REVISI

MODUL PRAKTIKUM

BAKTERIOLOGI SEMESTER II
TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

TIM PENYUSUN :

NYOMAN MASTRA, S.KM., S.Pd., M.Si

I NYOMAN JIRNA, S.KM., M.Si
BURHANNUDDIN, S.Si., M.Biomed

KEMENTERIAN KESEHATAN R I
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES DENPASAR
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
TAHUN 2021
 KATA PENGANTAR

Dengan mengucapkan “Astungkara “, maka penyusunan Modul Praktikum

Bakteriologi Untuk Mahasiswa Program Studi D. III Teknologi Laboratorium Medis
Semester Genap ( II ) yang direvisi dapat diselesaikan dengan baik. Adanya modul
praktikum ini, semoga mahasiswa serta tim pembimbing praktikum khususnya Mata Kuliah
Bakteriologi dapat memanfaatkannya
Bakteriologi ini merupakan mata kuliah berdasarkan Kurikulum Teknologi
Laboratorium Medis ( TLM ) Tahun 2014 diberikan selama dua semester dari Semester
Genap dan Gasal ( II, III, ) dengan jumlah SKS adalah 2 SKS teori dan 4 SKS praktikum
setiap tahun akademik, disamping itu Bakteriologi merupakan mata kuliah yang diujikan
dalam Uji Kompetensi, untuk itu dengan adanya modul praktikum ini menjadi pegangan
bagi mahasiswa dalam menyiapkan diri sebelum ujian akhir semester
Akhir kata saya ucapkan terimakasih kepada tim penyusun Modul Praktikum
Bakteriologi Semester Genap ( II ), semoga apa yang dihasilkan akan bermanfaat bagi
civitas akademika

Denpasar, Januari 2021

KetuaJurusan

Cok. Dewi Widhya HS, S.KM., M.Si

NIP. 19690621 199203 2 004
 DAFTAR ISI

Hal.
JUDUL …………………………………………………………………………… i
KATA PENGANTAR …………………………………………………………… ii
DAFTAR ISI …………………………………………………………………… iii
BAB I KEAMANAN KERJA DI LABORATORIUM BAKTERIOLOGI … 1
BAB II MEDIA PEMBIAKAN KUMAN …………………………………… 5
BAB III PENGECATAN SEDERHANA …………………………………… 11
BAB IV PENGECATAN GRAM .…………………………………………… 14
BAB V PENGECATAN BASIL TAHAN ASAM …………………………… 17
BAB VI PEMERIKSAAN ANGKA KUMAN ……………………………… 21
BAB VII PEMERIKSAAN MOST PROBABLE NUMBER ………………… 27
BAB VIII CARA PENGAMBILAN SAMPEL AIR …………………………… 36
BAB IX KOEFISIEN FENOL ………………………………………………… 38

BAB I
KEAMANAN KERJA DI LABORATORIUM BAKTERIOLOGI

PENDAHULUAN
Laboratorium bakteriologi adalah tempat untuk melakukan kegiatan praktikum atau
penelitian dengan mikroba sebagai objek kajian. Bekerja di laboratorium bakteriologi
memiliki potensi bahaya, baik dari bahan biologis (biakan kuman, specimen klinis), kimia
(zat warna, bahan asam), ataupun fisika (api, arus listrik, benda tajam). Oleh karena itu
semua pengguna laboratorium bakteriologi, hendakya memahami dan menyadari hal-hal
yang dapat membahayakan keselamatan dirinya atau orang-orang disekitarnya.
Saat ini laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan telah dilengkapi
fasilitas keamanan dan keselamatan kerja, yaitu Biological Safety Cabinet (BSC). BSC
merupakan peralatan yang dapat melindungi pekerja dari transmisi organisme lewat udara
(aerosol). Berbagai prosedur yang dapat menimbulkan aerosol dan penanganan spesimen
sampel mikrobiologi sebaiknya ditangani dalam BSC.
BSC yang ada dilaboratorium bakteriologi jurusan Analis Kesehatan termasuk BSC
Kelas II. BSC kelas II merupakan Biological Safety Cabinets yang melindungi personil,
produk, dan lingkungan. BSC ini memiliki aliran udara masuk untuk melindungi personil,
aliran udara ke bawah dari HEPA filter menuju area kerja untuk melindungi produk, dan
kemudian aliran udara keluar melalui HEPA filter untuk melindungi lingkungan dari
partikel atau aerosol berbahaya. Perlindungan terhadap personil karena adanya aliran udara
tekanan negatif ke dalam kabinet. Untuk melindungi produk, area kerja secara kontinyu
dialiri udara bersih yang berasal dari HEPA filter.
Sebelum bekerja di laboratorium bakteriologi diharapkan seluruh pengguna
laboratorium memahami cara pengoperasian BSC dan prosedur bekerja di dalam BSC.
Pengguna laboratorium juga diharapkan memahami cara perawatan BSC agar alat ini dapat
terus berfungsi dengan baik. Praktikan sebelum bekerja di dalam BSC akan dijelaskan dan
didampingi cara penggunaan BSC oleh instruktur di laboratorium.

TUJUAN PEMBELAJARAN
Setelah membaca materi pada bab ini, mahasiswa diharapkan mampu :
1. Memahami berbagai potensi bahaya di laboratorium bakteriologi
2. Memahami prosedur keamanan kerja di laboratorium bakteriologi
3. Memahami dan dapat melakukan tindakan yang harus dilakukan jika terjadi kecelakaan
di dalam laboratorium

PEDOMAN UMUM
Berikut adalah peraturan keselamatan dasar yang harus selalu diperhatikan selama praktik
di laboratorium bakteriologi :
1. Saat memasuki laboratorium, letakkan jaket, buku-buku, dan perlengkepan lainnya
pada tempat yang telah ditentukan, jangan diletakkan di atas meja kerja.
2. Tutup pintu dan jendela selama sesi laboratorium berlangsung untuk mencegah
kontaminasi dari aliran udara.
3. Pada setiap permulaan dan akhir sesi laboratorium, bersihkan permukaan meja kerja
dengan larutan disinfektan yang disediakan oleh instruktur.
4. Jangan meletakkan alat-alat yang telah terkontaminasi seperti ose, jarum, dan pipet
inokulasi di atas meja kerja. Ose dan jarum harus disterilkan dengan dibakar.
5. Pada akhir sesi laboratorium, tempatkan seluruh biakan dan bahan-bahan pada tempat
pembuangan yang telah ditentukan oleh instruktut
6. Percobaan dengan biakan jamur harus dilakukan dengan cepat dan efisien untuk
mencegah diseminasi (penyebaran spora) reproduktif jamur-jamur itu dalam
lingkungan laboratorium
7. Cuci tangan anda dengan deterjen cair dan keringkan dengan kertas tissue saat akan
memasuki dan sebelum meninggalkan laboratorium
8. Gunakan penutup kepala kertas atau ikat rambut yang panjang ke belakang untuk
meminimalkan risiko terbakar atau terkena panas api.
9. Gunakan jas laboratorium selama bekerja di laboratorium
10. Gunakan sepatu tertutup selama bekerja di laboratorium
11. Jangan menggunakan kosmetik atau memasang lensa kontak di dalam laboratorium
12. Jangan merokok, makan, atau minum di dalam laboratorium
13. Bawalah biakan dengan menggunakan rak tabung uji saat berpindah tempat di
lingkungan laboratrium.
14. Jangan memindahkan media, peralatan, perlengkapan atau terutama biakan bakteri ke
luar laboratorium.
15. Segera tutup biakan yang tumpah atau tabung biakan yang pecah dengan menggunakan
kertas tisu, kemudian jenuhkan kertas dengan larutan disinfektan. Setelah 15 menit
angkat kertas tisu tersebut dan buang pada tempat dan dengna cara yang telah
ditetapkan oleh instruktur.
16. Segera laporkan kecelakaan tersayat atau terbakar kepada instruktur.
17. Jangan memipet biakan kaldu atau pereaksi kimia dengan mulut. Pemipetan hanya
boleh dilakukan dengan bantuan alat pemipet mekanis.
18. Jangan menjilat label. Gunakan label yang dapat menempel sendiri untuk
mengidentifikasi biakan percobaan
19. Bicaralah dengan suara pelan dan hindari aktivitas yang tidak perlu di lingkungan
laboratorium untuk menghindari gangguan yang dapat mengakibatkan kecelakaan.
20. Sarung tangan sekali pakai harus selalu digunakan selama bekerja dengan bahan-bahan
uji.
21. Segera cuci tangan jika terjadi kontak dengan bahan cair dan juga setelah melepas
sarung tangan.
22. Masker, kaca mata pengaman, dan jas laboratorium harus digunakan jika ada
kemungkinan terbentuk aerosol atau dapat terjadi percikan cairan.
23. Cairan tubuh yang tumpah/terpercik harus didekontaminasi dengan larutan pemutih 1 :
10, tutup dengan kertas tisu, dan biarkan selama 10 menit untuk bereaksi sebelum
dibuang.
24. Specimen uji dan bahan yang berkontak dengan cairan tubuh tersebut harus
ditempatkan dalam wadah berisi desinfektan sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf
dan disterilkan.
 BAB II
MEDIA PEMBIAKAN KUMAN

PENDAHULUAN

Berbagai jenis media pertumbuhan bakteri lazim digunakan untuk tujuan isolasi,

transportasi, persemaian, dan diferensiasi. Untuk menunjang pertumbuhan yang optimal,

bakteri membutuhkan nutrisi yang amat beragam. Sebagian bakteri dapat tumbuh dalam

medium yang hanya mengandung zat anorganik, sedangkan bakteri tertentu memerlukan

tambahan asam amino, vitamin, dan zat organik lain untuk pertumbuhannya. Media

pembiakan bakteri umumnya terdiri dari ekstrak daging, ekstrak ragi, pepton, dan agar.

Berdasarkan konsistensinya, media pembiakan dapat dibedakan menjadi media cair, media

padat, dan semisolid. Kaldu nutrisi (pepton dan ekstrak daging) dan agar nutrisi (pepton,

ekstrak daging, dan agar) merupakan contoh media cair dan padat yang sering digunakan.

Berbagai komponen dapat ditambahkan ke dalam medium untuk menghasilkan medium

dengan sifat tertentu. Sebagai contoh, penambahan zat warna dapat digunakan untuk

indikator aktivitas metabolisme bakteri.

Berdasarkan fungsinya media pembiakan bakteri dapat diklasifikasikan menjadi media

umum, media pengaya, media transport, media selektif, dan media selektif/diferensial.

TUJUAN PEMBELAJARAN

1. Mengenal berbagai media untuk pembiakan bakteri.

2. Memahami penggunaan dan fungsi media terspesialisasi untuk seleksi dan diferensiasi

mikroorganisme.

3. Mengerti bagaimana suatu media yang diperkaya seperti agar darah juga dapat berfungsi

baik sebagai media selektif maupun diferensial.

PRINSIP

Beberapa media yang bertujuan khusus tersedia untuk fungsi seperti berikut :

1. Isolasi jenis-jenis bakteri dari populasi mikrooganisme campuran

2. Diferensiasi kelompok-kelompok bakteri yang berkaitan erat berdasarkan tampilan

koloni-koloni secara makroskopik dan reaksi-reaksi biokimia di dalam media

3. Penghitungan bakteri pada mikrobiologi sanitari, seperti di air dan sampah, dan juga

pada makanan, dan produk susu lainnya

4. Pengujian senyawa-senyawa yang terdapat di alam, seperti antibiotik, vitamin, dan

produk fermentasi industry

5. Karakterisasi dan identifikasi bakteri berdasarkan kemampuannya menghasilkan

perubahan kimia dalam media yang berbeda-beda.

MEDIA UMUM

Media ini digunakan untuk menumbuhkan mikroba secara umum. Kandungan yang

terdapat pada media memungkinan berbagai mikrooganisme untuk tumbuh, seperti Nutrien

Agar (NA) atau Nutrien Broth (NB)

MEDIA TRANSPORT

Media transport merupakan media yang digunakan untuk transport specimen dari

pengambilan ke laboratorium. Media ini digunakan untuk menunda pertumbuhan

mikroorganisme dalam batas tertentu, yang tidak mematikan dan mengembangbiakkan.

Contoh : Media Carry and Blair

MEDIA SELEKTIF

Media ini digunakan untuk mengisolasi kelompok-kelompok bakteri tertentu karena

dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain secara selektif. Media-media tersebut

mengandung zat-zat kimia yang menghambat pertumbuhan satu jenis bakteri dan

memungkinkan pertumbuhan bakteri lainnya sehingga memudahkan isolasi bakteri. Contoh

media selektif antara lain :

1. Salmonella-Shigella Agar, untuk mengisolasi bakteri Salmonella-Shigella

2. Agar feniletil alcohol, untuk mengisolasi sebagian besar organisme gram positif.

Feniletil alcohol dapat menghambat sebagian pertumbuhan bakteri gram negative.

3. Agar kristal violet, untuk mengisolasi sebagian besar bakteri gram negative.

4. Pewarna Kristal violet memberikan efek penghambatan pada sebagian besar organism

gram positif

5. Agar NaCl 7.5 %. Media ini menghambat kebanyakan organism, kecuali

mikroorganisme halofilik. Media ini paling bermanfaat dalam pendeteksian anggota-

anggota genus Staphylococcus.

MEDIA SELEKTIF/DIFERENSIAL

Media ini dapat membedakan kelompok-kelompok organisme yang berkaitan erat

secara morfologis dan biokimia. Media-media tersebut mengandung zat-zat kimia yang

setelah inokulasi dan inkubasi, menghasilkan suatu perubahan karakteristik pada tampilan

pertumbuhan bakteri dan/atau media di sekeliling koloni, yang memungkinan diferensiasi.

Contoh media selektif diferensial antara lain : Mac Conkey Agar (MCA), Manitol Salt

Agar (MSA), dan Eosin Metilen Blue (EMB)

MEDIA YANG DIPERKAYA

Media yang diperkaya merupakan media yang telah ditambahkan dengan bahan-

bahan bernutrisi tinggi, seperti darah, serum, atau ekstrak khamir, untuk tujuan kultivasi

organism-organisme sekektif, misalnya Agar Darah. Darah yang dimasukkan ke dalam

media ini merupakan bahan pengayaan untuk kultivasi organism-organisme selektif, seperti

Streptococcus sp. Darah juga memungkinkan terjadinya sifat hemolitik dari berbagai

mikroorganisme, terutama Streptococcus, yang aktivitas hemolisisnya diklasifikasikan

sebagai berikut :

1. Hemolisis gamma, tidak terjadi lisis sel-sel darah sehingga tidak ada perubahan yang

signifikan pada tampilan media di sekeliling koloni

2. Hemolisis alfa, terjadi lisis sel-sel darah secara tidak sempurna, dengan reduksi

hemoglobin menjadi metemoglobin, menghasilkan suatu halo berwarna kehijauan di

sekelling pertumbuhan bakteri.

3. Hemolisis beta, terjadi lisis sel-sel darah merah dengan penghancuran yang sempurna

dan penggunaan hemoglobin oleh organism yang menghasilkan zona jernih di sekeling

koloni.

Tabel 2. Kegunaan Berbagai Medium Untuk Pembiakan Bakteri

MEDIA AGAR PADAT (1,5 – 2 % AGAR)

No Media Kegunaan
1 Agar Nutrien Mengasingkan/mempelajari koloni bakteri
2 Agar Darah Membiakkan bakteri yang memerlukan nutrisi tinggi
dan melihat adanya reaksi hemolisis
3 Agar Cokelat Thayer Medium selektif untuk membiakkan Neisseria sp
Martin
4 Agar Endo Medium selektif untuk membiakkan bakteri enterik
5 Agar Eosin Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan
Methylene Blue bakteri enteric
(EMB)
6 Agar Salmonella- Medium selektif dan diferensial untuk untuk
 Shigella membiakkan Salmonella dan Shigella
7 Serum Loeffler Membiakkan Corynebacterium diptheriae
8 Agar Thiosulphate Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan
Citrate Bile Sucrose Vibrio cholerae dan Vibrio sp. lainnya.
(TCBS)
9 Triple Sugar Iron Melihat kemampuan bakteri dalam meragi gula-gula
Agar (TSIA) dan membentuk H2S
10 Agar darah telurit Medium selektif untuk membiakkan
Corynebacterium sp
11 Lowenstein jensen Membiakkan Mycobacterium sp

MEDIA AGAR SEMISOLID (0,5 % AGAR)

1 Media Kegunaan
1 Semisolid/SIM Melihat gerak bakteri dan dapat juga digunakan
untuk melihat reaksi indol

MEDIA CAIR
1 Media Kegunaan
1 Nutrien Broth Membiakkan, meremajakan bakteri
2 Kaldu Membiakkan atau membuat suspense bakteri
3 Air Pepton Membiakkan atau membuat suspense bakteri
4 Perbenihan Tarozzi Membiakkan bakteri anaerob
5 Perbenihan Perbenihan transport dan persemaian untuk bakteri
thioglikolat aerob dan anaerob
6 Selenit Cystein Broth Membiakkan bakteri enteric terutama untuk
(SCB) Salmonella sp.
7 Gula-gula Mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi gula.
Gula yang digunakan :
Glukosa (tutup tabung kapas berwarna kuning)
Laktosa (tutup tabung kapas berwarna ungu)
Manitol (tutup tabung kapas berwarna hijau)
Maltosa (tutup tabung kapas berwarna merah)
 BAB III
PENGECATAN SEDERHANA
I. Landasan Teori :

Pengecatan mempunyai maksud supaya sel-sel dan struktur sel-sel dapat dilihat
dengan jelas. Untuk itu harus dilakukan pemilihan cat, bahan penguat dan bahan pelentur
yang tepat.
Sejak tahun 1875 Weigert telah menggunakan cat aniline untuk pengecatan bakteri
dan sel-sel jaringan, kemudian menyusul Koch dan Ehrlich.
Menurut Ehrlich cat aniline dibedalan menjadi 4 macam yaitu cat anilne basa, asam, netral,
dan indifferent.
 Pengecatan sederhana adalah pengecatan yang dilakukan dengan menggunakan satu
macam cat. Lamanya pengecatan antara 1-3 menit, tergantung dari jenis cat yang
digunakan.

II. Tujuan Praktikum :

a. Terampil dalam pembuatan preparat
b. Melihat bentuk dan warna bakteri

III. Alat dan Bahan :

a. Alat : Ose, Lampu spiritus/ Lampu bunchen, Jembatan pengecatan,
b. Bahan - Cat :
1. Solutio Methyleen Blue
2. Loefler Methyleen Blue
3. Manson’s Methyleen Blue
Sebelum dipakai diencerkan terlebih dahulu 10x dan lamanya pengecatan 1
menit.
4. Carbol Gentian Violet ( Gram A )
5. Carbol Fuchin ( ZN A )
6. Minyak imersi / immersion oil
7. Air Garam fisiologis 0,85% ( NaCl 0,85% )/ Aquadest steril
8. Obyel Glass
9. Tisue

c. Bahan Pemeriksaan / sampel : Sputum ( dahak ), koloni bakteri, swab.

IV. Cara Kerja :

a. Bersihkan obyek glass dengan tissue untuk menghilangkan lemak yang ada.
b. Fiksasi obyek glass dengan melidah apikan di atas lampu spiritus lebih kurang 3 kali
dan bolak-balik
c. Pada ujung obyek glass ( seperti bunga es ) diisi nomor/ tanda yang disepakati dengan
pensil glass
d. Ambil ose dan fiksasi di atas lampu spiritus sampai merah, kemudian dinginkan
 e. Bila sampel cair, ambil dengan ose tersebut dan langsung dihapuskan pada obyek
glass secara merata dengan luas lbk 1 cm2
f. Bila sampel koloni, ambil NaCl dengan ose dan teteskan di atas obyek glass
secukupnya.
g. Ambil koloni bakteri dengan cara menggoreskan ose di dasar koloni tanpa melukai
media tumbuhnya.
h. Campur koloni tersebut dengan memutar ujun ose tersebut, sehingga koloni
bercampur secara merata.
i. Fiksasi sebentar di atas lampu spiritus agar lebih cepat keringnya.
j. Teteskan cat yang digunakan dengan menutup seluruh permukaan hapusan
k. Tunggu 1 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir tidak langsung dengan posisi
preparat miring
l. Preparat dikeringkan di udara / diangin-anginkan

V. Pembacaan :
a. Teteskan minyak imersi 1-2 tetes pada preparat
b. Tempatkan preparat di atas meja benda mikroskop secara benar
c. Atur obyektif dari mikroskop 10x dan okuler 10x
d. Atur okuler agar sejajar dengan ke dua mata
e. Cari lapang pandang dengan menaikkan atau menurunkan meja benda sampai ketemu
bayangan kasar berwarna sesuai warna cat yang digunakan
f. Bila sudah ketemu lapang pandang, naikkan kondensor dan pasang obyektif 100x,
perhatikan lapang pandang tersebut.

VI. Hasil Pembacaan :

Bentuk bakteri : Batang ( Basil ) , Kokus, Spiral dengan warna dasar sesuai cat yang
digunakan
 BAB IV
PENGECATAN / PEWARNAAN GRAM
I. Landasan Teori :

Pengecatan mempunyai maksud supaya sel-sel dan struktur sel-sel dapat dilihat
dengan jelas. Untuk itu harus dilakukan pemilihan cat, bahan penguat dan bahan pelentur
yang tepat.
Sejak tahun 1875 Weigert telah menggunakan cat aniline untuk pengecatan bakteri
dan sel-sel jaringan, kemudian menyusul Koch dan Ehrlich.
Menurut Ehrlich cat aniline dibedalan menjadi 4 macam yaitu cat anilne basa, asam, netral,
dan indifferent.
 Pengecatan Gram adalah pengecatan yang dilakukan dengan menggunakan lebih
dari satu jenis cat. Proses pengecatan Gram ini adalah pada waktu memasukkan cat gram A
maka semua bakteri akan berwarna violet, kemudian dengan gram B tidak terjadi
perubahan-perubahan karena lugol bersifat memperkuat cat gram A. Setelah dituangi cat
gram C bakteri yang gram negative akan melepaskan cat yang sudah diserap sehingga tidak
berwarna. Sedangkan yang gram positif tetap memegang cat yang sudah diserapnya, jadi
tetap berwarna violet.
Pengecatan dengan solution fuchsin/ safranin ( gram D ), bakteri yang gram
negative akan berwarna merah dan bakteri yang gram positif tetap berwarna violet karena
tidak mengambil warna merah dari fuchsin/ safranin.

II. Tujuan Praktikum :

a. Terampil dalam pembuatan preparat
b. Melihat bentuk dan warna bakteri gram negative dan bakteri gram positif

III. Alat dan Bahan :

a. Alat : Ose, Lampu spiritus/ Lampu bunchen, Jembatan pengecatan,
b. Bahan - Cat :
1. Gram A : carbol gentian Violet
2. Gram B : Lugol
3. Gram C : Alkohol 96%
4. Gram D : Solution Fuchsin / Safranin
5. Minyak imersi / immersion oil
6. Air Garam fisiologis 0,85% ( NaCl 0,85% )/ Aquadest steril
7. Obyel Glass
8. Tisue

9. Bahan Pemeriksaan / sampel : Sputum ( dahak ), koloni bakteri, swab.dll

IV. Cara Kerja :

a. Bersihkan obyek glass dengan tissue untuk menghilangkan lemak yang ada.
 b. Fiksasi obyek glass dengan melidah apikan di atas lampu spiritus lebih kurang 3 kali
dan bolak-balik
c. Pada ujung obyek glass ( seperti bunga es ) diisi nomor/ tanda yang disepakati dengan
pensil glass
d. Ambil ose dan fiksasi di atas lampu spiritus sampai merah, kemudian dinginkan
e. Bila sampel cair, ambil dengan ose tersebut dan langsung dihapuskan pada obyek
glass secara merata dengan luas lbk 1 cm2
f. Bila sampel koloni, ambil NaCl dengan ose dan teteskan di atas obyek glass
secukupnya.
g. Ambil koloni bakteri dengan cara menggoreskan ose di dasar koloni tanpa melukai
media tumbuhnya.
h. Campur koloni tersebut dengan memutar ujun ose tersebut, sehingga koloni
bercampur secara merata.
i. Fiksasi sebentar di atas lampu spiritus agar lebih cepat keringnya.
j. Tempatkan di atas jembatan pengecatan
i. Tuangkan cat Gram A sampai tertutup semua hapusan
ii. Tunggu 3 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir
iii. Tuangkan cat Gram B sampai tertutup semua hapusan
iv. Tunggu 45 detik selanjutnya dicuci dengan air mengalir
v. Tuangkan cat Gram C sampai tertutup semua hapusan
vi. Tunggu 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir
vii. Tuangkan cat Gram D sampai tertutup semua hapusan
viii. Tunggu 2 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir
ix. Keringkan preparat dengan kertas saring, udara panas atau dibiarkan kering
dengan sendirinya

V. Pembacaan :
a. Tempatkan preparat di atas meja benda mikroskop secara benar
b. Atur obyektif dari mikroskop 10x dan okuler 10x
c. Atur okuler agar sejajar dengan ke dua mata
d. Cari lapang pandang dengan menaikkan atau menurunkan meja benda sampai ketemu
bayangan kasar berwarna sesuai warna cat yang digunakan
 e. Teteskan minyak imersi 1-2 tetes pada preparat
f. Bila sudah ketemu lapang pandang, naikkan kondensor dan pasang obyektif 100x,
perhatikan lapang pandang tersebut.

VI. Hasil Pembacaan :

a. Bateri Gram Postif berwarna violet antara lain : Streptococcus, Mycobacterium
tuberculosis, Mycobakterium leprae, bakteri antrax, bakteri diphtheria, bakteri tetanus
b. Bateri Gram negative berwarna merah antara lain : bakteri typhus, bakteri Dysenteri,
Influenza, bakteri pest, bakteri gonococci, bakteri coli, bakteri cholera, dsb.

BAB V
PENGECATAN / PEWARNAAN SEDIAAN BTA ( BAKTERI TAHAN ASAM )
METODE ZIEHL NEELSEN ( ZN )

I. Landasan Teori :

Pengecatan mempunyai maksud supaya sel-sel dan struktur sel-sel dapat dilihat
dengan jelas. Untuk itu harus dilakukan pemilihan cat, bahan penguat dan bahan pelentur
yang tepat.
 Sejak tahun 1875 Weigert telah menggunakan cat aniline untuk pengecatan bakteri
dan sel-sel jaringan, kemudian menyusul Koch dan Ehrlich.
Menurut Ehrlich cat aniline dibedakan menjadi 4 macam yaitu cat anilne basa, asam, netral,
dan indifferent.
Pengecatan BTA adalah pengecatan yang dilakukan dengan menggunakan lebih
dari satu jenis cat. Proses pengecatan BTA ini adalah pada waktu memasukkan cat ZNA
dan dipanasi sampai menguap serta didiamkan selama 3-5 menit, maka semua bakteri akan
berwarna merah, kemudian dengan meneteskan ZNB dipertahankan 1-5 detik warna merah
dari pada hapusan akan hilang tetapi bakteri tahan asam akan tetap berwarna merah,
selanjutnya dengan meneteskan ZNC dipertahankan selama 1-2 menit dan dicuci dengan air
maka hapusan akan berwarna biru. Hasil dari pengecatan tersebut adalah bakeri tahan asam
berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam berwarna biru.

II. Tujuan Praktikum :

a. Terampil dalam pembuatan hapusan dan preparat
b. Melihat bentuk dan warna bakteri tahan asam

III.Alat dan Bahan :

a. Alat : Ose, Lampu Spiritus/ Lampu bunchen, Jembatan Pengecatan, Mikroskop
b. Bahan - Cat :
c. ZN A : Carbol Fuchsin 0,3 % dalam botol gelas berwarna coklat
d. ZN B : Asam alcohol ( HCl –Alkohol 3% dalam botol geas berwarna coklat
e. ZN C : Solution Methylene Blue 0,3 % dalam botol gelas berwarna coklat
f. Minyak imersi / immersion oil / Anisol
g. Air Garam fisiologis 0,85% ( NaCl 0,85% ) / Aquadest steril
h. Obyel Glass
i. Tisue
j. Lidi / Ose
k. Pinset
l. Drop pipet
m. Pengukur waktu / timer
 n. Bahan Pemeriksaan / sampel : Sputum ( dahak ) , Koloni bakteri

III. Cara Kerja Pembuatan Hapusan :

a. Bersihkan obyek glass dengan tissue untuk menghilangkan lemak yang ada.
b. Fiksasi obyek glass dengan melidah apikan di atas lampu spiritus lebih kurang 3 kali
dan bolak-balik
c. Pada ujung obyek glass ( seperti bunga es ) diisi nomor/ tanda / kode yang disepakati
dengan pensil glass
d. Ambil ose dan fiksasi di atas lampu spiritus sampai merah, kemudian dinginkan
e. Bila sampel cair, ambil dengan ose tersebut dan langsung dihapuskan pada obyek
glass secara merata dengan luas lbk 1 cm2
f. Bila sampel koloni, ambil NaCl dengan ose dan teteskan di atas obyek glass
secukupnya.
g. Ambil koloni bakteri dengan cara menggoreskan ose di dasar koloni tanpa melukai
media tumbuhnya
h. Campur koloni tersebut dengan memutar ujung ose tersebut, sehingga koloni
bercampur secara merata.
i. Fiksasi sebentar di atas lampu spiritus agar lebih cepat keringnya.
j. Preparat / hapusan yang sudah siap tempatkan di atas jembatan pengecatan

IV. Cara Kerja Pewarnaan Metode Ziehl Neelsen ( ZN )

a. Letakkan hapusan dahak yang telah difiksasi pad arak/ jembatan pengecatan dengan
hapusan menghadap ke atas
b. Teteskan larutan ZN A ( larutan Carbol Fuchsin 0,3 % ) sampai menutupi seluruh
permukaan hapusan dahak.
c. Panaskan dengan nyala api spiritus sampai keluar uap selama 3-5 menit. Zat
warna tidak boleh mendidih atau kering. Apabila mendidih atau kering maka
carbol fuchsin akan terbentuk kristal ( partikel kecil yang dapat terlihat seperti
kuman TBC )
d. Singkirkan api spiritus. Diamkan sediaan selama 5 menit.
 e. Bilas sediaan dengan air mengalir pelan sampai zat warna bebas terbuang ( air
yang melewati hapusan bening ).
f. Tetesi sediaan dengan ZN B ( asam alcohol 3 % ) sampai warna merah fuchsin
hilang
g. Bilas dengan air mengalir pelan
h. Teteskan ZN C ( Methylene blue 0,3 % ) pada sediaan sampai menutupi seluruh
permukaan hapusan
i. Diamkan 10-20 detik
j. Bilas dengan air mengalir secara pelan ( sampai air yang melewati hapusan
bening )
k. Keringkan sediaan di atas rak pengering / jembatan pengecatan di udara terbukan
( jangan dibawah sinar matahari langsung )

V. Pembacaan Sediaan :
Sediaan yang telah diwarnai dan sudah kering diperiksa dibawah mikroskop
binokuler.
a. Pembacaan Sediaan Dahak :
a. Tempatkan preparat di atas meja benda mikroskop secara benar
b. Atur obyektif dari mikroskop 10x dan okuler 10x
c. Atur okuler agar sejajar dengan ke dua mata
d. Cari lapang pandang dengan menaikkan atau menurunkan meja benda sampai
ketemu bayangan kasar berwarna sesuai warna cat yang digunakan
e. Teteskan satu tetes minyak imersi diatas hapusan dahak
f. Periksa dengan menggunakan lensa okuler 10x dan obyektif 100x
g. Cari Basil Tahan Asam ( BTA ) yang berbentuk batang dan berwarna merah
h. Periksan paling sedikit 100 lapang pandang adau dalam waktu kurang lebih 10
menit, dengan cara menggeserkan sediaan menurut arah : kanan-turun-kiri –turun-
kanan dst.
i. Sediaan yang telah diperiksa kemudian direndam dengan xylol selama 15-30
menit, lalu disimpan dalam kotak sediaan. Bila menggunaan Anisol, sediaan dahak
tidak perlu direndam dalam xylol.
 b. Pembacaan Hasil :
Pembacaan hasil pemeriksaan sediaan dahak dilakukan dengan menggunakan skala
IUATLD sebagai berikut :
a. Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang disebut negative
b. Ditemukan 1- 9 BTA dalam 100 lapang pandang, ditulis jumlah kuman yang
ditemukan
c. Ditemukan 10 – 99 BTA dalam 100 lapang pandang, disebut + ( 1+ )
d. Ditemukan 1 – 10 BTA dalam 1 lapang pandang, disebut ++ ( 2 + ), minimal
dibaca 50 lapang pandang
e. Ditemukan > 10 BTA dalam 1 lapang pandang, disebut +++ ( 3 + ), minimal
dibaca 20 lapang pandang.

BAB VI
PEMERIKSAAN ANGKA KUMAN / TOTAL PLATE COUNT/
ANGKA LEMPENG TOTAL

I. Landasan Teori :
Salah satu sumber penularan penyakit dan penyebab terjadinya keracunan makana
adalah makanan dan minuman yang tidak memenuhi syarat higienes
 Untuk mengetahui keadaan higienes makanan dan minuman dimaksud perlu
dilakukan pemeriksaan laboratorium. Pemeriksaan mikrobiologi makanan dan minuman
yang meliputi pemeriksaan Angka Kuman, Most Probable Number ( MPN ) dan
pemeriksaan biakan kuman

II. Tujuan :
Untuk mengetahui keadaan higienes makanan dan minuman apakah memenuhi syarat
kesehatan atau tidak

III. Bahan Pemeriksaan :

Makanan Padat, Makanan Cair, Minuman

IV. Alat-Alat, Media Dan Reagensia :

a. Alat Yang Diperlukan :
1. Mikroskop
2. Autoclove
3. Incubator
4. Timbangan
5. Obyek Glass
6. Labu Erlenmeyer
7. Gelas Takaran
8. Rak Tabung Reaksi
9. Lemari Es
10. Botol steril bermulut besar
11. Lampu Spiritus
12. Pinset
13. Spidol
14. Water Bath
15. Tabung Reaksi
16. Petri dish
17. Pipet takar 1 ml, 5 ml, 10 ml
18. Ose
 19. Koloni Counter
20. Kaca Pembesar
21. Pembuka kaleng atau tutup botol
22. Pisau
23. Blender / Mortal
b. Media Yang diperlukan :
1. Garan Buffer phosphate pH 7,2
2. Media untuk pemeriksaan Angka Kuman : Plate Count Agar / Nutrient Agar

V. Pembuatan Media :
a. Larutan garam Buffer Phosphate 7,2 ( stock )
1. Larutkan 34 gr KH2PO4 dalam 500 ml air suling
2. Tentukan pH 7,2 dengan mempergunakan 175 ml 1N NaOH, lalu encerkan
hingga menjadi 1 lt dengan air suling
3. Sterilkan dalam autoclove hingga 121oC selama 15 menit dan disimpan dalam
lemari es hingga diperlukan
b. Cairan untuk pengenceran : Air Garam Pengencer Phosphate
1. Laruan garam buffer stock 1,25 ml
2. Larutan Garam Fisiologis 1.000 ml
3. Campur kedua larutan hingga rata dan dibagi – bagi dalam tabung
4. Sterilisasi dalam autoclove pada suhu 121oC
c. Media : Plate Count Agar / Nutrient Agar ( dapat diperoleh secara komersial dalam
bentuk keing ( dehydrated ) yang proses pengolahan selanjutnya sesuai petunjuk
yang tertera pada kemasan

VI. Prosedur Pemeriksaan :

a. Makanan Padat :
1. Spesimen dihancurkan dengan menggunakan blender, apabila tidak ada blender
dapat menggunakan mortal steril
2. Masukkan 10 gram bahan tersebut ke dalam labu Erlenmeyer berskala
 3. Tuangkan 90 ml air garam fisiologis atau aquadest steril atau garam buffer
phosphate
4. Untuk pemeriksaan bacillus sereusharus menggunakan larutan garam buffer
phosphate
5. Kocok sebanyak kurang lebih 25 kali sampai homogeny
6. Bahan dengan pengenceran tersebut siap dipergunakan untuk pemeriksaan
Angka Kuman, MPN, dam pemeriksaan biakan
b. Makanan Cair, Minuman ;
1. Makanan cair atau minuman yang diterima di kocok terlebih dahulu
2. Masukkan 10 ml bahan ke dalam labu Erlenmeyer berskala
3. Tuangkan 90 ml air garam fisiologis atau aquadest steril atau garam buffer
phosphate
Untuk pemeriksaan Bacillus cereus harus menggunakan larutan garam buffer
phosphate
4. Kocok sebanyak lebih kurang 25 kalisampai homogeny
5. Bahan dengan pengenceran tersebut siap dipergunakan untuk pemeriksaan
Angka Kuman, MPN, dan pemeriksaan biakan
VII.Cara Pemeriksaan :
a. Siapkan 6 tabung reaksi steril, susun pad arak tabung
Masing-masing tabung secara berurutan diberi tanda 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
sebagai kode pengenceran dan tanggal pemeriksaan
b. Siapkan pula 7 petri dish steril
Pada 6 petri dish diberi tanda pada bagian belakangnya sesuai dengan kode
pengenceran dan tanggal pemeriksaan seperti butir a.
Satu petri dish lainnya diberi kode “control”
c. Pada tabung ke dua sampai dengan ke enam, diisi dengan 9 ml air garam fisiologis
atau aquadest steril, atau larutan garam buffer phosphate, untuk pemeriksaan
Bacillus cereus harus menggunakan laurtan garam buffer phosphate.
d. Kocok bahan spesimen diatas dalam labu Erlenmeyer sebanyak 25 kali sampai
homogeny
Ambil 10 ml masukkan pada tabung ke Satu
 e. Pindahkan 1 ml bahan dari tabung ke satu ke dalam tabung dua dengan pipet,
cairan dibuat sampai homogen
f. Pindahkan 1 ml bahan dari tabung ke dua ke tabung ke tiga, cairan dibuat sampai
homogeny
g. Demikian seterusnya dilakukan sampai tabung ke enam.
Pengenceran yang diperoleh pada ke enam tabung adalah 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,
10-6 sesuai dengan kode pengenceran yang telah tercantum sebelumnya
h. Dari masing-masing tabung di atas dimulai dari tabung ke enam dengan
menggunakan pipet steril, diambil 1 ml dimasukkan ke dalam masing-masing petri
dish, sesuai dengan kode pengenceran yang sama.
i. Kemudian ke dalam masing-masing petri dish dituang Plate Count Agar / Nutrient
Agar cair yang telah dipanaskan dalam water bath ± 45oC sebanyak 15-20 ml.
Masing-masing petri dish digoyang perlahan-lahan hingga tercampur merata dan
biarkan hingga dingin dan membeku.
j. Masukkan dalam incubator 37oC selama 2 x 24 jam dalam keadaan terbalik
k. Kontrol dibuat dari cairan air garam fisiologis / aquadest steril atau larutan garam
buffer phosphate 1 ml. Untuk pemeriksaan Bacillus cereus harus menggunakan
larutan garam buffer phosphate, dimasukkan ke dalam petri dish “control” dan
dituangi Plate Count Agar / Nutrient Agar sebanyak 15-20 ml.
l. Pembacaan dilakukan setelah 2 x 24 jam dengan cara menghitung jumlah koloni
yang tumbuh pada tiap petri dish.

VIII. Pembacaan Hasil dan Pelaporan :

a. Pembacaan hasil :
1. Hitung koloni yang tumbuh pada tiap-tiap petri dish
2. Koloni-koloni yang bergabung menjadi stu atau membentuk deretan / koloni
yeng terlihat sebagai garis tebal atau jumlah koloni meragukan dihitung sebagai
1 ( satu ) koloni kuman
3. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada petri dish berisi control
Bila jumlah koloni pada petri dish control lebih besar dari 10, pemeriksaan
harus diulang karena sterilitas dianggap kurang baik. Pemeriksaan ulang harus
menggunakan Plate Count Agar / Nutrient Agar yang lain.
b. Pelaporan :
1. Pelaporan didasarkan pada perhitungan angka kuman yang diperoleh
2. Perhitungan hanya dilaksanakan pada petri dish yang menghasilkan jumlah
koloni antara 30 – 300 serta bila jumlah pada petri dish control lebih kecil dari
10. Jumlah koloni pada masing-masing petri dish ini harus terlebih dahulu
dikurangi dengan jumlah koloni pada petri dish control
Contoh perhitungan :
Jumlah koloni yang tumbuh pada petri dish :
Kontrol : 1 koloni
Pengenceran 10-1 : 326 koloni
Pengenceran 10-2 : 157 koloni
Pengenceran 10-3 : 94 koloni
Pengenceran 10-4 : 37 koloni
Pengenceran 10-5 : 28 koloni
Pengenceran 10-6 : 22 koloni

(157-1) x 100 + (94-1) x 1.000 + (37-1) x 10.000

Angka Kuman : ------------------------------------------------------------------
3

15.600 + 93.000 + 360.000

= ------------------------------------------
3
468.600
= -----------
3
= 156.200 koloni tiap gram ( sampel padat ) atau ml ( sampel cair
)
 BAB VII
MOST PROBABLE NUMBER ( MPN )/ ANGKA TERDEKAT JUMLAH
PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI AIR / MAKANAN
I. Landasan teori
Kualitas air yang digunakan masyarakat harus memenuhi syarat kesehatan, agar
dapat terhindar dari berbagai penyakit maupun gangguan kesehatan yang disebabkan
oleh air
 Untuk mengetahui kualitas air dimaksud, perlu dilakukan pemeriksaan laboratorium
yang mencakup antara lain pemeriksaan bakteriologi air. Pemeriksaan bakteriologi air
meliputi Most Probable Number ( MPN ), dan Angka Kuman
Pemeriksaan MPN dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air minum, air bersih, air
badan air, air permandian umum, air kolam renang, dan pemeriksaan angka kuman
dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air kolam renang.

II. Pemeriksaan Most Probable Number ( MPN )

a. Bahan Pemeriksaan : Air Minum, Air Bersih, Air Badan Air, Air Pemandian
Umum, Air Kolam Renang.
b. Persiapan wadah :
1. Untuk sampel berasal dari air keran :
Siapkan wadah botol berukuran 250 ml, isi dengan 5 tetes cairan Sodium
Thiosulfate 10 %, kemudian botol ditutup.
2. Untuk sampel air sumur :
Tanpa pemberian Sodium Thiosulfate, pada bagian dasar botol diberi pemberat
yang dikaitkan dengan kawat. Pada leher botol dikaitkan tali dengan panjang 20
meter.
3. Untuk sampel air dari sumber air yang terbuka : sungai, danau, dll :
Sediakan wadah botol berukuran 250 ml tanpa pemberian Sodium Thiosulfate
4. Sebelum disterilisasi, semua botol ( beserta tali dan pemberatnya ) dibungkus
dengan kertas coklat atau kertas timah, dan diikat dengan benang
5. Sterilisasi dalam autoclove selama 30 menit pada suhu 120oC dengan tekanan 1
atmosfer

III. Alat-Alat, Media dan Reagensia :

a. Alat – alat yang Diperlukan :
1. Oven
2. Autoclove
3. Incubator
4. Waterbath
5. pH meter
 6. Timbangan
7. Water deionizer
8. Botol dilusi
9. Pipet : 1 ml, 10 ml
10. Api bunchen / api spiritus
11. Tabung Reaksi 16 x 160 mm yang didalamnya berisi tabung durham dengan
posisi terbalik
12. Rak tabung reaksi
13. Ose
14. Peralatan laboratorium umum : botol Erlenmeyer, beaker glass
b. Media dan Reagensia yang Diperlukan
1. Sodium Thiosulfate 10 %
2. Ethanol 70 %
3. Lactose Broth ( LB )
4. Brilliant Green Lactose Bile Broth ( BGLB )

IV. Pembuatan Media :

a. Lactose Broth ( LB ) Single Strength : tersedia media stock dalam kemasan dari
produsen dengan cara pembuatannya
1. Larutkan stock media LB dengan aquadest, campur hingga larut
2. Masukkan sebanyak 10 ml ke dalam tabung pembiakan ( tabung reaksi ) yang
berisi tabung durham dalam posisi terbalik
3. Tutup dengan tutup karet / kapas
4. Sterilisasi dalam autoclove pada suhu 121oC selama 15 menit
pH setelah sterilisasi ± 6,9
Catatan : Untuk pembuatan media Lactose Broth ( LB ) yang double strength
sama dengan di atas, hanya penimbangannya 2 kali / double

b. Brilliant Green Lactose Bili Broth ( BGLB ) : tersedia media stock dari produsen
berikut cara pembuatannya
1. Larutkan media stock dengan aquadest sesuai petunjuk pembuatannya yang
tertera, campurkan hingga larut
 2. Masukkan sebanyak 10 ml ke dalam tabung pembiakan ( reaksi ) yang berisi
tabung durham dalam posisi terbalik
3. Tutup dengan tutup karet / kapas
4. Sterilisasi dalam autoclove pada suhu 121oC selamam 15 menit
pH setelah sterilisasi ± 7,2

V. Prosedur dan Cara Pemeriksaan :

a. Prosedur Pemeriksaan :
Pemeriksaan harus sudah dikerjakan dalam waktu kurang dari 24 jam sejak pengambilan
1. Siapkan semua peralatan kerja
2. Bersihkan semua tempat kerja dengan desinfektan
3. Buka kertas pembungkus botol sampel
4. Dengan posisi tertutup, kocok botol minimal 25 kali putaran dengan spasi gerakan
kira-kira 0,3 meter Selma 7 detik atau kocok dengan pengocok listrik selama 15
menit
Bila botol terisi penuh dengan air, buka tutup botol dan buang air sebanyak 20-30
ml, kemudian tutup kembali botol dan kocok.
5. Lakukan pemeriksaan tabung ganda, yang terdiri dari :
a. Presumtive Test ( Test Pendahuluan atau test perkiraan )
b. Confirmative Test ( Test Penegasan )
Beberapa media yang dapat dipergunakan untuk presumptive test :
- Lauryl Tryptose Broth ( LTB )
- Mac Conkey Broth ( MCB )
- Lactose Broth ( merupakan media yang paling sering digunakan )
Untuk Confirmative test digunakan media Brilliant Green Lactose Bile Broth
(BGLB )

b. Cara Pemeriksaan :
Ada 2 ( dua ) macam ragam yang digunakan :
* Ragam 1 : Untuk specimen yang sudah diolah atau angka kumannya diperkirakan
rendah, digunakan ragam 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml
* Ragam 2 : Untuk specimen yang belum diolah atau angka kumannya diperkirakan
tinggi ( missal : air sumur, air sungai, air mata air, dsb ), digunakan ragam 5 x 10
ml, 5 x 1 ml, 5 x 0,1 ml, mungkin dapat dilanjutkan dengan 5 x 0,01 ml
Cara Pemeriksaan Ragam 1 :
1. Presumptive Test ( Test Pendahuluan / Perkiraan ) :
a. Siapkan 5 tabung yang masing-masing berisi media LB double strength
sebanyak 10 ml ( tabung 1a s.d 5a ), 2 tabung yang masing-masing berisi
media LB single strength sebanyak 10 ml ( tabung 1b dan 2b )
b. Dengan pipet steril 10 ml, ke dalam tabung 1a s.d 5a diinokulasikan masing-
masing 10 ml sampel air
c. Dengan pipet steril 1 ml, ke dalam tabung 1b diinokulasikan 1 ml sampel air
d. Dengan pipet steril 1 ml, ke dalam tabung 2b diinokulasikan 0,1 ml sampel
air
e. Tabung-tabung dikocok perlahan agar sampel air menyebar merata
keseluruh bagian media
f. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 24-48 jam
g. Amati masing-masing tabung untuk melihat ada atau tidak adanya gas
 Untuk memperjelas terlihatnya gas, kocoklah tabung secara perlahan,
bilamana terlihat gelembung halus maka tabung ini dianggap positif
 Test perkiraan atau test pendahuluan yang positif ditandai dengan
terbentuknya gas, tetapi hal ini belum memastikan adanya Coliform
didalam air, karena media LB dapat juga difermentasi oleh bakteri lain
selain Coliform, oleh sebab itu test perkiraan yang positif dilanjutkan
dengan Confirmatif Test ( test penegasan )

2. Confirmative Test ( test penegasan ) :

a. Dari tiap-tiap tabung presumptive tes yang positif, dipindahkan 1-2 ose
kedalam tabung Confirmative test yang berisi 10 ml media BGLB dibuat 2
(dua) seri
b. Satu seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35 oC-37oC selama 24-48
jam ( untuk memastikan adanya Coliform ) dan satu seri yang lain
 diinkubasikan pada suhu 44oC selama 24 jam ( untuk memastikan adanya
coli tinja )
c. Pembacaan dilakukan setelan 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung
BGLB yang menunjukkan positif gas.

Cara Pemeriksaan Ragam 2 :

1. Presumptive Test ( Test Pendahuluan atau perkiraan ) :
a. Siapkan 5 tabung yang masing-masing berisi media LB double strength
sebanyak 10 ml ( tabung 1a s.d 5a ), 5 tabung yang masing-masing berisi
media LB single strength sebanyak 10 ml ( tabung 1b s.d 5b ), 5 tabung yang
masing-masing berisi 10 ml media LB single strength ( tabung 1c s.d 5c )
b. Dengan pipet steril 10 ml, ke dalam tabung 1a s.d 5a diinokulasikan masing-
masing 10 ml sampel air
c. Dengan pipet steril 10 ml, ke dalam tabung 1b s.d 5b diinokulasikan 1 ml
sampel air
d. Dengan pipet steril 10 ml, ke dalam tabung 1c s.d 5c diinokulasikan 0,1 ml
sampel air
e. Tabung-tabung dikocok perlahan agar sampel air menyebar merata
keseluruh bagian media
f. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 24-48 jam
g. Amati masing-masing tabung untuk melihat ada atau tidak adanya gas
 Untuk memperjelas terlihatnya gas, kocoklah tabung secara perlahan,
bilamana terlihat gelembung halus maka tabung ini dianggap positif
 Test perkiraan atau test pendahuluan yang positif ditandai dengan
terbentuknya gas, tetapi hal ini belum memastikan adanya Coliform
didalam air, karena media LB dapat juga difermentasi oleh bakteri lain
selain Coliform, oleh sebab itu test perkiraan yang positif dilanjutkan
dengan Confirmatif Test ( test penegasan )

3. Confirmative Test ( test penegasan ) :

 d. Dari tiap-tiap tabung presumptive tes yang positif, dipindahkan 1-2 ose
kedalam 2 (dua) seri tabung Confirmative test yang berisi 10 ml media
BGLB
e. Satu seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35 oC-37oC selama 24-48
jam ( untuk memastikan adanya Coliform ) dan satu seri yang lain
diinkubasikan pada suhu 44oC selama 24 jam ( untuk memastikan adanya
coli tinja )
f. Pembacaan dilakukan setelan 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung
BGLB yang menunjukkan positif gas.

VI. Pembacaan hasil dan Pelaporan :

Catat jumlah tabung cofirmatif ( tabung BGLB ) yang menunjukkan positif gas.
Angka yang diperoleh dicocokkan dengan tabel MPN, maka akan diperoleh indeks
MPN coliform untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 37 oC dan indeks MPN
Escherichia coli ( E.coli ) untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 44oC.
Untuk ragam 2, bila penanaman dengan volume terkecil ( dalam hal ini 0,1 )
kelima tabung menunjukkan positif gas, maka jumlah tabung harus ditambah dengan 2
seri kelipatan 1/10 hingga diperoleh jumlah tabung yang positif gas untuk penanaman
pada volume terkecil kurang dari 5.
Penentuan nilai MPN diambil dari 3 angka terakhir. Tergantung pada berapa kali
factor penurunan kelipatan 10 yang digunakan, nilai MPN yang didapat dikalikan
factor tersebut.

Contoh Pembacaan :
a. Untuk Ragam 1
Dari penanaman dengan volume 10 ml diperoleh 4 tabung BGLB positif gas
Dari penanaman dengan volume 1 ml diperoleh 1 tabung positif gas
Dari penanaman dengan volume 0,1 ml diperoleh 0 tabung BGLB positif gas
Maka nilai MPN/100ml sampel untuk 4-1-0 adalah 21

b. Untuk Ragam 2 :
Dari penanaman dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas
Dari penanaman dengan volume 1 ml diperoleh 4 tabung BGLB positif gas
Dari penanaman dengan volume 0,1 ml diperoleh 2 tabung BGLB positif gas
Maka nilai MPN / 100 ml sampel untuk 5-4-2 adalah 220

 Dari penanaman dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas

 Dari penanaman dengan volume 1 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas
 Dari penanaman dengan volume 0,1 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas
Bila dijumpai keadaan demikian dimana nilai MPN ≥ 2400, maka jumlah tabung
ditambah dengan seri 5 x 0,01 ml dan 5 x 0,001 ml :
 Dari penanaman dengan volume 0,01 ml diperoleh 4 tabung BGLB positif gas
 Dari penanaman dengan volume 0,001 ml diperoleh 1 tabung BGLB positif gas
Maka angka yang diambil adalah 5-4-1 ( 5 x 0,1 ml, 4 x 0,01 ml, 1 x 0,001 ml
Nilai MPN yang diperoleh dari tabel harus dikalikan 100 untuk mendapatkan hasil
MPN yang sebenarnya. Maka nilai MPN / 100 ml untuk sampel ini adalah 170 x
100 = 17000

TABEL MPN
RAGAM I : 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml
VOLUME
10 1 0,1
MPN / 100 ml
 0 0 1 2
0 1 0 2
0 1 1 4
1 0 0 2,2
1 0 1 4,4
1 1 0 4,4
1 1 1 6,7
2 0 0 5
2 0 1 7,5
2 1 0 7,6
2 1 1 10
3 0 0 8,8
3 0 1 12
3 1 0 12
3 1 1 16
4 0 0 15
4 0 1 20
4 1 0 21
4 1 1 27
5 0 0 38
5 0 1 96
5 1 1 240

TABEL MPN
RAGAM II : 5 x 10 ml, 5 x 1 ml, 5 x 0,1 ml
VOLUME INDEKS VOLUME INDEKS MPN
10 1 0,1 10 1 0,1
MPN / 100 ml / 100 ml
0 0 0 <2 5 0 0 23
0 0 1 2 5 0 1 31
0 1 0 2 5 0 2 43
0 2 0 4 5 1 0 33
1 0 0 2 5 1 1 46
1 0 1 4 5 1 2 63
1 1 0 4 5 2 0 49
1 1 1 6 5 2 1 70
1 2 0 6 5 2 2 94
2 0 0 5 5 3 0 79
2 0 1 7 5 3 1 110
2 1 0 7 5 3 2 140
2 1 1 9 5 3 3 180
2 2 0 9 5 4 0 130
 2 3 0 12 5 4 1 170
3 0 0 8 5 4 2 220
3 0 1 11 5 4 3 280
3 1 0 11 5 4 4 350
3 1 1 14 5 5 0 240
3 2 0 14 5 5 1 350
3 2 1 17 5 5 2 540
3 3 0 17 5 5 3 920
4 0 0 13 5 5 4 1600
4 0 1 17 5 5 5 ≥ 2400
4 1 0 17
4 1 1 21
4 1 2 26
4 2 0 22
4 2 1 26
4 3 0 27
4 3 1 33
4 4 0 34

BAB VIII
CARA PENGAMBILAN, PENANGANAN DAN PENGIRIMAN
SAMPEL AIR

I. Landasan Teori :
Kualitas air yang digunakan masyarakat harus memenuhi syarat kesehatan, agar
dapat terhindar dari berbagai penyakit maupun gangguan kesehatan yang disebabkan
oleh air
Untuk mengetahui kualitas air dimaksud, perlu dilakukan pemeriksaan laboratorium
yang mencakup antara lain pemeriksaan bakteriologi air. Pemeriksaan bakteriologi air
meliputi Most Probable Number ( MPN ), dan Angka Kuman
Pemeriksaan MPN dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air minum, air bersih, air
badan air, air permandian umum, air kolam renang, dan pemeriksaan angka kuman
dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air kolam renang.
Pengambilan specimen air harus dilakukan secara steril guna memastikan tidak
terdapatnya organisme yang mengkontaminasi dari pada air.
Sampel air dapat berasal dari : air kran, air sumur, sumber air yang terbuka seperti
air danau, sungai dan sebagainya
II. Tujuan :
a. Mahasiswa dapat menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan dalam pengambilan
sampel air
b. Mahasiswa dapat melaksanakan pengambilan sampel air secara baik dan benar
c. Mahasiswa dapat melakukan penanganan dan pengiriman sampel air ke laboratorium

III. Alat-alat dan Bahan yang Diperlukan :

a. Botol sampel steril
b. Lampu spiritus / sendok makan
c. Kapas
d. Benang bandulan / tali yang steril
e. Cold box
f. Kertas label
g. Ethanol / Alkohol 70 %
h. Larutan Sodium Thiosulphate 10 %
i. Botol sampling

IV. Cara Kerja Pengambilan Sampel Air Berdasarkan Sumbernya

a. Cara Pengambilan Air Kran
b. Cara pengambilan Air Sumur
c. Cara Pengambilan Air dari sumber air terbuka seperti danau, sungai dll sebagai
berikut

V. Cara Penanganan dan Pengiriman Spesimen

 Pengiriman specimen dilaksanakan secepatnya dalam waktu kurang dari 24 jam.
Sebelum dikirim sampel air disimpan dalam refrigerator
 Bila perjalanan diperkirakan akan memakan waktu lebih dari 3 jam, specimen harus
dikirim dalam suasana dingin, pada suhu 4-10oC.
 Sampel air yang akan dikirim harus dikemas terlebih dahulu
 Botol dipak dalam kotak kayu yang telah diberi tanda : ATAS dan BAWAH
 Kotak kayu diberi penyangga ( kayu ) untuk menjaga agar botol tetap menghadap ke
atas
  Dapat juga digunakan wadah dari metal dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran
botol tersebut untuk menghindari tumpah atau pecahnya botol sampel tersebut.
 Bungkus wadah tersebut dan cantumkan alamat yang dituju dengan jelas
 Pengiriman specimen dilakukan dengan memperhatikan sungguh-sungguh syarat
pengiriman specimen.
 Spesimen dikirim dengan surat pengantar.

BAB IX
KOEFISIEN FENOL

I. Pendahuluan :
Angka yang digunakan dalam koefisien fenol menggambarkan kemampuan bahan kimia
desinfektan atau antiseptic dibandingkan dengan fenol. Bila nilai koefisien fenol lebih besar dari
pada satu (1) menandakan bahwa bahan kimia yang dipergunakan lebih efektif dari pada fenol.
Untuk menentukan nilai koefisien fenol dilakukan sebagai berikut: dibuat beberapa pengenceran
fenol kemudian dicampur dengan bakteri-bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi,
kemudian dilihat pada pengenceran mana fenol tersebut dapat membunuh bakteri-bakteri tersebut
dalam waktu 10 menit, tapi tidak terbunuh dalam waktu 5 menit.
Makin besar koefisien fenol suatu desinfektan berarti makin manjurlah desinfektan tersebut.
Desinfektan yang dijual di took-toko itu telah ditentukan konsentrasinya, sehingga pemakai tidak
perlu ribut-ribut mengujinya lagi.

II. Tujuan :
Untuk Mengetahui kemampuan bahan kimia desinfektan atau antiseptic dibandingkan dengan fenol
dalam membunuh bakteri.
III. Alat dan Bahan :
a. Alat-alat : Inkubator, Ose, tabung reaksi, Cawan Petri, Lampu spiritus, Rak
tabung , tabung reaksi, Pipet ukur, drop pipet, dll.
b. Bahan-bahan : Nutrient agar, Desinfektan/bahan kimia, Fenol, Kertas label,
Bakteri, Aqua steril.

IV. Cara Kerja :

a. Buat pengenceran fenol : 1:70; 1:80; 1;90; 1:100.

1 ml Fenol
Tabung
69 ml aquadest steril
reaksi
= 1:70 dst.nya.

b. Buat pengenceran desinfektan/bahan kimia 1:300: 1:400; 1:500; 1:600.

Tabung 1 ml desinfektan/bahan kimia,

reaksi
299 ml aquadest steril,

= 1:300. dst.nya

c. Buat formulasi bakteri : koloni bakteri + aquadest steril secukupnya ( sesuai kebutuhan ).

d. Langkah kerja :

1. Masukkan formulasi bakteri kedalam tabung reaksi yang berisi pengenceran fenol dan
pengenceran desinfektan/bahan kimia ( dengan perhitungan waktu agar tidak lebih dari
5 menit ) dengan vol. 0,5 ml.

Formulasi
bakteri
 0,5 ml.

1:70 1:80 1:90 1:100

Fenol

Formulasi
bakteri
0,5 ml.

1:300 1:400 1:500 1:600

Desinfektan

2. Cawan Petri yang berisi nutrient agar diberi kode pengenceran untuk fenol dan
desinfektan/bahan kimia.
3. Setelah 5 menit setiap pengenceran ditanam pada nutrient agar padat dengan ose
(digoreskan ):

1:70 1:80 1:90 1:100

NA NA NA NA
Fenol

1:300 1:400 1:500 1:600

 NA NA NA NA

Desinfektan

4. Setelah 10 menit lakukan langkah seperti nomor 3.

5. Setelah semua ditanam kemudian diinkubasikan pada incubator selama 48 jam dengan
suhu 37oC.
6. Lihat masing-masing waktu dan pengenceran tentang pertumbuhan bakterinya.
7. Hitung nilai koefisien fenolnya denngan rumus :

Mati terakhir waktu 10 menit desinfektan

---------------------------------------------------

mati terakhir waktu 10 menit fenol

e. Hasil :>1
f. Kesimpulan :

Referensi buku :

1. Dwidjoseputro D, 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi, cetakan ke 15, penerbit

Djambatan Jakarta.
2. Muslimin W Lusia, 1995. Mikrobiologi Lingkungan, Unhas Depdikbud. Jakarta.
3. Pandjaitan R, dkk. 1992. Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi, PPOM.
Dirjrn POM Depkes. Jakarta
 DAFTAR PUSTAKA

Depkes RI, 1991. Petunjuk Pemeriksaan Mikrobiologi Makanan dan Minuman,

Puslabkes, Jakarta
Depkes RI, 1991. Petunjuk Pemeriksaan Bakteriologi Air, Puslabkes, Jakarta
Soemarno, 1987. Penuntun Praktikum bakteriologi, CV. Karyono, Yogyakarta
Badan POM, 2009. Penetapan Batas Maksimum Cemaran Mikroba dan Kimia Dalam
Makanan, Badan POM, Jakarta
BSN, 2009. Standar Nasional Indonesia Nomor 7388-2009 Batas Maksimum Cemaran
Mikroba Dalam Pangan, BSN, Jakarta.
Depkes RI, 2002. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis, Cetakan ke 8,
Jakarta
Dwidjoseputro D, 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi, cetakan ke 15, penerbit Djambatan
Jakarta.
Muslimin W Lusia, 1995. Mikrobiologi Lingkungan, Unhas Depdikbud. Jakarta.
Pandjaitan R, dkk. 1992. Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi, PPOM.
Dirjrn POM Depkes. Jakarta