanol
f. Aquadest
g. Aquabides
h. Keras saring, dll
.2 Cara Kerja
1. Pembuatan Fase Gerak
Sebanyak 420 ml KH 2 PO 4 0,01 M, ditambahkan metanol 20 ml,
ditambahkan asetonitril 30 ml, ditambahkan isopropil alkohol 30
ml. Disaring menggunakan membran whatman filter PTFE 0,2
µm, disonikasiselama 15 menit.
2. Pembuatan Larutan Induk Kafein
12,5 mg kafein p.a dimasukan kedalam labu ukur 50 ml.
Kemudian tambahkan pelarut smpai tanda batas disonifikasi
selama 15 menit.
3. Kondisi Analisis Dengan HPLC
Fase gerak: KH 2 PO 4 0,01 M 420 ml, 20 ml metanol, asetonitril
30 ml dan 30 ml isopropil alkohol. Kolom: C-18. Panjang
gelombang 215 nm. Laju alir 1ml/menit. Volume injeksi 20 µm.
4. Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein
Pipet larutan induk kafein masing-masing sebnyak 1ml, 2ml, 3ml,
4ml, 5ml, dan 6 ml. Masukan kedalam labu ukur 10 ml.
Dilarutkan sampai tanda batas. Lakukan sonikasi masing-
masingnya selama 5 menit.
5. Pengukuran Deret Larutan Standar
Masing-masing deret larutan standar diukur dengan HPLC dengan
kondisi yang telah ditentukan diatas. Catat data hasil pengukuran
dan buat persamaan regresi dari deret laruan standar tersebut.
Hasil kromatogram yang didapatkan dilakukan perhitungan faktor
kapasitas, selektivity, N (nilai plat teori), dan HETP nya untuk
menentukan efisiensi dari kolom yang diginakan.
4.2 Pembahasan
Sampel obat yang digunakan adalah paracetamol. Adapun jenis prisip
dasar dari HPLC pada pratikum kali ini adalah adanya perbedaan kofesien
distribusi antara komponen fase gerak dan fase diam. Pada pratikum kali ini
menggunakan fase terbalik, karena fase diam yang digunakan bersifat
nonpolar yaitu C-18 dan fase gerak yang digunakan adalah asetonitril yang
bersifat polar. Langkah pertama yang dilakukan adalah membuat larutan
induk paracetamol. Untuk melarutkan paracetamol pelarut yang digunakan
adalah campuran yang tidak berwarana. Pelarut yang digunakan di
kombinasikan komposisinya bertujuan untuk memberikan faktor kapasitas
yang cocok sehingga faktor human dapat di hindari.
Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fase gerak
HPLC yaitu: jernih, murah, mudah di peroleh, dan tidak kental. Prosses
degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan
gelembung-gelembung gas pada larutan induk. Karena denan adanya gas
dalam larutan sampel dapat menghambat pergerakan eluen sehingga
trganggunya pemisahan pada kolom karena larutan sampel tidak merata dan
dapat menyebabkan terjadinya pelebaran puncak kromatogram. Selain itu
penghilangan gas ini juga di perlukan untuk menghindari noise pada detektor.
Langkah berikutnya yaitu pembuatan larutan standar. Pembuatan
larutan standar bertujuan untuk menentukan kurva kalibrasi parecetamol.
Kurva kalibrasi sebagai pembanding. Variasi konsentrasi yang digunakan
untuk paracetamol berturut-turut adalah 1ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4ppm, 5 ppm,
6 ppm. Pembuatan larutan standar tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh
karena itu penimbangan larutan baku paracetamol harus tepat dan juga
pemipetan larutan induk juga harus tepat, pengenceran larutan baku menjadi
larutan standar harus pas samapai tanda batas. Pembuatan maing-masing
konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan untuk mencegah terjainya
kekeliruan. Larutan standar di injeksi secara berurutan dari konsentrasi
rendah samapi konstrasi tinggi.
Kolom yang digunakan pada pratikum ini adalah C-18 yang bersifat
non polar dan merupakan hasil reaksi antara silika dengan alkilklorosilans
dimana gugus alkilnya adalah n-oktadesil. Fasa diam tersebut terikat pada
fasa pendukung yaitu silika, dalam hal ini fase diam lebih non polar dari pada
fase geraknya . fasa diam yang digunakan pada HPLC harus tahan terhadap
tekanan tinggi, karena apabila digunakan struktur dengan pori yang tinggi
maka mudah rusak. Hal ini disebabkan karena menurunya permeabilitas
akibat tekanan tinggi.
Dalam pengelusian, parecetamol terelusi lebih awal dengan waktu
retensi yang lebih pendek karena molekul paracetamol dalam campuran akan
menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut sehingga
akan keluar terlebih dahulu dan mempunyai waktu retensi yang kecil.
Detektor yang digunakan pada peralatan HPLC ini adalah spektrofotometer
UV, karena ada gugus kromofor pada sampel.
Analisa kualitatif dilakukan engan membandingkan waktu retensi
sampel paresetamol dengan larutan standar. Waktu retensi sampel 3.047
menit sedangkan waktu retensi larutan standar yang di dapat 3,047 menit.
Analisa kualitatif dari penukuran di peroleh dari luas area puncak dalam
komatogram yang memiliki waktu retensi yang sama.
Pengukuran larutan standar dengan meningkatnya konsentrasi di
peroleh luas area yang meningkat pula. Nilai r yang didapat kan adalah
0,9956 ini menendakan kalau larutan yang di buat bagus atau sempurna.
Semakin tinggi konsentrasi yang di berikan maka niai N dan nilai HETP juga
mengalami kenaikan hal ini di sebabkan karena konsentrasi yang di berikan.
V. Kesimpulan dan Saran
5.1 Kesimpulan
1. HPLC adalah metoda analisis kualitatif dan analisis kuantitatif
dengan memisahkan suatu senyawa menggunakan fasa gerak
berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan tinggi dengan
kolom sebagai fasa diam.
2. Puncak yang paling bagus didapatkan oleh kelompok 1 dengan
nilai N = 13000,26 dan HETP = 0,0192. Sedangkan puncak yang
paing rendah pada keompok 2 dengan nilai N = 4245,77 dan
HETP = 0,0588. Karena, semakin tinggi nilai N, maka
mendapatkan puncak yang bagus dengan nilai HETP semakin
kecil.
3. Fasa gerak yang digunakan asetonitril bersifat polar dan fasa
diam yang digunakan kolom C18 yang bersifat non polar.

5.2 Saran

1. Dilakukan percobaan dengan teliti dan hati-hati terutama dalam

memipetkan suatu larutan/cairan.
2. Alat-alat yang digunakan sebaiknya dibersihkan terlebih dahulu,
agar tidak terdapat sisa zat-zat alat yang digunakan.
 Daftar Pustaka

Cresswell, Clifford.J. 2005. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung: ITB

Hayun, Ibnu Ganjar Dan Abdul Rahman. 2006. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Belajar
Ibnu Ghalib. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Belajar 
Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press: Jakarta
R.A.Day, Dr Jan Dan Al - Underwood. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Jakarta:
Erlangga
Sumar, Hendayana. 1994. Parasetamol. Jakarta: UI Press Supardani. 20011. Ilmu
Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia: Jakarta.