LAPORAN PRAKTIKUM

JUDUL: PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI

KELOMPOK 2 (Kotler 2)
1. Ni Komag Omik Trianita Udiana ( P07134120068 )
2. Luh Gede Trisna Agustini ( P07134120069 )
3. Ni Komang Sri Rahayu ( P07134120070 )
4. I Ngenah Jaya Arthawiguna ( P07134120071 )
5. Yunita ( P07134120073 )

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
TAHUN 2021
 LEMBAR PENGESAHAN
LAPORAN PRAKTIKUM
PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATRIUM MEDIS
POLTEKKES KEMENKES DENPASAR

Laporan ini dibuat sebagai syarat untuk

memenuhi tugas akhir praktikum dan
telah disusun pada tanggal 3 November 2021

Oleh Kelompok 2 Kloter 2

Dosen Pembimbing 1 Dosen Pembimbing 2

(Nyoman Mastra, S.KM.,S.Pd.,M.Si) (I Nyoman Jirna, S.KM.,M.Si)

Dosen Pembimbing 3 Dosen Pembimbing 4

(Burhannuddin, S.Si.,M.Biomed) (Putu Ayu Suryaningsih, S.ST)

 PRAKATA

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas
tuntunanNya, kami dapat menyelesaikan penyusunan Laporan Praktikum Pemeriksaan
Bakteriologi ini. Penyusunan laporan praktikum pemeriksaan bakteriologi ini merupakan
hasil dari pelaksanaan praktikum yang dimana sebagai syarat dalam penyelesaian tugas
praktikum. Laporan praktikum ini terdiri atas delapan percobaan praktikum dan tiap
percobaan praktikum memiliki tujuan,landasan teori, alat dan bahan praktikum, cara kerja
dan hasil pengamatan.
Dalam penyusunan Laporan Praktikum ini, kami telah dibantu oleh berbagai pihak,
maka dalam kesempatan kami ucapkan terimakasih kepada:
1. Nyoman Mastra,S.KM.,S.Pd.,M.Si selaku dosen pembimbing praktikum mata
kuliah Bakteriologi yang senantiasa mengajar dan membimbing selama Praktikum
sehingga Laporan Praktikum ini dapat diselesaikan.
2. I Nyoman Jirna, S.KM.,M.Si selaku dosen pembimbing praktikum mata kuliah
Bakteriologi yang senantiasa mengajar dan membimbing selama Praktikum
sehingga Laporan Praktikum ini dapat diselesaikan.
3. Buhannuddin, S.Si., M.Biomed selaku dosen pembimbing praktikum mata kuliah
Bakteriologi yang senantiasa mengajar dan membimbing selama Praktikum
sehingga Laporan Praktikum ini dapat diselesaikan.
4. Putu Ayu Suryaningsih, S.ST selaku dosen pembimbing praktikum mata kuliah
Bakteriologi yang senantiasa mengajar dan membimbing selama Praktikum
sehingga Laporan Praktikum ini dapat diselesaikan.
Kami menyadari laporan praktikum Pemeriksaan Bakteriologi ini masih belum
sempurna dan masih ada kekurangan. Maka dari itu kami mohon maaf apabila ada
kekurangan dalam penyusunan laporan praktikum Pemeriksaan Bakteriologi ini.
Untuk itu kritik dan saran yang sifatnya membangun sangat kami perlukan untuk
penyempurnannya. Akhir kata kami ucapkan terimakasih dan semoga laporan
praktikum ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Denapassar, November 2021

Penulis
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN
PRAKARTA
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
BAB I PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
B. RUMUSAN MASALAH
C. TUJUAN
D. MANFAAT
BAB II TINJAU PUSTAKA
BAB III METODE
A. WAKTU DAN TEMPAT
B. ALAT DAN BAHAN
C. CARA KERJA
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL PRAKTIKUM
B. PEMABHASAN
BAB V KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
 BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Mikroorganisme terdapat dimana-mana, seperti pada tanah, debu, udara, air,
makanan ataupun permukaan jaringan tubuh kita. Keberadaan mikroorganisme
tersebut ada yang bermanfaat bagi kehidupan manusia, tetapi banyak pula yang
merugikan manusia misalnya dapat menimbulkan berbagai penyakit atau bahkan
dapat menimbulkan kerusakan akibat kontaminasi (Ratna S, 1990).
Udara bukanlah suatu medium tempat mikroorganisme tumbuh, tetapi
merupakan pembawa bahan partikulat, debu dan tetesan cairan,yang kesemuanya
ini mungkin dimuati oleh bakteri. Jumlah dan tipe mikroorganisme yang
mencemari udara ditentukan oleh sumber pencemaran di dalam lingkungan
misalnya, dari saluran pernafasan manusia yang disemprotkan melalui batuk,
bersin, dan partikel-partikel debu diedarkan oleh aliran udara (Entjang, 2003).
Mikroorganisme dapat hidup dimana – mana, tidak hanya di ruang terbuka
tapi di ruangan tertutup. Kehidupan mikroorganisme di ruang tertutup lebih
mudah dikendalikan dibanding di ruang terbuka. Jika suatu ruangan tertutup,
kehidupan mikroorganisme dapat dikendalikan, maka ruangan tersebut dapat
dikategorikan sebagai ruangan steril ( Rusli, 2004 ).
Menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor:
1204/Menkes/SK/X/2004, indeks angka kuman di udara laboratorium mempunyai
batasan konsentrasi maksimal sebesar 200 – 500 CFU/m3. Hal ini menunjukkan
bahwa begitu penting untuk menurunkan angka kuman udara di laboratorium
sebelum digunakan untuk melakukan pemeriksaan (KEMENKES RI, 2004).
Ukuran sel mikroorganisme yang sedemikian kecil dan ringan menyebabkan
mudah terhembuskan oleh aliran udara. Keberadaan mikroorganisme dapat
menyebabkan kontaminasi dan berpengaruh terhadap pemeriksaan laboratorium
mikrobiologi, yang sering disebut bakteri kontaminan, yang biasanya dapat ikut
tumbuh dalam suatu media nutrient agar. Bakteri kontaminan yang sering
ditemukan diantaranya adalah Bacillus sp, Streptococcus sp, Staphyloccus,
Pseudomonas dan Sarcina (Pusdiknakes, 1989).
B. RUMUSAN MASALAH
1. Bagimana teknik penghapusan dan teknik pewarnaan bakteri ?
 2. Bagimana teknik kultur bakteri dengan sampel urine ?
3. Bagimana cara mengidentifikasi bakteri enteric ?
4. Bagimana cara mengidentifikasi bakteri Vibrio ?
5. Bagimana cara mengidentifikasi baketri Stalylococcus aureus ?
6. Bagimana cara mengetahui angka kuman pada makanan/minuman ?
7. Bagimana cara mengetahui kualitas bakteriologis air/minuman?
C. TUJUAN
1. Mengidentifikasi bakteri dengan teknik pewarnaan Gram
2. Mengidentifikasi bakteri dengan teknik pewarnaan BTA
3. Mengkultur bakteri dari sampel urine
4. Mengidentifikasi bakteri enteric
5. Mengidentifikasi bakteri Vibrio
6. Mengidentifikasi bakteri Staphylococcus aureus
7. Mengetahui angka kuman makanan/minuman
8. Mengetahui kualitas bakteriologis air/minuman dengan uji MPN
D. MANFAAT
1. Untuk mengetahui bakteri dengan teknik pewarnaan Gram
2. Untuk mengetahui bakteri dengan teknik pewarnaan BTA
3. Untuk mengetahui bakteri dari sampel urine
4. Untuk mengetahui bakteri enteric
5. Untuk mengetahui bakteri Vibrio
6. Untuk mengetahui bakteri Staphylococcus aureus
7. Untuk mengetahui angka kuman makanan/minuman
8. Untuk mengethaui kualitas bakteriologis air/minuman dengan uji MPN
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Teknik pewarnaan gram

Bakteri berasal dari bahasa Latin bacterium; jamak: bacteria adalah kelompok
organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain
prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik). Hal ini menyebabkan organisme ini
sangat sulit untuk dideteksi, terutama sebelum ditemukannya mikroskop. Dinding sel bakteri
sangat tipis dan elastis ,terbentuk dari peptidoglikan yang merupakan polimer unik yang
hanya dimiliki oleh golongan bakteri. Fungsinya dinding sel adalah- memberi bentuk sel,
member perlindungan dari lingkungan luar dan mengatur pertukaran zat-zat dari dan ke
dalam sel Teknik pewarnaan Gram adalah untuk menunjukan perbedaan yang mendasar
dalam organisasi struktur dinding sel bakteri atau cell anvelope.Bakteri Gram positif
memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut
juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika
dicuci dengan alkohol atau aseton. Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan
tipis peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari
lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic
space (hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi cairan atau gel yang
mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal violet-iodine
mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan
pelarut. Ketika sel diberi perlakuan pewarna tandingan Safranin O, pewarna tersebut dapat
diserap oleh dinding sel bakteri Gram negatif. Bakteri umumnya melakukan reproduksi atau
berkembang biak secara aseksual (vegetatif = tak kawin) dengan membelah diri. Pembelahan
sel pada bakteri adalah pembelahan biner yaitu setiap sel membelah menjadi dua. Selama
proses pembelahan, material genetik juga menduplikasi diri dan membelah menjadi dua, dan
mendistribusikan dirinya sendiri pada dua sel baru. Bakteri membelah diri dalam waktu yang
sangat singkat. Pada kondisi yang menguntungkan berduplikasi setiap 20 menit.
Pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan gram yang memilki tujuan utama untuk dapat
mengelompokkan bakteri, dengan hasil bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram
positif memilki sifat yang dapat mempertahankan zat warna kristal violet, serta akan
menampakan warna ungu tua di bawah mikroskop. Sedangkan untuk bakteri gram negatif
akan memiliki sifat yaitu, akan kehilangan zat warna kristla violet setelah proses pencucian
yang dilakukan dengan  alkohol, dan sewaktu diberikannya zat pewarna air safranin, maka
bakteri gram negatif akan tampak atau menunjukan warna merah. Perbedaan zat warna ini
dikarenakan oleh perbedaan yang ada dalam struktur kimiawi dinding sel bakteri (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan
pencuci (Dwidjoseputro.1998).
Secara umum bakteri memiliki sifat yang tembus cahaya, hal ini dikarenakan bakteri
tidak memiliki zat warna dalam tubuhnya. Tujuan dari perwarnaan gram yaitu untuk
mempermudah proses pengamatan dari bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad,
mengamati struktur dalam serta luar sel bakteri, serta untuk melihat reaksi jazad terhadap
pewarna yang diberikan, sehingga nantinya sifat fisik atau kima jazad dapat
diketahui (Hadiutomo, 1990).Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae
harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu, sehingga nantinya mikroba atau morfoligi dapat
diamati dengan keadaan yang jelas. Pada dasarnya bakteri bersifat tembus cahaya atau
transparan, hal ini dikarena sebagian besar tubuh dari bakteri yang tidak mempunyai zat
warna (Waluyo, 2004). Metode Pewarnaan gram dilkukan untuk mengetahui morfologi dari
bakteri, serta membedakan bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram
positif akan berwarna ungu, jika dilihat dari mikroskop, itu karena bakteri gram positif dapat
menahan kompleks pewarna primer karbol gentian violet iodium sampai akhir prosedur
pewarnaan. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah jika dilihat di bawah mikroskop, itu
karena bakteri gram negatif kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium dengan
proses pembilasan alkohol, kemudian yang terwarnai oleh pewarna tandingan air
fuksin (Cappucino, 1987). Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tebal, dan dapat
menyusut pada saat dilakukaanya proses pembilasan alkohol, yang menjadikan pori-porinya
menutup dan mencegah keluarnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan.
Sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif mengandung banyak lipid yang dapat larut
dalam alkohol pada saat pembilasan. Larutnya lipid ini dapat memperbesar pori-pori dinding
sel, yang dapat  menyebabkan proses pemucatan berlangsung dengan cepat (Cappucino,
1987).
Jika berdasrakan gramnya menurut Lay (1994), bakteri dibedakan menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri Gram positif memiliki ciri dapat mengikat zat warna pertama (kristal violet)
serta akan dapat memberikan warna ungu dan bahkan setelah proses pencucian
dengan alkohol, warna ungu akan tetap kelihatan. Jika  ditambahkan zat warna kedua
 (safranin), warna ungu pada bakteri positif tidak akan berubah. Contoh :
Stapylococcus aureus, dan  Stapylococcus epidermidis
2. Bakteri Gram negative memilki ciri akan kehilangan warna dari kristal violet ketika
proses pencucian dengan alkohol dan setelah diberikan zat warna kedua (safranin),
bakteri negative akan berubah dan memberikan warna menjadi warna merah muda.
Contoh : Salmonella species,Salmonella typhi, Salmonella dysenteriae, dan Klebsiella
pneumonia kristal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane, yang bisa
digunakan atau dimanfaatkan untuk histologis noda dalam metode gram klasifikasi
bakteri. Sifat Kristal violet, antara lain adalah  anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan
penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991). Safranin merupakan noda biologis
yang digunakan sebagai histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain
dalam beberapa protokol pewarnaan. Safranin mempunyai struktur kimia. Ada juga
trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan
biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara
keduanya (Sutedjo,1991).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan
bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet,
larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa
zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini
pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae (Putri, Sukini, & Yodong, 2017). Bakteri yang terwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif.
Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun 28 bakteri gram negatif akan
kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi
zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi
dinding selnya (Putri, Sukini, & Yodong, 2017). Menurut Waluyo (dalam Nurhidayati,
Faturrahman, Ghazali, 2015), uji pewarnaan gram dilakukan dengan akuades steril
diletakkan di atas kaca objek, koloni bakteri di ambil satu ose dari media diletakkan di
atas akuades steril dan sebarkan hingga merata, biarkan olesan tersebut kering karena
udara. Setelah olesan benar-benar kering kemudian lalukan kaca objek tersebut beberapa
kali di atas nyala api sampai kaca objek terasa agak panas bila ditempelkan pada
punggung tangan. Kemudian ditetesi dengan larutan kristal ungu (Gram A), dan
didiamkan selama satu menit, kemudian cuci menggunakan akuades pada botol semprot
dan dikeringkan. Selanjutnya ditetesi dengan larutan yodium (Gram B) dan dibiarkan
selama 2 menit, dicuci menggunakan akuades pada botol semprot dan dikeringkan.
Kemudian ditetesi dengan larutan etanol 95% (Gram C) selama 30 detik, dicuci
menggunakan akuades pada botol semprot dan dikeringkan. Setelah itu ditetesi dengan
larutan safranin (Gram D) atau zat penutup dan didiamkan selama 30 detik, kemudian
dicuci menggunakan akuades pada botol semprot dan dikeringkan. Selanjutnya diamati
dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran kuat.
B. Teknik pewarnaan BTA
Bakteri tahan asam, terutama basil tuberkel (Mycobacterium tuberculosis)
memiliki dinding sel yang mengandung sejumlah besar lilin, hidrokarbon becabang
kompleks (panjangnya 70-90 karbon) yang disebut sebagai mycolic acid. Dinding sel
terdiri dari peptidoglikan dan dua lapis lipid asimetris eksternal; lebaran dalam
mengandung mycolic acid yang berikatan dengan arabinoglikan dan lembaran luar
mengandung lipid yang dapat diekstraksi lainnya. Lapisan ini merupakan dua lapis
lipid yang sangat teratur, tempat protein tertanam membentuk pori-pori berisi air
sehingga nutrient dan obat yang tertentu dapat masuk atau lewat secara perlahan.1
Beberapa senyawa juga dapat menembus daerah lipid di dinding sel walau lambat.
Struktur hidrofobik ini membuat bakteri resisten terhadap berbagai bahan kimia keras
termasuk deterjen dan asam kuat. Jika sel-sel ini diberikan zat warna dengan
pemanasan singkat atau penggunaan deterjen maka warna tersebut tidak dapat
dihilangkan dengan asam klorida encer seperti pada bakteri lain. Permeabilitas
dinding selnya terhadap molekul hidrofilik 100-1.000 kali lipat lebih rendah
dibandingkan Escherichia coli dan dengan demikian hal ini mungkin juga
menyebabkan lambatnya pertumbuhan mikobakteri.1
Mikobakteri merupakan bakteri berbentuk batang, aerob yang tidak membentuk
spora, kaya akan lipid yang mencakup mycolic acid (asam lemak rantai panjang C78-
C90), lilin, fosfatida. Pada sel, lipid sangat terikat dengan protein dan polisakarda.
Muramyl dipeptide bersama dengan mycolic acid dapat menyebabkan pembentukan
granuloma yang merupakan fosfolipid menginduksi nekrosis kaseosa. Basil
tuberkulosis ini memiliki galur virulen dengan membentuk serpentine cord yang
merupakan kumpulan basil tahan asam tersusun dalam rantai paralel. Tali ini
merupakan sebuah cord factor (trehalose-6,6’-dimycolate) telah di ekstraksi dari basil
virulen dengan eter petroleum. Senyawa ini menghambat migrasi leukosit,
menyebabkan granuloma kronis dan dapat berfungsi sebagai adjuvan imunologis.1
Mikobakteri ini merupakan bakteri aerob obligat dan memperoleh energi dari oksidasi
banyak senyawa karbon sederhana. Peningkatan tekanan CO2 akan meningkatkan
pertumbuhan bakteri. Aktivitas biokimianya tidak khas dan kecepatan
pertumbuhannya jauh lebih lambat daripada sebagian besar bakteri. Waktu
pembelahan basil tuberkulosis sekitar 18 jam. Bentuk saprofit akan cendrung tubuh
lebih cepat dan berproliferasi baik pada suhu 22-33℃ dengan menghasilkan lebih
banyak pigmen dan kurang tahan asam dibanding bentuk patogenik. Mikobakteri
terkandung dalam droplet berdiameter <25 𝜇𝑚 ketika pasien yang terinfeksi batuk,
bersin atau bebicara. Droplet akan menguap dan meninggalkan organisme yang cukup
kecil untuk terdeposit di dalam alveoli ketika dihirup. Ketika berada di dalam alveoli
maka sistem imun pejamu akan merespons dengan mengeluarkan sitokin dan limfokin
yang menstimulasi monosit dan makrofag. Makrofag meningkatkan kemampuan
membunuh organisme sedangkan yang lainnya dapat dibunuh oleh basil. Setelah 1-2
bulan pasca paparan di paru akan terlihat lesi patognik yang disebabkan oleh infeksi.
Dua tipe lesi yaitu tipe eksudatif dan tipe produktif dapat berkembang. Resistensi dan
hipersensitivitas pejamu sangat mempengaruhi perkembangan penyakit dan tipe lesi
yang terlihat.1 Meskipun tidak mudah diwarnai, namun bila diwarnai maka bakteri ini
menahan penghilang warna oleh asam atau alkohol sehingga disebut basil “tahan
asam”. Terdapat lebih dari 125 spesies Mycobacterium, termasuk banyak di antaranya
yang saprofit. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan
sebuah patogen yang sangat penting pada manusia. Pada jaringan, basil tuberkulosis
berbentuk batang lurus dan tipis berukuran sekitar 0,4 x 3 𝜇𝑚. Pada media artifisial,
bakteri ini memiliki bentuk kokoid dan filamentosa yang terlihat dalam berbagai
morfologi dari berbagai spesies. Mikobakterium tidak dapat dimasukkan ke dalam
kelompok bakter gram-positif atau gram-negatif. Ketika diwarnai dengan pewarnaan
dasar maka warna pada bakteri tersebut tidak dapat dihilangkan oleh alkohol kecuali
dengan iodin. Basil tuberkulosis dengan sifatnya yang tahan asam, yaitu etil alkohol
95% yang mengandung asam hidroklorida (asam-alkohol) dengan cepat
menghilangkan warna semua bakeri kecuali mikobakteri. Sifat tahan asam ini
bergantung pada integritas selubung lilin. Pewarnaan dengan tehnik Ziehl-Neelsen
dilakukan untuk identifikasi bakteri tahan asam. Pada apusan sputum atau potongan
jaringan, mikobakteri dapat terlihat dengan warna kuning-orany fluoresens setelah di
warnai dengan pewarnaan fluorokrom seperti auramine, rhodamine. Kemudahan
untuk melihat BTA dengan pewarnaan fluorokrom ini menjadikan pewarnaan yang
lebih sering digunakan untuk spesimen klinik.1 Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen
menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 % dan methylen blue
0,3%. Pemberian warna pertama yang merupakan carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam
larutan fenol 5%. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol
digunakan sebagai pelarut untuk membatu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri
sewaktu proses pemanasan. Pemanasan berfungsi untuk melebarkan pori-pori lemak
BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan
pemucat, yaitu asam alkohol sehingga zat warna pertama tidak mudah dilunturkan.
Bakteri dicuci lagi dengan air mengalir untuk menutup pori- pori dan menghentikan
pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan
asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat hingga sel bakteri tidak berwarna.
Setelah penambahan zat warna kedua yang merupakan methylen blue, bakteri tidak
tahan asam akan berwarna biru. Prinsip dasar metode Ziehl Neelsen adalah proses
penyerapan zat warna yang dilakukan dengan bantuan pemanasan untuk memudahkan
penyerapan warna karbol fukhsin agar melunakkan lemak atau lilin BTA, sehingga
karbol fukhsin terikat erat pada dinding sel BTA. Karbol fukhsin yang berwarna
merah akan lebih mudah larut dalam fenol dibanding dalam air atau alkohol asam
sehingga fenol lebih mudah larut dalam lemak atau lilin dari pada dalam air. Bakteri-
bakteri tahan asam yang banyak mengandung lemak atau lilin dalam keadaan panas
sangat mudah menyerap basik fuksin dan fenol, tapi sangat tahan karena memang
sifatnya yang sangat tahan terhadap pencuci asam.2 Apabila bakteri diwarnai dengan
karbol fukhsin sambil dipanaskan 90°C selama 4 menit maka lapisan lilinnya akan
menjadi lunak dan zat warna dapat menembus masuk kedalam sel. Setelah dingin zat
warna tersebut terikat erat oleh dinding sel dan tidak luntur pada pencucian dengan
alkohol asam maka bakteri tersebut bersifat tahan asam. Pada pemberian zat warna
lawan (metilen biru) bakteri ini tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau
hijau. Sebaliknya, bakteri yang tidak tahan asam maka zat warna utamanya akan
luntur pada waktu pencucian dengan alkohol asam, sehingga zat warna lawan dapat
memberi warna pada sel.3 Pemeriksaan mikroskopik langsung diperlukan untuk
mendiagnosis penyakit TB, sehingga hasil pemeriksaan 2 dari 3 sampel pada sputum
 SPS tersebut positif maka hasil BTA positif. Mutu pemeriksaan sangatlah ditentukan
oleh teknik pengumpulan sputum yang baik dan harus tetap dijaga dengan melakukan
pemantauan langsung terhadap tehnik pengambilan sampel.
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun
Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis
tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenissputum:
 Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.
 Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.
 Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam
Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin
0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu
carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa
yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel
bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak
BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat,
yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian
dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan
terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna
kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Pada
pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl- Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua,
yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan
asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan
asam (non acid fast).
 Negatif : apabila tidak ditemukan BTA.
 Positif : apabila terdapat 1 - 9 BTA / 100 lapang pandang.
 Positif 1 : apabila terdapat 10 - 90 BTA / 100 lapang pandang.
 Positif 2 : apabila terdapat 1 - 9 BTA / 1 lapang pandang.
 Positif 3 : apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang
C. Kultur Bakteri Urine
Kultur urine adalah metode pemeriksaan untuk mendeteksi adanya bakteri di
dalam urine, sebagai pertanda dari infeksi saluran kemih. Selain mendeteksi
keberadaan bakteri, kultur urine juga dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri
penyebab infeksi. Saluran Kemih (ISK) merupakan invasi mikroorganismepada salah
satu atau beberapa bagian saluran kemih. Saluran kemih yangbisa terinfeksi antara
lain urethra (urethritis), kandung kemih (cystitis),ureter (uretheritis), jaringan ginjal
(pyelonefritis). ISK dapat mengenai pria maupun wanita dari semua umur baik anak-
anak, remaja, dewasamaupun lanjut usia. Infeksi ini terjadi karena naiknya kuman
melaluiuretra menuju kandung kemih dan saluran kemih yang lebih atas. Infeksijuga
dapat terjadi akibat penyebaran kuman melalui pembuluh darah dan limfe. Wanita
memiliki resiko lebih sering terkena ISK daripada pria, hal itu disebabkan karena
bakteri dari rektum dapat dengan mudah mencapai uretra dan menyebabkan infeksi.
Untuk menentukan benar atau tidaknya pasien menderita ISK dibutuhkan diagnosis
yang kuat. Diagnosis ISK dilakukan menggunakan sampel urin. Sampel urin
merupakan sediaan yang memiliki proporsi besar sebagai sampel yang sering
dikerjakan di laboratorium mikrobiologi. Untuk mendiagnosis ISK bisa menggunakan
berbagai metode. Metode yang digunakan yaitu kultur bakteri. ISK merupakan
keadaan dimana saluran kemih terinfeksi oleh patogen sehingga menyebabkan
adanya bakteri pada urin yang dihasilkan. ISK secara umum dibagi menjadi dua
yaitu ISK atas yang melibatkan ginjal dan ISK bawah. Beberapa orang lebih
rentan untuk menderita ISK diantaranya adalah orang dengan abnormalitas struktur
dan fungsi pada saluran kemih seperti adanya kista dan divertikel, serta defek
neurologis yang menyebabkan retensi urin. Adanya benda asing pada saluran
kemih, keabnormalitasan metabolik dan menurunnya status imunitas juga dapat
memicu timbulnya ISK. Diagnosis ISK dapat ditegakkan apabila hasil anamnesis
sesuai dengan gejala, pemeriksaan fisik menunjukkan adanya nyeri tekan suprapubik
yang dipastikan dengan pemeriksaan urin mikroskopik yang menunjukkan
peningkatan >103 bakteri per lapang pandang. ISK dapat disebabkan oleh beberapa
jenis bakteri. Jenis bakteri penyebab ISK dapat diketahui dengan cara melakukan
kultur pada urin yang dilakukan pada pasien dengan ISK berulang atau ISK
dengan komplikasi. Diagnosis ISK selama ini didasarkan pada anamnesis dan
pemeriksaan fisik yang mendukung adanya tanda dan gejala terjadinya ISK.
Pemeriksaan penunjang dibutuhkan untuk menentukan penatalaksanaan yang
 sesuai dengan penyakit yang terdiagnosis. Pemeriksaan penunjang ISK selama
ini menggunakan baku emas berupa kultur urin untuk melihat adanya patogen
penyebab ISK dan jumlah kolonisasi bakteri yang digunakan sebagai salah satu syarat
dari diagnosis ISK.

D. Identifikasi Bakteri Enterobacteriaceae

Bakteri adalah organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar
luas dibandingkan makhluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies
yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada
yang menguntungkan tetapi ada pulayang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang
membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme
uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik
atau mikroskopik. Bakteri terdapat ditempat dimana manusia hidup. Terdapatpada
udara yang kita hirup, pada makanan yang kita makan, jugaterdapat pada
permukaan kulit, pada jari tangan, pada rambut, dalam rongga mulut, usus, dalam
saluran pernafasan dan pada seluruh permukaan yang terbuka dan dianggap
sebagai flora normal. Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis
mikroba tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang
spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Setiap
mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga hal ini
dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untukisolasi, identifikasi dan
konfirmasi. Enterobacteriaceae termasuk dalam famili bakteri, sebagian besar lebih
dikenal bersifat patogen, sepertiSalmonella dan Eschericia coli. Ilmu genetika
menempatkan Enterobacteriaceae di antara Proteobacteria, dan mereka memberikan
perintah mereka sendiri (Enterobacteriales), meskipun hal ini kadang-kadang
diambil untuk memasukkan beberapa sampel lingkungan terkait. Enterobacteriaceae
adalah kuman yang hidup di usus besar manusia dan hewan, tanah, air dan dapat pula
ditemukan pada komposisi material. Sebagian kuman enterik ini tidak menimbulkan
penyakit pada host (tuan rumah) bila kuman tetap berada di dalarn usus besar, tetapi
pada keadaan-keadaan dimana terjadi perubahan pada hostatau bila ada kesempatan
memasuki bagian tubuh yang lain, banyak diantara kuman ini mampu menimbulkan
penyakit pada tiap jaringan tubuh manusia. Organisme-organisme di dalam
famili ini pada kenyataannya mempunyai peranan penting di dalam infeksi
nosokomial misalnya sebagai penyebab infeksi saluran kemih, infeksi pada luka, dan
 infeksi lainnya. Enterobacter sp. merupakan salah satu jenis bakteri yang tergolong
dalam family Enterobactericeae bersama dengan Shigella, Salmonella, Klebsieell,
Proteus, E.coli dan sebagainya. Habitat umum dari bakteri ini adalah di usus manusia
dan hewan. Beberapa spesies dari Enterobacter yaitu Aerogenes Enterobacter,
E. amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus, E. cloacae, E. cowanii,E. dissolvens, E.
gergoviae, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, E.nimipressuralis; E. pyrinus , E.
Sakazakii. Anggota Enterobacteriaceae yang bentuk batang, dan biasanya memiliki
panjang 1-5 pM. Seperti Proteobacteria lain mereka bersifat Gram negatif,
anaerob fakultatif , dapat memfermentasi gula untuk menghasilkan asam laktat dan
berbagai produk akhir lainnya. Kebanyakan juga dapat mengubah nitratmenjadi nitrit,
walaupun ada pengecualian (misalnya Phoptorhadus). Apabila Enterobacteriaceae
diuji dengan tes katalase maka hasilnya positif, hal tersebutmenunjukkan bahwa
Enterobacteriaceae mengandung enzim katalase. Namum apabila diuji dengan tes
oksidase, maka hasilnya negatif. Kebanyakan memiliki banyak flagel digunakan
untuk bergerak, tetapi ada juga beberapa kelompok yang non-motil.
Enterobacteriaceae merupakan bakteri non-spora dan membentuk reaksi katalase
bervariasi antara Enterobacteriaceae. Sebagian besar strainnya memiliki fimbria
adhesif. Dalam pertumbuhannya, Enterobacteriaceae kurang atau sedikit
memerlukan NaCl. Banyak anggota famili ini adalah bagian normal dari flora usus
ditemukan dalam usus manusiadan hewan lainnya, sementara yang lain
ditemukan dalam air atau tanah,atau parasit pada berbagai hewan dan tumbuhan
yang berbeda. Eschericia coli, lebih dikenal sebagai E.coli, adalah salah satu model
organisme yang paling penting, serta genetika dan biokimia telah banyak
dipelajari. Kebanyakan anggota Enterobacteriaceae memiliki fimbriae peritrik Tipe I
berkaitan dalam adhesi sel bakteri untuk host mereka. Sering dijumpai pada
permukaan eksternal atau internal dari tubuh sebagai infeksi opurtunistik terutama
sesudah prosedur invasif seperti pembedahan dan kateterisasi. Bahan pemeriksaan
kuman enteric dapat dari berbagai sumber seperti: feses, usap dubur (rectal swab),
urine, darah, usap tenggorokan, dan sebagainya. Berbagai media dapat digunakan
untuk membiakkan kuman enteric. Specimen yang dapat ditumbuhkan pada media
pengaya, yaitu Selenit Cystein Broth (SCB) sebelum dikultur pada media selektif dan
diferensial seperti MCA, EMB, atau SSA. Pemeriksaan biokimia dapat dilakukan
selanjutnya untuk mengidentifikasi jenis bakteri yang ditemukan.
E. Identifikasi Bakteri Vibrio
 V. cholerae termasuk gram negatif, berbentuk batang bengkok sepertikoma
dengan ukuran panjang 2-4 μm. Koch menamakannya “kommabacillus”. Bakteri ini
bisa menjadi batang lurus mirip dengan bakteri enteric gram negatifbila inkubasi
diperpanjang. Bakteri V. cholera memiliki satu buah flagel haluspada ujungnya
(Monotrikh) yang menyebabkan bakteri ini bergerak sangat aktif.Bakteri ini tidak
membentuk spora, bentuk koloninya cembung (convex), dan bergranula bila disinari.
V. cholera bersifat aerob atau anaerob fakultatif dengan suhu pertumbuhanyang
berkisar antara 18-37ºC. bakteri ini tumbuh baik pada jenis media yangmengandung
garam mineral dengan asparagine sebagai sumber karbon dannitrogen. Pada media
TCBS (thiosulfate-citrate-bile-sucrose) pertumbuhan V.cholera akan menjadi lebih
baikdan cepat, menghasilkan koloni berbentuk bulat,berwarna kuning, berdiameter 1-
3 mm dengan mukoid sehingga dapat dibedakandari koloni bakteri lain untuk
memudahkan dalam proses isolasinya (Purwoko,2007) V. cholera dapat juga
tumbuh pada pH yang sangat tinggi (8,5-9,5),namun umumnya bakteri ini
memerlukan pH yang netral untuk pertumbuhandengan kecepatan optimum dan pada
pH asam akan mengalami laju kematianyang sangat cepat. V. Cholera memfermentasi
sukrosa danmaltose tanpa menghasilkan gas pada media TCBS. Bakteri ini akan
tumbuh dengan baik pada media APW (alkali pepton water) setelah 6 jam masa
inkubasipada suhu kamar sehingga media ini dipakai untuk media transport
(Amelia,2005) Secara alamiah, V. cholera pathogen terhadap manusia. Bakteri ini
sangatsensitive dengan asam karena bakteri ini tidak tahan asam dan panas. Apabila
seseorang mengonsumsi makanan yang mengandung bakteri sebanyak 102-
104sel/gram pada makanan maka seseorang dengan asam lambung yang normal
akanterinfeksi oleh V. Cholera.
F. Identifikasi Bakteri Staphylococcus Aerus
Staphylococcus aureus adalah bakteri berbentuk kokus dan bersifat gram
positif, tersebar luas dialam dan ada yang hidup sebagai flora normal pada manusia
yang terdapat di aksila, daerah inguinal dan perineal, dan lubang hidung bagian
anterior. Sekitar 25-30 % manusia membawa Staphylococus aureus didalam rongga
hidung dan kulitnya (Soedarto, 2014). Staphylococcus aureus dapat menimbulkan
penyakit pada manusia atau bersifat patogen. Jaringan tubuh dapat diinfeksi dan
menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda khas, yaitu peradangan,
nekrosis, dan pembentukan abses. Infeksi yang disebabkan bakteri Staphylococcus
aureus dapat berupa infeksi tenggorokan, pneumonia, meningitis, keracunan makanan,
berbagai infeksi kulit, dan impetigo. Penyebaran penyakit ini cukup tinggi didaerah
endemik (FKUI, 2002). Penyakit yang disebabkan oleh Staphylococus aureus antara
lain, staphylococcal scalded skin syndrome yang terjadi pada 98% anak-anak usia
kurang dari enam tahun (King, 2010). Selanjutnya osteomielitis yang ditemukan pada
60-70% kasus, kemudian abses otak yang ditemukan sebesar 10-15% kasus (Brook et
al., 2007). Bakteremia sebesar 11-53%. Pada pneumonia terdapat 18,1% kasus (Kollef
et al., 2005), yang sering dihubungkan dengan menstruasi yaitu toksik syok syndrome
0,001%. kasus. Selain itu terdapat furunkel, selulitis, dan infeksi gastroenteritis yang
diakibatkan enterotoksin dari Staphylococus aureus (WHO, 2012). Upaya pencegahan
infeksi oleh bakteri Staphylococus aureus dengan dilakukan pengobatan sedini
mungkin. Untuk itu diperlukan diagnosa infeksi dengan tepat yaitu dilakukan isolasi
dan identifikasi bakteri yang berasal dari penderita infeksi. Identifikasi bakteri dapat
dilakukan dengan beberapa cara seperti mengamati sifat morfologi koloni bakteri,
mengamatin secara mikroskopis melalui pewarnaan bakteri, dan identifikasi melalui
uji biokimia. Uji biokimia didasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang
disebabkan oleh daya kerja enzim (Radji M., 2011). Salah satu uji biokimia yang
digunakan untuk penentuan spesies bakteri adalah tes koagulase. Tes koagulase
digunakan untuk diferensiasi Staphylococcus aureus dari spesies Staphylococcus
lainnya. Bakteri Staphylococus aureus memberikan hasil positif dikarenakan mampu
mengubah faktor koagulase reaktif didalam serum (faktor VII). Faktor ini bereaksi
dengan enzim koagulase dan menghasilkan esterase dan aktivitas pembekuan dengan
cara pengaktifan protrombin menjadi thrombin, sehingga enzim koagulase dapat
menggumpalkan fibrinogen didalam plasma dan menyebabkan pembentukan bekuan
fibrin untuk melindungi diri terhadap fagositosis dan respon imun hospes ( Soedarto,
2014). Tes koagulase dilakukan dengan menggunakan metode slide, metode slide jauh
lebih cepat dari metode tabung karena memerlukan waktu selama 1-2 menit yang
ditandai dengan adanya gumpalan atau butiran pasir (FKUB, 2003; Sacher R.A., 2004
; Jawetz, et al., 2008) . Radji, (2011). Uji koagulase dilakukan menggunakan plasma
sitrat 3,8% 1:9 dengan perbandingan 1 natrium sitrat dan 9 bagian darah, peneliti
memilih plasma manusia karena mempertimbangkan penelitian yang dilakukan oleh
Jiwintarum, 2015. Berjudul perbedaan hasil uji koagulase menggunakan plasma sitrat
manusia 3,8%, plasma sitrat domba 3,8%, dan plasma kelinci 3,8% pada bakteri
Staphylococcus aureus, hasil menunjukkan bahwa plasma sitrat manusia, domba, dan
kelinci dapat digunakan untuk uji koagulase. Waktu terbentuknya gumpalan tercepat
 diperoleh dengan menggunakan plasma sitrat domba 3,8%, namun karena beberapa
faktor, salah satunya biaya, maka peneliti menggunakan plasma sitrat manusia 3,8%,
yang waktu terbentuknya gumpalan lebih cepat dari plasma sitrat kelinci 3,8%, selain
itu mudah didapat. Plasma sitrat digunakan karena baik dalam memelihara
faktorfaktor pembekuan darah, tetapi plasma sitrat jarang sekali dipakai atau jika tidak
ada pemeriksaan hemostatis maka tidak ada persediaan plasma sitrat, sehingga harus
membuat terlebih dahulu, selain itu secara pengadaan plasma sitrat lebih lama.
Menurut buku Vandepitte, 2010. Serta penelitian Karimela, 2017. Plasma yang
digunakan untuk uji koagulase selain plasma sitrat 3,8% juga dapat menggunakan
plasma EDTA 10% 1:1 dengan perbandingan 1 bagian darah dan bagian EDTA.
Plasma EDTA 10% memiliki sifat-sifat sama dengan Natrium sitrat 3.8%, selain itu
EDTA 10% juga mengandung fibrinogen sama dengan Na sitrat sehingga waktu
terbentuknya gumpalan hampir sama dengan menggunakan Natrium sitrat, dan EDTA
10% banyak digunakan dilapangan sehingga persediaannya banyak dan secara
pengadaan lebih mudah dari pada plasma sitrat 3,8%. Oleh sebab itu, peneliti ingin
meneliti apakah plasma EDTA 10% dapat digunakan sebagai alternatif pengganti
plasma Sitrat 3,8% , sehingga jika penelitian ini menghasilkan hasil yang sama, maka
plasma EDTA 10% dapat digunakan sebagai pengganti plasma sitrat 3,8% untuk tes
koagulase bakteri Staphylococcus aureus.
G. Angka Kuman Makanan/Minuman
Makanan dan minuman adalah semua bahan baik dalam bentuk alamiah
maupundalam bentuk buatan yang dimakan manusia kecuali air dan obat-obatan,
karena itumakanan merupakan satu-satunya sumber energi bagi manusia. Sebaliknya
makananjuga dapat menjadi media penyebaran penyakit. Dengan demikian
penangananmakanan harus mendapat perhatian yang cukup. Makanan yang
diproduksi dandiedarkan harus memenuhi syarat-syarat keselamatan, kesehatan,
standar mutu, ataupersyaratan yang ditetapkan oleh Menteri untuk tiap jenis
makanan.Upaya pengamanan makanan dan minuman pada dasarnya meliputi
orang yangmenangani makanan, tempat penyelenggaraan makanan, peralatan
pengolahanmakakandan proses pengolahannya. Ada beberapa faktor yang
mempengaruhiterjadinyakeracunan makanan, antara lain adalah higienis perorangan
yang buruk,carapenanganan makanan yang tidak sehat dan perlengkapan pengolahan
makananyangtidak bersih.Mengingat bahwa makanan dan minuman yang digunakan
kemungkinan mengandungbakteri patogen maka sebelum digunakan harus diperiksa
 terlebih dahulu, sebabmakanan dan minuman harus bebas dari bakteri-bakteri patogen
tersebut. Untukpemeriksaan tersebut diperlukan pengujian bakteriologis makanan dan
minuman dilaboratorium. Pengujian ini dapat menentukan makanan dan minuman
yang diperiksatersebut mengandung bakteri patogen atau tidak. Dalam
prakteknya, pengujianmakanan dan minuman secara bakteriologis untuk menentukan
ada tidaknya bakteri bentuk koli. Perhitungan Bakteri pada pemeriksaan suatu
produk, jumlah bakteri akanmenggambarkan mutu bahan baku, proses pembuatan
dan tingkat kerusakan suatubahan makanan. Metode perhitungan sangat banyak,
hanya biasanya metode yangdipilih adalah disesuaikan dengan kepentingan
pemeriksaan, kecepatan dan ketepatanhasil pemeriksaan.
Angka kuman atau angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan
adanyamikroorganisme pathogen atau nonpathogen menurut pengamatan secara
visual ataudengan kaca pembesar pada media penanaman yang diperiksa, kemudian
dihitungberdasarkan lemkpeng dasar untuk standar test terhadap bakteri atau jumlah
bakterimesofil dalam satu gram atau 1 cm2.Pengenceran bertahap dari suatu zat
dalam larutan yang digunakan untuk menghitungjumlah kuman baik dalam
makanan dan minuman. Faktor pengenceran disetiaplangkah selalu konstan.
Sebuah pengenceran dalam praktikum ini dilakukan sebanyaklima kali. Pembuatan
pengenceran bertujuan untuk mendapatkan jumlah koloni yangideal yaitu antara 30
sampai 300 koloni. Untuk pemeriksaan kuman sendiri terdapatdua metode, yaitu
metode tuang dan metode sebaran atau taburan. Metode tuangdengan prinsip kuman
yang berada dalam sampel dengan tingkat pengenceran tertentudicampur secara
merata pada suhu tertentu. Sedangkan metode sebaran adalah kumanyang berada
dalam sampel dengan tingkat pengenceran tertentu
H. Most Probable Number (MPN)
Standar Air Minum, menurut standar WHO semua sampel tidak boleh
mengandungE. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform. Standar WHO:
Dalam setiaptahun, 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung coliform dalam
100 ml,Tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml, Tidak ada sampel
yangmengandung coliform lebih dari 10 dalam 100 ml, Tidak boleh ada coliform
dalam100 ml dan dua sampel yang berurutan (AOAC,2000).Bakteri coliform adalah
golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluranpencernaan manusia. Bakteri
coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteripatogenik lain. Lebih tepatnya,
sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteriindikator adanya pencemaran bakteri
patogen. Penentuan coliform fekal menjadiindikator pencemaran dikarenakan jumlah
koloninya pasti berkorelasi positif dengankeberadaan bakteri patogen. Selain itu,
mendeteksi Coliform jauh lebih murah,cepat, dan sederhana daripada mendeteksi
bakteri patogenik lain (Dad,2000).Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan
Entereobacter aerogenes. Jadi,coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit
kandungan coliform, artinya,kualitas air semakin baik. Berdasarakan latarbelakang
itulah maka penngunaan ujitest MPN penting untuk dilakukan.
 BAB III
METODE

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan pada bulan Oktober 2021. Analisis dilakukan di
Laboratorium Bakteriologi Poltekkes Kemenkes Denpasar.
B. Alat dan Bahan
Pewarnaan Gram
 Alat
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah ose, lampu spritus/lampu
bunchen, jembatan pengecatan, mikroskop.
 Bahan
Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah Gram A (carbol gentian
violet), Gram B (lugol/iodine), Gram C (alkohol 96%), Gram D (solution
fuchsin/safranin, minyak imersi, objek glass, tissue, sputum/dahak.
Pewarnaan BTA
 Alat
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah ose, lampu spritus/lampu
bunchen, jembatan pengecatan, mikroskop.
 Bahan
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah ZN A(carbol fuchsin 0,3%),
ZN B (asam alkohol), ZN C (solution methylene blue 0,3%), minyak imersi,
objek glass, tissue, ose/lidi, pinset, drop pipet, pengukur waktu/timer,
sputum/dahak.
Pembuatan media biakan dan mdia uji biokimia
 MSA
  Alat: Beaker glass, erlenmeyer, gelas ukur, cawan petri, pipet tetes,
neraca analitik, aluminium foil, api spirtus, korek api, spatula,
autoclave.
 Bahan: Akuades, media MSA, pH media, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N,
kapas, kasa dan spirtus
 BAP
 Alat: Gelas ukur, gelas arloji, erlenmeyer, cawan petri, neraca analitik,
aluminium foil, pipet tetes, pengaduk kaca/spatula, bunsen, korek api,
wadah spirtus, autoclave
 Bahan: Media Blood Agar base, sampel darah, aquadest, pH media.
 MCA
 Alat: Gelas ukur, gelas arloji, erlenmeyer, cawan petri, neraca analitik,
kasa asbes, pipet tetes, pengaduk kaca/spatula, bunsen, korek api,
wadah spirtus, autoclave
 Bahan: Media Mac Conkey, aquadest, spirtus, Larutan NaOH 0,1N,
Larutan HCl 0,1 N, pH media
 SSA
 Alat: Beaker glass, erlenmeyer, gelas arloji, gelas ukur, cawan petri,
pipet tetes, neraca analitik, kasa abses, api spirtus, korek api, spatula,
petridish
 Bahan: Akuades, media SSA, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N, kapas, kasa dan
spirtus, pH media
 TCBS
 Alat: Beaker glass, erlenmeyer, gelas arloji, gelas ukur, cawan petri,
pipet tetes, neraca analitik, kasa abses, api spirtus, korek api, spatula,
petridish
 Bahan: Akuades, media TCBS, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N, kapas, kasa
dan spirtus
 TSIA
 Alat: Gelas ukur, gelas arloji, beaker glass, tabung reaksi kecil / tabung
gula-gula, rak tabuung reaksi, neraca analitik, kasa asbes, pipet tetes,
pengaduk kaca/spatula, bunsen, korek api, wadah spirtus, autoclave
  Bahan: Media TSIA, larutan NaOH 0,1 N, aquadest, larutan HCl 0,1N,
kapas dan kasa
 SIM
 Alat: Beaker glass, aluminium foil, benang pulung, neraca analitik,
erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, api bunsen, pengaduk kaca,
kompor listrik, kapas berlemak, botol semprot, autoclave, pipet ukur,
bola hisap, kertas buram
 Bahan: SIM agar powder, aquades, kertas Ph
 SC
 Alat: Beaker glass, Erlenmeyer, Gelas arloji, Gelas ukur, tabung gula-
gula, Pipet tetes, Neraca analitik, Kasa abses, pipet tetes, Api spirtus,
korek api, Spatula/batang pengaduk, autoclave
 Bahan: Akuades, media simon citrat, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N, pH
media, kapas, kasa dan spirtus

Kultur Urine

 Alat: Ose bulat dan ose khusus, api bunsen, korek, petridish
 Bahan: Sampel urine
 Media: MCA, dan BAP

Kultur Bakteri Enterik

 Alat: Ose bulat dan lancip, api bunsen, korek, petridish

 Bahan: Sampel feses
 Media: MCA, dan SSA

Kultur Bakteri Vibrio

 Alat: Ose bulat, api bunsen, korek, petridish

 Bahan: Sampel feses
 Media: TCBS

Kultur Bakteri Staphylococcus aureus

 Alat: Ose bulat, api bunsen, korek, petridish

 Bahan: Sampel sputum
 Media: MSA
 Pemeriksaan Angka Kuman atau Total Plate Count (PTC)

 Alat: Oven, autoclove, incubator, waterbath, pH meter, timbangan, water

deionizer, botol dilusi, pipet : 1 ml, 10 ml, api bunchen / api spiritus, tabung
reaksi 16 x 160 mm yang didalamnya berisi tabung durham dengan posisi
terbalik, rak tabung reaksi, ose, botol erlenmeyer, beaker glass
 Bahan: Air keran
 Reagen & Media Yang Digunakan: Sodium Thiosulfate 10 %, Ethanol 70 %,
Lactose Broth ( LB ), Brilliant Green Lactose Bile Broth ( BGLB )

Most Probable Number (MPN)

 Alat: Mikroskop, autoclove, incubator, timbangan , obyek glass, labu

erlenmeyer, gelas takaran, rak tabung reaksi, lemari es, botol steril bermulut
besar, lampu spiritus, pinset, spidol, water bath, tabung reaksi , petri dish,
pipet takar 1 ml, 5 ml, 10 ml, ose, koloni counter, kaca pembesar, pembuka
kaleng atau tutup botol, pisau, blender / mortal
 Bahan: Nagasari (kue basah)
 Reagen dan media yang digunakan: Garan Buffer phosphate pH 7,2, Media
untuk pemeriksaan Angka Kuman : Plate Count Agar / Nutrient Agar.
C. Cara Kerja
1. Pewarnaan Gram
 Siapkan alat dan bahan yang diperlukan
 Bersihkan objek glass menggunakan tissue
 Fiksasi objek glass dengan melidah apikn di atas lampu spiruts lebih
kurang 3 kali bolak balik
 Ambil ose dan fiksasi di tas lampu spritus sampai merah, kemudian
dinginkan
 Ambil sampel sputum/dahak menggunakan ose dan langsung dihapuskan
pada objek glass secara merata
 Fiksasi sebentar di atas lampu spritus agar lebih cepat keringnya
 Tempatkan di atas jembatan pengecatan
 Tuangkan cat Gram A samapi tertutup semua hapusan
 Tunggu 3 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir
 Tuangkan cat Gram B sampai tertutup semua hapusan
  Tunggu 45 detik selanjutnya dicuci dengan air mengalir
 Tuangkan cat Gram C samapi tertutup semua hapusan
 Tunggu 1 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir
 Tuangkan cat Gram D samapi tertutup semua hapusan
 Tunggu 2 menit selanutnya dicuci dengan air mengalir
 Kemudian tunggu prepaat sampai kering
 Baca preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran 10x dan 40x
2. Pewarnaan BTA
Cara Kerja Pembuatan Hapusan:
a) Bersihkan obyek glass dengan tissue untuk menghilangkan lemak yang
ada.
b) Fiksasi obyek glass dengan melidah apikan di atas lampu spiritus lebih
kurang 3 kali dan bolak-balik
c) Pada ujung obyek glass diberi label.
d) Ambil ose dan fiksasi di atas lampu spiritus sampai merah, kemudian
dinginkan
e) Ambil NaCl dengan ose dan teteskan di atas obyek glass secukupnya.
f) Ambil sampel sputum menggunakan lidi dan langsung dihapuskan
pada obyek glass secara merata dengan luas lbk 1 cm2
g) Campur koloni tersebut dengan memutar ujung ose tersebut, sehingga
koloni bercampur secara merata.
h) Fiksasi sebentar di atas lampu spiritus agar lebih cepat keringnya.
i) Preparat / hapusan yang sudah siap tempatkan di atas jembatan
pengecatan
Cara Kerja Pewarnaan Metode Ziehl Neelsen (ZN)
a) Letakkan hapusan dahak yang telah difiksasi pad arak/ jembatan
pengecatan dengan hapusan menghadap ke atas
b) Teteskan larutan ZN A ( larutan Carbol Fuchsin 0,3 % ) sampai
menutupi seluruh permukaan hapusan dahak.
c) Panaskan dengan nyala api spiritus sampai keluar uap selama 3-5
menit. Zat warna tidak boleh mendidih atau kering. Apabila mendidih
atau kering maka carbol fuchsin akan terbentuk kristal ( partikel kecil
yang dapat terlihat seperti kuman TBC )
 d) Singkirkan api spiritus. Diamkan sediaan selama 5 menit.
e) Bilas sediaan dengan air mengalir pelan sampai zat warna bebas
terbuang ( air yang melewati hapusan bening ).
f) Tetesi sediaan dengan ZN B ( asam alcohol 3 % ) sampai warna merah
fuchsin hilang
g) Bilas dengan air mengalir pelan
h) Teteskan ZN C ( Methylene blue 0,3 % ) pada sediaan sampai
menutupi seluruh permukaan hapusan
i) Diamkan 10-20 detik
j) Bilas dengan air mengalir secara pelan ( sampai air yang melewati
hapusan bening )
k) Keringkan sediaan di atas rak pengering / jembatan pengecatan di
udara terbukan ( jangan dibawah sinar matahari langsung )
Pembacaan Sediaan Dahak:
a) Tempatkan preparat di atas meja benda mikroskop secara benar
b) Atur obyektif dari mikroskop 10x dan okuler 10x
c) Atur okuler agar sejajar dengan ke dua mata
d) Cari lapang pandang dengan menaikkan atau menurunkan meja benda
sampai ketemu bayangan kasar berwarna sesuai warna cat yang
digunakan
e) Teteskan satu tetes minyak imersi diatas hapusan dahak
f) Periksa dengan menggunakan lensa okuler 10x dan obyektif 100x
g) Cari Basil Tahan Asam (BTA) yang berbentuk batang dan berwarna
merah
h) Periksan paling sedikit 100 lapang pandang adau dalam waktu kurang
lebih 10 menit, dengan cara menggeserkan sediaan menurut arah :
kanan-turun-kiri –turun-kanan daan seterusnya.
i) Amati hasil yang ditemukan.
3. Kultur Urine
a) Sterilkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70%, siapkan alat
dan bahan
b) Hidupkan api Bunsen, dan bekerjalah di dekat api bunsen
c) Selanjutnya fiksasi ose sampai membara dan pinggiran cawan petri
yang berisi media di api Bunsen.
 d) Ambil sampel urin menggunakan ose khusus lalu disubkultur pada
media BAP dengan goresan 2 kuadran, setelah itu fiksasi lagi
pinggiran cawan petri
e) Dilanjutkan dengan mengambil sampel urin menggunakan ose yang
difiksasi tadi, lalu disubkultur pada media MCA dengan goresan 4
kuadran. Setelah itu ose dan pinggiran cawan petri di fiksasi dekat api
bunsen
f) Amati koloni yang tumbuh pada media-media tersebut di identifikasi
ukuran, bentuk, tekstur, dan warna (parameter penting).
1) Kultur Bakteri Vibrio
a) Sterilkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70%, siapkan alat
dan bahan
b) Hidupkan api Bunsen, dan bekerjalah di dekat api bunsen
c) Ambil 1-2 spesimen berupa feses dengan menggunakan ose bulat yang
sudah di sterilkan dengan cara fiksasi di api Bunsen.
d) Selanjutnya fiksasi pinggiran cawan petri yang berisi media di api
Bunsen sebanyak 2-3 kali.
e) Ambil 1-2 sampel feses dengan menggunakan ose bulat yang sudah
steril, kemudian disubkultur ke media TCBS dengan teknik goresan
empat kuadran.
f) Lakukan sterilisasi pada alat-alat yang digunakan tadi dengan cara
melewatkannya di atas api Bunsen.
g) Media TCBS diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
h) Diamati koloni yang tumbuh pada media TCBS (bentuk, ukuran,
tekstur, warna)
4. Kultur Bakteri Enterik
a) Sterilkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70%, siapkan alat
dan bahan
b) Hidupkan api Bunsen, dan bekerjalah di dekat api bunsen
c) Ambil 1-2 spesimen berupa feses dengan menggunakan ose bulat yang
sudah di sterilkan dengan cara fiksasi di api Bunsen.
d) Selanjutnya fiksasi pinggiran cawan petri yang berisi media di api
Bunsen sebanyak 2-3 kali.
e) Kemudian disubkultur dengan teknik goresan empat kuadran pada
media MCA, dan/atau SSA.
f) Lakukan sterilisasi pada alat-alat yang digunakan tadi dengan cara
melewatkannya di atas api Bunsen.
g) Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam.
h) Amati koloni yang tumbuh pada media-media tersebut diidentifikasi
ukuran, bentuk, tekstur, dan warna (parameter penting) untuk
menentukan kemampuannya dalam fermentasi laktosa.
i) Langkah selanjutnya dilakukan uji biokimia dengan cara pilih salah
satu koloni tunggal
- Untuk media TSIA, diambil 1 ose koloni, kemudian lakukan
penusukan dengan ose lurus mulai dari pangkal kemiringan sampai
ke dasar tabung, saat menarik ose kembali, permukaan miring
media digores.
- Untuk media SIM, diambil 1 ose (lancip) koloni yang sama,
kemudian ditusukkan tegak lurus pada media. Setelah diinkubasi
selama 24 jam, kemudian tambahkan reagen Ehrlich/Kovac’s untuk
melihat terbentuknya lapisan cicin berwarna merah di permukaan
biakan.
- Untuk media SC, diambil 1 ose (bulat) koloni yang sama,
kemudian tusukan ke media
j) Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
k) Diamati perubahan yang terjadi
- Pada media TSIA amati perubahan warna dibagian dasar dan
lereng.
 Hanya memfermentasi glukosa  Dasar berwarna kuni,
dan lereng berwarna merah
 Memfermentasi semua karbohidrat  Dasar dan lereng
berwarna kuning
 Tidak memfermentasi semua karbohidrat  Dasar dan
lereng berwarna merah, dan disertai adanya pembentukan
gas CO2
 - Pada media SIM, sulfide amati ada tidaknya pembentukan gas
(H2S), pada indol amati ada tidaknya lapisan seperti cicin di
permukaan biakan setelah ditambahkan reagen kovac, sedangkan
pada molalitas amati penyebaran bakteri.
- Pada media SC amati perubahan warna dari hijau menjadi biru.
Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka
media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
5. Kultur Bakteri Vibrio
i) Sterilkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70%, siapkan alat
dan bahan
j) Hidupkan api Bunsen, dan bekerjalah di dekat api bunsen
k) Ambil 1-2 spesimen berupa feses dengan menggunakan ose bulat yang
sudah di sterilkan dengan cara fiksasi di api Bunsen.
l) Selanjutnya fiksasi pinggiran cawan petri yang berisi media di api
Bunsen sebanyak 2-3 kali.
m) Ambil 1-2 sampel feses dengan menggunakan ose bulat yang sudah
steril, kemudian disubkultur ke media TCBS dengan teknik goresan
empat kuadran.
n) Lakukan sterilisasi pada alat-alat yang digunakan tadi dengan cara
melewatkannya di atas api Bunsen.
o) Media TCBS diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
p) Diamati koloni yang tumbuh pada media TCBS (bentuk, ukuran,
tekstur, warna)
6. Kultur Bakteri Staphylococcus aureus
a) Sterilkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70%, siapkan alat
dan bahan
b) Hidupkan api Bunsen, dan bekerjalah di dekat api bunsen
c) Ambil 1-2 spesimen berupa feses dengan menggunakan ose bulat yang
sudah di sterilkan dengan cara fiksasi di api Bunsen.
d) Selanjutnya fiksasi pinggiran cawan petri yang berisi media di api
Bunsen sebanyak 2-3 kali
e) Ambil 1-2 sampel sputum dengan menggunakan ose bulat yang sudah
steril, kemudian disubkultur dengan metode gores empat kuadran ke
media MSA.
 f) Lakukan sterilisasi pada alat-alat yang digunakan tadi dengan cara
melewatkannya di atas api Bunsen.
g) Media dinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
h) Diamati koloni yang tumbuh, fermentasi mannitol ditandai dengan
perubahan warna media dari merah menjadi kuning
7. Pemeriksaan Angka Kuman atau Total Plate Count (PTC)
Makanan Padat:
a) Spesimen dihancurkan dengan menggunakan blender, apabila tidak ada
blender dapat menggunakan mortal steril
b) Masukkan 10 gram bahan tersebut ke dalam labu Erlenmeyer berskala
c) Tuangkan 90 ml air garam fisiologis atau aquadest steril atau garam
buffer phosphate
d) Untuk pemeriksaan bacillus sereus harus menggunakan larutan garam
buffer phosphate
e) Kocok sebanyak kurang lebih 25 kali sampai homogen
f) Bahan dengan pengenceran tersebut siap dipergunakan untuk
pemeriksaan Angka Kuman, MPN, dam pemeriksaan biakan
Cara Pemeriksaan:
a) Siapkan 6 tabung reaksi steril, susun pada rak tabung
b) Masing-masing tabung secara berurutan diberi tanda 10−1, 10−2 , 10−3 ,
10−4, 10−5 , 10−6 sebagai kode pengenceran dan tanggal pemeriksaan
c) Siapkan pula 7 petri dish steril
d) Pada 6 petri dish diberi tanda pada bagian belakangnya sesuai dengan
kode pengenceran dan tanggal pemeriksaan. Sedangkan satu petri dish
lainnya diberi kode “control”
e) Pada tabung ke dua sampai dengan ke enam, diisi dengan 9 ml air
garam fisiologis atau aquadest steril, atau larutan garam buffer
phosphate, untuk pemeriksaan Bacillus cereus harus menggunakan
laurtan garam buffer phosphate.
f) Kocok bahan spesimen diatas dalam labu Erlenmeyer sebanyak 25 kali
sampai homogen, lalu ambil 10 ml masukkan pada tabung ke Satu
g) Pindahkan 1 ml bahan dari tabung ke satu ke dalam tabung dua dengan
pipet, cairan dibuat sampai homogen
 h) Pindahkan 1 ml bahan dari tabung ke dua ke tabung ke tiga, cairan
dibuat sampai homogen
i) Demikian seterusnya dilakukan sampai tabung ke enam.
j) Pengenceran yang diperoleh pada ke enam tabung adalah 10−1, 10−2 ,
10−3 , 10−4, 10−5 , 10−6 sesuai dengan kode pengenceran yang telah
tercantum sebelumnya
k) Dari masing-masing tabung di atas dimulai dari tabung ke enam
dengan menggunakan pipet steril, diambil 1 ml dimasukkan ke dalam
masing-masing petri dish, sesuai dengan kode pengenceran yang sama.
l) Kemudian ke dalam masing-masing petri dish dituang Plate Count
Agar / Nutrient Agar cair yang telah dipanaskan dalam water bath ± 45
°C sebanyak 15-20 ml.
m) Masing-masing petri dish digoyang perlahan-lahan hingga tercampur
merata dan biarkan hingga dingin dan membeku.
n) Masukkan dalam incubator 37°C selama 2 x 24 jam dalam keadaan
terbalik
o) Kontrol dibuat dari cairan air garam fisiologis / aquadest steril atau
larutan garam buffer phosphate 1 ml. Untuk pemeriksaan Bacillus
cereus harus menggunakan larutan garam buffer phosphate,
dimasukkan ke dalam petri dish “control” dan dituangi Plate Count
Agar / Nutrient Agar sebanyak 15-20 ml.
p) Pembacaan dilakukan setelah 2 x 24 jam dengan cara menghitung
jumlah koloni yang tumbuh pada tiap petri dish.
Pembacaan hasil:
a) Hitung koloni yang tumbuh pada tiap-tiap petri dish
b) Koloni-koloni yang bergabung menjadi stu atau membentuk deretan /
koloni yeng terlihat sebagai garis tebal atau jumlah koloni meragukan
dihitung sebagai 1 ( satu ) koloni kuman
c) Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada petri dish berisi control
d) Bila jumlah koloni pada petri dish control lebih besar dari 10,
pemeriksaan harus diulang karena sterilitas dianggap kurang baik.
Pemeriksaan ulang harus menggunakan Plate Count Agar / Nutrient
Agar yang lain
 Pelaporan:
a) Pelaporan didasarkan pada perhitungan angka kuman yang diperoleh
b) Perhitungan hanya dilaksanakan pada petri dish yang menghasilkan
jumlah koloni antara 30 – 300 serta bila jumlah pada petri dish control
lebih kecil dari 10. Jumlah koloni pada masing-masing petri dish ini
harus terlebih dahulu dikurangi dengan jumlah koloni pada petri dish
control
8. Most Probable Number (MPN)
Pembuatan Media
 Lactose Broth (LB) Single Strength : tersedia media stock dalam
kemasan dari produsen dengan cara pembuatannya
a) Larutkan stock media LB dengan aquadest, campur hingga larut
b) Masukkan sebanyak 10 ml ke dalam tabung pembiakan (tabung reaksi)
yang berisi tabung durham dalam posisi terbalik
c) Tutup dengan tutup karet / kapas
d) Sterilisasi dalam autoclove pada suhu 121°C selama 15 menit (pH
setelah sterilisasi ± 6,9)

Catatan: untuk pembuatan media Lactose Broth (LB) yang double strength
sama dengan di atas, hanya penimbangannya 2 kali/double
 Brilliant Green Lactose Bili Broth ( BGLB ) : tersedia media stock
dari produsen berikut cara pembuatannya
a) Larutkan media stock dengan aquadest sesuai petunjuk pembuatannya
yang tertera, campurkan hingga larut
b) Masukkan sebanyak 10 ml ke dalam tabung pembiakan (reaksi) yang
berisi tabung durham dalam posisi terbalik
c) Tutup dengan tutup karet / kapas
d) Sterilisasi dalam autoclove pada suhu 121°C selamam 15 menit (pH
setelah sterilisasi ± 7,2)
 BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN

A. HASIL
1. Pewarnaan Gram

Gambar 1. Hasil Pewarnaan Gram

 Sampel : Biakan Bakteri
 Pewarnaan : Gram
 Bentuk : Batang (basil)
 Warna : Biru
 Gram : Positif
 Susunan : monobasil (satu-satu)

2. Pewarnaan BTA
 Gambar 2. Hasil Pewarnaan BTA
 Sampel : Sputum
 Pewarnaan : Ziehl Nelson
 Bentuk : Batang
 Warna : Biru
 Jenis : Tidak tahan asam

3. Kultur Bakteri Urine

a) Kultur bakteri urine pada media BAP
 Sampel : Urine
 Bentuk :-
 Warna :-
 Ukuran :-
 Tekstur :-
 Tepi koloni :-
 Permukaan :-
 Jumlah koloni :-

b) Kultur bakteri urine pada media MCA

  Sampel : Urine
 Bentuk :-
 Warna :-
 Ukuran :-
 Tekstur :-
 Tepi koloni :-
 Permukaan :-
4. Identifikasi bakteri enteric
a) Kultur bakteri enteric pada media EMB

 Sampel : Feses
 Bentuk : Bulat
 Warna : Merah
 Ukuran : Kecil, sedang sampai besar
 Tekstur : Halus
  Tepi koloni : Tidak bergerigi
 Permukaan : Tidak terdapat Lendir

5. Identifikasi Bakteri Vibrio

Dari hasil pengamatan makroskopis pada media agar Thiosulphate Citrate
Bile Sucrose (TCBS) yang diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37 C di
dapatkan hasil yang negative yaitu tidak ada pertumbuhan bakteri patogen
Vibrio cholera maupun bakteri Vibro sp. lainnya. Namun adanya
pertumbuhkan koloni dari spesies bakteri lain.

Tabel 1. Hasil Pengamatan Bakteri Vibrio

Kode Sampel Gambar Keterangan
Sampel feses - Interpretasi Hasil :

Negative ( - ) : tidak ada

pertumbuhan koloni bakteri
patogen Vibrio cholera
maupun bakteri Vibrio sp.
lainnya. Namun adanya
pertumbuhan koloni bakteri
lain dengan ciri – ciri warna
menyerupai warna media
pada media TCBS. Koloni
berbentuk bulat dengan
tekstur pinggiran smooth.
Ukuran koloni kecil hingga
sedang. Permukaan tidak
berlendir.

6. Identifikasi Bakteri Staphylococcus aureus

Dari hasil pengamatan makroskopis pada media Manitol Salt Agar (MSA) yang
diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37C di dapatkan hasil yang negative yaitu tidak
 ada pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus maupun bakteri Staphylococcus sp.
lainnya.

Hasil Pengamatan Bakteri Staphylococcus aureus

Kode Sampel Keterangan
Sampel Sputum - Interpretasi Hasil :

Negative ( - ) : tidak
ada pertumbuhan koloni
bakteri Staphylococcus
aureus maupun bakteri
Staphylococcus sp.
lainnya.

7. Pemeriksaan Angka Kuman (Total Plate Count (TPC)) Pada Makanan/Minuman

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan pada pemeriksaan angka kuman kue nagasari (kue
basah) dapat diamati bahwa banyaknya koloni yang tumbuh setelah diinkubasi pada media
Plate Count Agar/ Nutrient Agar (NA) dengan suhu 37℃ selama 1 × 24 jam. Ditemukan
koloni bkteri pada pengenceran 10−1, 10−2 , 10−3 .

Tabel 3. Data Hasl Jumlh Koloni Bakteri

No Sampel Jumlah Koloni
Kontrol Pengencerahan
(nk) 10−1 10 −2
10−3 10−4 10−5 10−6
n1 n2 n3 n4 n5 n6
1 Kue 1 200 105 115 8 5 1
Nagasari
(Kue
Basah)

Keterangan :
 nk = jumlah koloni pada media kontrol
 n1 = jumlah koloni pada media pengenceran I
  n2 = jumlah koloni pada media pengenceran II
 n3 = jumlah koloni pada media pengenceran III
 n4 = jumlah koloni pada media pengenceran IV
 n5 = jumlah koloni pada media pengenceran V
- n6 = jumlah koloni pada media pengenceran VI
Catatan : plate yang dihitung adalah plate yang koloninya antara 30 – 300

( 200−1 ) x 10+ ( 105−1 ) x 100+ ( 115−1 ) x 1000

Angka Kuman =
3
1990+10400+114000
=
3
126390
=
3
= 42130
= 4,213 x 104 ( < 105 = masih memenuhi)

8. Uji Kualitas Mikrobiologi Air Keran Berdasarkan Nilai Most Probable Number
(MPN) Coliform

Tabel 4. Hasil Percobaan Uji MPN Air Keran

No Gambar Keterangan

1 Penuangan sampel air keran pada tabung yang

sudah berisi media Lactose Broth (LB)

2 Pengenceran air keran 10-1 , 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,

10-6, 10-7
3 Hasil pengenceran air keran 10-1 , 10-2, 10-3, 10-
4
, 10-5 , 10-6, 10-7 setelah di inkubasi pada suhu
37C selama 2 x 24 jam
Tabel 5. Data Hasil Presumtive Test Pada Media LB Metode

Medium Double Strength Single Strength

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6 10−7

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 1 ml 0,1 ml

LB + + + - + - -
(Presuntiv
e Test/Tes
Perkiraan)

Keterangan :
( - ) Negatif = Tidak Terbentuknya gas/gelembung halus

( + ) Positif = Terbentuknya gas/gelembung halus

NB : Jika terbentuk gas dalam tabung maka presumptive positif (+), bila
coliform maka larutan dalam tabung akan berwarna keruh dan adanya
gas/gelembung halus pada tabung durham.

Analisis Data

Berdasarkan data yang di peroleh di dapatkan nilai MPN pada tiap – tiap uji
dengan media tertentu. Pada suhu 37°C di peroleh hasil positif gas dan berwarna
keruh menandakan positif coliform.

Dari penanaman dengan volume 10 ml di peroleh 4tabung positif gas

Dari penanaman dengan volume 1 ml di peroleh 0 tabung positif gas

Dari penanaman dengan volume 0,1 ml di peroleh 0 tabung positif gas

Maka nilai MPN/100 ml sampel untuk 4:0:0 adalah 15/100 ml

B. PEMBAHASAN
1. Pewarnaan Gram
Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan gram menggunakan biakan bakteri dengan
pengamatan menggunakan mikroskop pembesaran 10x untuk mencari lapang pandang
dan 40x sebagai pengamatan, dapat dilihat adanya bakteri yang berbentuk batang atau
diartikan sebagai bakteri basil, warna bakteri biru yaitu gram positif dengan susunan
satu satu atau mono. Maka, dapat dinyatakan bakteri yang dibiakkan tersebut adalah
bakteri monobasil gram positif.
2. Pewarnaan BTA
Berdasarkan praktikum pewarnaan BTA menggunakan Ziehl Nelson dengan sampel
Sputum ditemukan bakteri tidak tahan asam karena bakteri yang diamati pada
mikroskop pembesaran 10x untuk mencari lapang pandang dan 40x untuk pengamatan
dapat dilihat adanya bakteri berbentuk batang yang berarti bakteri basil, dengan warna
biru yang menandakan bakteri tersebut adalah bakteri gram positif. Maka, dapat
dinyatakan bakteri yang dibiakkan tersebut adalah bakteri basil tidak tahan asam.
3. Kultur bakteri
a) Kultur bakteri urine pada media BAP
Berdasarkan pemeriksaan kultur pada Media BAP dengan menggunakan sampel urine,
tidak didapatkan jumlah koloni dengan hasil perhitungan yang menandakan bahwa pasien
atau probandus negatif infeksi saluran kemih. Hasil tersebut didapatkan dikarenakan
sampel yang digunakan adalah sampel dari pasien yang negatif ISK.

b) Kultur bakteri pada media MCA

Berdasarkan pemeriksaan bakteri enterik media MCA dengan sampel urine. Pada
pengamatan secara langsung tidak dilihat Koloni yang tumbuh. Sesuai dengan media yang
digunakan Media Mac Conkey Agar yang merupakan media selektif dan media diferensial
yang digunakan untuk mengisolasi bakteri batang gram negatif berdasarkan kemampuan
bakteri memfermentasi laktosa atau tidak. Yang berarti dari hasil pengamatan menandakan
bakteri pada urine tersebut tidak memfermentasi laktosa (contoh : Salmonella sp., Shigella
sp.).
4. Identifikasi bakteri enterik
a. Kultur bakteri enteric pada media EMB
 Pada pemeriksaan bakteri enterik media EMB dengan sampel feses, koloni yang
tumbuh memiliki bentuk yang bulat dengan ukuran dari kecil sampai besar, warna pada
koloni merah, tidak bergerigi dan tekstur halus serta tidak terdapat lendir yang
menandakan bakteri pada feses tersebut memfermentasi laktosa (contoh : Escherichia
coli, Klebsiella sp.)
5. Identifikasi Bakteri Vibrio
Bakteri vibrio yang merupakan kelompok bakteri gram negative berbentuk batang
bengkok seperti koma (comma shaped) yaitu etiologi dari penyakit kolera. Vibrio memiliki
flagel monotrik yang dapat bergerak sangan aktif. Tidak membentuk spora, pada biakan
lama dapat berbentuk batang lurus. Vibrio tidak tahan terhadap suasana asam dan tumbuh
optimum pada pH 8.5 - 9.5. Untuk melakukan isolasi dan pemeliharaan vibrio, dapat
menggunakan media Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar (TCBS) yang merupakan media
selektif untuk isolasi dan pemurnian vibrio. Vibrio mampu menggunakan sukrosa sebagai
sumber karbon akan berwarna kuning, sedangkan yang lainnya berwarna hijau. Juga
bakteri lain seperti Pseudomonas, Plesiomonas, dan Aeromonas, dapat tumbuh pada media
TCBS dan biasanya menghasilkan koloni biru dan harus di bedakan dari vibrio. Sedangkan
untuk perbanyakan vibrio, dapat digunakan Alkaline Peptone Water (APW) yang memiliki
pH relatif tinggi, yaitu berkisar 8.4 dan mengandung NaCl sebesar 1-2%. Adapun
pertumbuhan optimum vibrio adalah pada suhu berkisar antara 20 - 35 C. Pemeriksaan
dinyatakan positif Vibrio cholerae apabila pada media Thiosulfate Citrate Bile Salts Agar
(TCBS) ditemukan koloni sedang sampai besar, berwarna kuning, jernih, smooth, keping,
tepinya tipis, dilingkari oleh zona yang berwarna kuning. Perubahan warna hijau menjadi
kuning terjadi karena pH media bersifat basa kuat. Vibrio cholera menghasilkan koloni
berwarna kuning pada media TCBS Agar disebabkan karena bakteri tersebut
memfermentasi sukrosa. Dalam praktikum ini, dari sampel feses yang telah diperiksa
menunjukkan hasil yang negative dimana pada media TCBS tidak terdapat koloni bakteri
Vibrio yang tumbuh satupun pada media TCBS setelah diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu
37C. Namun adanya pertumbuhan bakteri lain dengan ciri – ciri koloni yaitu warna
menyerupai warna media pada media TCBS. Koloni berbentuk bulat dengan tekstur
pinggiran smooth. Ukuran koloni kecil hingga sedang. Permukaan tidak berlendir.
Kemungkinan koloni yang tumbuh yaitu beberapa mikroba yang juga dapat tumbuh pada
media TCBS, seperti Staphylococcus, Flavobacterium, Pseudoalteromonas, Plesiomonas,
Aeromonas, Shewanella, E.coli, dll. Untuk mengetahui spesies dari koloni bakteri tersebut
harus dilakukan pemeriksaan lanjutan dengan pewarnaan gram kemudian dilakukan
pemeriksaan uji biokimia.
6. Identifikasi Bakteri Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter
0,7-1,2 µm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur,
fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh pada
suhu optimum 37 ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25 ºC).
Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning keemasan, berbentuk
bundar, halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S. aureus
yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperan dalam virulensi
bakteri. Sebagian bakteri Staphylococcus merupakan flora normal pada kulit, saluran
pernafasan, dan saluran pencernaan makanan pada manusia. Bakteri ini juga ditemukan di
udara dan lingkungan sekitar. S. aureus yang patogen bersifat invasif, menyebabkan
hemolisis, membentuk koagulase, dan mampu meragikan manitol. Hemolisin merupakan
toksin yang dapat membentuk suatu zona hemolisis di sekitar koloni bakteri. Hemolisin
pada S. aureus terdiri dari alfa hemolisin, beta hemolisin, dan delta hemolisin. Alfa
hemolisin adalah toksin yang bertanggung jawab terhadap pembentukan zona hemolisis di
sekitar koloni S. aureus pada medium agar darah. Dari data hasil pengamatan makroskopis
pada media Manitol Salt Agar (MSA) yang diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37 C
di dapatkan hasil yang negative yaitu tidak ada pertumbuhan bakteri Staphylococcus
aureus maupun bakteri Staphylococcus sp. lainnya. Tidak ada koloni bakteri yang
terbentuk pada media maupun zona hemolisin di sekitar koloni.
7. Pemeriksaan Angka Kuman (Total Plate Count (TPC)) Pada Makanan/Minuman
Dalam praktikum ini, untuk sampel kue nagasari dengan konsistensi padat, digerus
terlebih dahulu agar menjadi butiran-butiran sekecil mungkin (menjadi suspensi),
kemudian ditimbang sesuai ukuran yang telah ditentukan dan kemudian dimasukkan ke
dalam wadah (gelas beaker). Selanjutnya dihomogenisasi bertujuan untuk memperoleh
penyebaran bakteri yang sebaik mungkin dan merata. Sehingga meskipun bahan yang
diperiksa sedikit, hasil pemeriksaannya dapat mewakili keadaan sampel untuk keseluruhan.
Sebelum ditanam pada media pembenihan, dilakukan pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,
10−6 terhadap sampel kue nagasari tersebut. Dalam praktikum ini digunakan perbandingan
1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran
berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya. Pada
praktikum yang dilakukan menggunakan teknik Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan
kegiatan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Medium yang baru harus nutrisi yang berkembang
biak dengan baik. Pada praktikum ini, alat yang akan digunakan sebelumnya harus
disterilisasi terlebih dahulu agar semua alat dan bahan yang akan digunakan steril/tidak ada
mikroorganisme penganggu sehingga tidak akan mempengaruhi hasil pemeriksaan akhir.
Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau
di dalam suatu benda. Teknik inokulasi yang dilakukan dalam praktikum ini, yaitu dengan
metode Angka Lempeng Total secara pour plate (cawan tuang) adalah teknik penanaman
dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media
pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan
agar atau di dalam agar. Media yang digunakan adalah media Nutrient Agar. Media
Nutrient Agar merupakan media pertumbuhan umum, media pemerkaya dan termasuk
media non-selektif. Artinya pada media Nutrient Agar, kuman apa saja dapat tumbuh
dengan bebas. Pada praktikum ini, dihitung jumlah kuman secara umum, jadi kuman yang
ingin dihitung belum diidentifikasi. Lain halnya jika telah menentukan perhitungan angka
kuman bakteri tertentu, media yang digunakan juga harus media yang khusus untuk
menumbuhkan bakteri tersebut. Pada praktikum yang dilakukan menggunakan perhitungan
kuman yakni mengunakan alat coloni counter. Sebelum dihitung jumlah koloni pada media
yang telah ditanam bakteri, sebelumnya diperiksa jumlah koloni pada media kontrol. Jika
jumlah koloni pada media kontrol >10, maka semua media kultur dianggap gagal, sebab
telah terjadi kontaminasi. Berdasarkan data hasil pengamatan, dalam pemeriksaan angka
kuman pada kue nagasari (kue basah), terdapat 4 plate yang dapat dihitung kumannya
(jumlah koloni 30-300 dalam satu plate) yaitu plate pengenceran 10 -1 (200 koloni), plate
pengenceran 10-2 (105 koloni) dan , plate pengenceran 10-3 (115 koloni). Setelah dilakukan
perhitungan, maka jumlah angka kuman dalam sampel kue nagasari (kue basah) tersebut
sebesar 4,213 x104 .
8. Uji Kualitas Mikrobiologi Sari Susu Kedelai Berdasarkan Nilai Most Probable
Number (MPN) Coliform
 Metode MPN (Most Probable Number) merupakan uji yang bertujuan untuk
mengetahui kualitas mikrobiologi air keran yang menyuburkan pertumbuhan coliform
sehingga didapatkan nilai untuk mengira jumlah coliform yang terkandung dalam air keran
yang diuji. Pada praktikum ini menggunakan bakteri Coliform fecal/Colitinja sebagai
indikator dalam uji kualitas air keran. Kelompok Coliform fecal merupakan bakteri
Coliform yang hidup di sepanjang saluran pencernaan manusia dan hewan, sehingga sering
ditemukan di dalam feces, misalnya Escherichia coli. Jumlah Coliform tersebut bukan
perhitungan yang tepat melainkan angka yang mendekati jumlah sebenarnya. Coliform
dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk asam dan gas CO2 dalam waktu
inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37ºC. Menurut Pelczar bakteri Coliform adalah suatu
kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang gram negatif, tidak membentuk
spora, aerobik, dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktose dengan menghasilkan
asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35° C. . Pada uji penegasan dengan ragam
4:0:0 hasil nilai MPN yang diperoleh sebesar 15 / 100 ml.
 BAB V
PENUTUP

C. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang telah kami lakukan dapat disimpulkan
bahwa Pewarnaan BTA Berdasarkan praktikum pewarnaan BTA
menggunakan Ziehl Nelson dengan sampel Sputum ditemukan bakteri tidak
tahan asam karena bakteri yang diamati pada mikroskop pembesaran 10x
untuk mencari lapang pandang dan 40x untuk pengamatan dapat dilihat
adanya bakteri berbentuk batang yang berarti bakteri basil, dengan warna
biru yang menandakan bakteri tersebut adalah bakteri gram positif. Sesuai
dengan media yang digunakan Media Mac Conkey Agar yang merupakan
media selektif dan media diferensial yang digunakan untuk mengisolasi
bakteri batang gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri
memfermentasi laktosa atau tidak. Identifikasi bakteri enterik Kultur bakteri
enteric pada media EMB Pada pemeriksaan bakteri enterik media EMB
dengan sampel feses, koloni yang tumbuh memiliki bentuk yang bulat
dengan ukuran dari kecil sampai besar, warna pada koloni merah, tidak
bergerigi dan tekstur halus serta tidak terdapat lendir yang menandakan
bakteri pada feses tersebut memfermentasi laktosa (contoh : Escherichia
coli, Klebsiella sp.
 DAFTAR PUSTAKA

https://zdocs.tips/doc/laporan-praktikum-mikrobiologi-respirasi-
gpd5elm57e67

http://eprints.poltekkesjogja.ac.id/704/3/Chapter%201%20.pdf

https://id.scribd.com/doc/89413273/Laporan-Pemeriksaan-Mpn

https://123dok.com/document/yd9xwrjz-laporan-pemeriksaan-angka-kuman-
pada-mak.html