5117304KESEHATAN RAJAWALI

INSTITUT
PROGRAM
PenyusunSTUDI D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
Tim Dosen Bakteriologi Klinik I

Modul Praktikum
Bakteriologi Klinik I
 2

VISI MISI PROGRAM STUDI

DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM
MEDIK
VISI
Menjadi program studi teknologi laboratorium medik yang unggul dalam bidang manajemen mutu
laboratorium medik dan berwawasan global pada tahun 2045.

MISI
 Menyelenggarakan pendidikan teknologi laboratorium medik dengan keunggulan manajemen
mutu laboratorium medik yang sesuai dengan standar akademik.
 Menyelenggarakan penelitian yang sesuai dengan perkembangan ilmu keswaktunya ehatan
khususnya bidang manajemen mutu laboratorium medik.
 Menyelenggarakan pengabdian masyarakat yang relevan dengan kebutuhan masyarakat khususnya
dalam bidang manajemen mutu laboratorium medik.
 Mengembangkan kerjasama tingkat nasional dan internasional guna mendukung kompetensi dan
pemberdayaan lulusan.
 Melaksanakan manajemen dan tata kelola program studi yang efektif dan efisien.
 3

KATA PENGANTAR
Segala Puji bagi Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya, sehingga buku panduan
praktikum / modul praktikum mahasiswa untuk mata kuliah Bakteriologi Klinik I ini dapat
diselesaikan. Modul praktikum ini disusun untuk dapat digunakan sebagai acuan, petunjuk, dan
pedoman penyelenggaraan kegiatan praktikum mahasiswa mata kuliah Bakteriologi Klinik I.

Modul Praktikum ini ditujukan untuk memenuhi kebutuhan informasi dasar, petunjuk teknis
dan pedoman pelaksanaan yang diperlukan oleh para mahasiswa dan juga dosen yang akan terlibat
dalam proses kegiatan praktikum, tata tertib dan prosedur yang diperlukan agar pelaksanaan dan
penyelenggaraan praktikum dapat berjalan dengan lebih baik dan sesuai standar operasional prosedur
(SOP) yang berlaku pada program studi D-III dan D-IV Teknologi Laboratorium Medik Institut
Kesehatan Rajawali.

Selanjutnya penyusun modul praktikum menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada
semua pihak yang telah memberi dukungan serta bantuan shingga penulisan modul praktikum ini dapat
diselesaikan dengan baik, dengan harapan penyelenggaraan praktikum dapat lebih mudah, efisien, dan
sistematis.
Bandung,

Tim Penyusun
 4

DAFTAR ISI
Visi Misi Program Studi D-IV TLM ………………………………………………………… 2
Kata Pengantar ………………………………………………………………………………. 3
Daftar isi …………………………………………………………………………………….. 4
Tata tertib praktikum ………………………………………………………………………... 5
Pendahuluan …………………………………………………………………………………. 7
Praktikum
UJI KUALITAS AIR DENGAN MOST PRABABLE NUMBER (MPN) …………… 8
PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL BAHAN MAKANAN …………… 12
PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL ALAT MAKANAN ……………… 16
UJI BIOKIMIA ………………………………………………………………………. 20
Daftar Pustaka ………………………………………………………………………………… 29
 5

TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Praktikum diampu oleh Dosen pengampu mata kuliah Bakteriologi 2 dan dibantu oleh
asisten laboratorium dan asisten praktikum.
2. Praktikum dilaksanakan di laboratorium sesuai jadwal yang ditentukan.
3. Praktikan wajib membawa modul praktikum, kartu praktikum, dan alat tulis.
4. Praktikan wajib mengisi daftar hadir dan BAP praktikum.
5. Durasi kegiatan praktikum adalah 170 menit (untuk 1 SKS).
a. 5 menit untuk pengerjaan pre-test atau post-test
b. 15 menit untuk preparasi
c. 30 menit untuk penyampaian materi
d. 120 menit untuk pengerjaan praktikum dan jurnal/ laporan sementar
6. Jumlah pertemuan praktikum:
a. 14 kali di lab (praktikum rutin)
b. 1 kali untuk asistensi dan introduksi praktikum
c. 1 kali berupa presentasi/ responsi praktikum/ ujian praktikum
7. Praktikan wajib hadir minimal 100% dari seluruh pertemuan praktikum di lab. Jika total
kehadiran kurang dari 100% maka nilai praktikum = 0.
8. Praktikan yang datang terlambat:
a. <= 10 menit: diperbolehkan mengikuti praktikum tanpa tambahan waktu Tes Awal
b. > 10 menit: tidak diperbolehkan mengikuti praktikum
9. Saat praktikum berlangsung, asisten praktikum/ laboran dan praktikan:
a. Wajib menggunakan jas laboratorium.
b. Wajib mematikan/ men-silent semua alat komunikasi (smartphone, tab, iPad, dsb).
c. Dilarang membuka aplikasi yang tidak berhubungan dengan praktikum yang
berlangsung.
d. Dilarang menggunakan alat laboratorium tanpa seizin asisten/ dosen/ laboran
e. Dilarang makan dan minum di laboratorium.
f. Saat pre-test atau post-test dilarang memberikan jawaban ke praktikan lain
g. Dilarang membuang sampah di laboratorium.
h. Wajib meletakkan tas dengan rapi pada loker yang telah disediakan.
10. Setiap praktikan dapat mengikuti praktikum susulan maksimal 3 acara.
 6

a. Praktikan yang dapat mengikuti praktikum susulan hanyalah praktikan yang memenuhi
syarat sesuai ketentuan Institusi, yaitu rawat inap di Rumah Sakit (menunjukkan bukti
rawat inap dan resep obat dari RS), tugas dari Institusi (menunjukkan surat dinas dari
Institusi), atau mendapat musibah (menunjukkan surat keterangan dari orangtua/ wali
mahasiswa).
b. Persyaratan untuk praktikum susulan diserahkan sesegera mungkin ke Asisten
Laboratorium/ Laboran/ Dosen Pengampu untuk keperluan administrasi.
11. Praktikan yang diijinkan menjadi peserta praktikum susulan ditetapkan oleh Dosen
Pengampu Praktikum.
12. Pelanggaran terhadap peraturan praktikum ini akan ditindak secara tegas secara berjenjang
di lingkup Kelas, Laboratorium, Program Studi/ Institusi.
 7

PENDAHULUAN
Bakteriologi diberikan sebagai mata kuliah keilmuan dan keterampilan bagi mahasiswa
sebagai calon pelaksana uji diagnostik laboratorium. Pemeriksaan bakteriologi dilakukan untuk
membantu menentukan diagnosis pada seseorang yang diduga terinfeksi bakteri. Selain itu,
pemeriksaan bakteriologi juga banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi adanya bakteri cemaran
dalam air dan makanan.
Praktikum Bakteriologi 2 dilaksanakan dengan tujuan untuk memberikan pemahaman dan
skill laboratorium bagi mahasiswa sebagai bagian dari perkuliahan Bakteriologi 2. Materi
praktikum meliputi uji kualitas air dengan Most Probable Number (MPN), pemeriksaan angka
lempeng total bahan makanan, angka lempeng total alat makan, pemeriksaan angka kuman udara,
dan uji biokimia untuk bakteri.
 8

UJI KUALITAS AIR DENGAN MOST

PROBABLE NUMBER (MPN)
A. Materi

Bakteri coliform merupakan suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya
pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu, dan produk-
produk susu. Adanya bakteri coliform di dalam makanan atau minuman menunjukkan
kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik dan/atau toksigenik yang
berbahaya bagi kesehatan. Bakteri coliform dapat dibedakan atas dua kelompok, yaitu
coliform fekal, seperti Escherichia coli, dan coliform non-fekal, seperti Enterobacter
aerogenes.

Kualitas air salah satunya ditentukan oleh keberadaan bakteri coliform. Most Probable
Number (MPN) umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri khususnya, coliform dan
colitinja. Pemeriksaan air dengan MPN dilakukan dalam 3 tahap pengujian, yaitu pendugaan
(presumptive), uji penegasan (confirmative test) dan uji penguat (completed test).

Adanya bakteri coliform, menentukan kualitas air, umumnya dinyatakan dengan nilai MPN
coliform. Makin besar nilai MPN yang melampaui nilai standar, maka kualitas air sangat
rendah. Sebaliknya makin kecil nilai MPN dari standar minimal, maka kualitas air semakin
baik. Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor:
492/MENKES/PER/IV/2010, tentang Persyaratan Kualitas Air Minum, yang dimaksud air
minum adalah air yang melalui proses pengolahan atau tanpa proses pengolahan yang
memenuhi syarat kesehatan dan dapat langsung diminum. Air minum aman bagi kesehatan
apabila memenuhi persyaratan fisika, mikrobiologis, kimiawi, dan radioaktif, dengan jumlah
bakteri Coliform adalah 0 MPN/100 ml.
B. Alat Dan Bahan

Alat Bahan

1. Tabung reaksi 1. Media Lactosa Broth (LB)

2. Rak tabung reaksi 2. Media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB)

3. Pembakar spiritus 3. Media Eosin Metylene Blue Agar (EMBA)

 9

4. Pipet ukur 10 mL 4. Sampel air yang diuji

5. Pipet ukur 1 mL 5. Alkohol 70%

6. Pipet ukur 0,1 mL 6. Tissue

7. Cawan petri 8. Kertas Label

8. Alat Tulis

9. Kapas

C. Tujuan Praktikum

1. Mampu menentukan adanya bakteri coliform dalam sampel air

2. Mampu menentukan suatu angka indeks yang menunjukkan jumlah paling mungkin dari
mikroorganisme yang ada dalam sampel yang diuji.
D. Cara Kerja/ Prosedur Kerja Presumptive Test
1. Siapkan 9 tabung reaksi berisi masing-masing 10 mL media lactose broth steril yang
sudah dilengkapi dengan tabung durham. Masing-masing beri kode (A1, A2, A3, B1, B2,
B3, C1, C2, C3)
2. Tuangkan air sampel menggunakan pipet steril masing-masing sebanyak 10 mL ke
dalam tabung dengan kode A1, A2, A3.
3. Tuangkan air sampel menggunakan pipet steril masing-masing sebanyak 1 mL ke
dalam tabung dengan kode B1, B2, B3.
4. Tuangkan air sampel menggunakan pipet steril masing-masing sebanyak 0,1 mL ke
dalam tabung dengan kode C1, C2, C3.
5. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1 x 24 jam.

6. Amati adanya gelembung udara di dalam tabung durham. Catatlah kode tabung yang
positif menghasilkan gas. Mikroba penghasil gas yang tumbuh pada tabung adalah
kelompok mikroba yang mampu memfermentasikan laktosa.
7. Hitung jumlah coliform dari tabung positif menggunakan tabel MPN seri 3.
Confirmative Test

1. Siapkan tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 mL media BGLB steril yang sudah
dilengkapi tabung durham. Atur letak pada rak tabung reaksi dan masing- masing diberi
kode: misal A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3, sehingga jumlahnya sama dengan
jumlah tabung yang positif saja.
 10

2. Ambil sebanyak 1 ml sampel pada tabung positif, inokulasikan pada tabung berisi BGLB
steril.
3. Inkubasi pada suhu 45°C selama 1 x 24 jam.

4. Amati adanya gelembung udara di dalam tabung durham. Catatlah kode tabung yang
positif menghasilkan gas. Mikroba penghasil gas yang tumbuh pada tabung adalah
kelompok mikroba yang mampu memfermentasikan laktosa dan tahan terhadap suhu
tinggi, yaitu 45°C. Mikroba ini termasuk dalam kelompok bakteri coliform fekal.

Completed Test

1. Inokulasikan sampel dari tabung positif pada completed test sebanyak 1 ose ke permukaan
media EMBA dengan cara zig-zag.
2. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1 x 24 jam.

3. Amati pertumbuhan koloni pada media EMBA. Koloni yang menampakkan adanya kilau
metalik adalah koloni E. coli.
4. Uji konfirmasi dapat dilakukan dengan pewarnaan Gram terhadap isolat yang diduga
sebagai bakteri E. coli.

E. Evaluasi Hasil
Hasil Presumptive Test Setelah Inkubasi 1 x 24 jam
No Nama Sampel Tabung Seri Ke-
1 2 3

Hitung jumlah coliform dari tabung positif dengan cara mencocokkan hasil tabung positif
pada ketiga seri pengenceran dengan tabel MPN pengenceran seri 3.

Hasil Comfirmative Test Setelah Inkubasi 1 x 24 jam

No Tabung positif ke- Hasil
Positif Negatif
 11

Hasil Pengamatan Koloni pada Media EMBA/MCA

Gambar kultur:

Morfologi koloni:
Warna koloni:
Ukuran koloni:
Permukaan koloni:
Kesimpulan:
 12

PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL

BAHAN MAKANAN
A. Materi

Perhitungan jumlah sel mikroba dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, antara lain
secara langsung dengan hitung mikroskopik (direct microscopic count) menggunakan
hemasitometer, dan secara tidak langsung dengan hitung cawan (plate count).

Hitung mikroskopik merupakan metode yang cepat dan murah, tetapi mempunyai beberapa
kelemahan, antara lain: sel-sel yang mati tidak dapat dibedakan dari sel hidup, sel-sel yang
berukuran sangat kecil sulit dilihat sehingga kadang-kadang tidak terhitung.

Hitung cawan merupakan metode yang sensitif untuk menentukan jumlah sel mikroba.
Prinsip metode hitung adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media
agar, maka sel mikroba itu akan berbiak membentuk koloni yang dapat dilihat dan dihitung
dengan mata telanjang, dan disebut dengan “colony forming unit/cfu”.

Metode hitungan cawan ada dua, yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan
(surface/spread plate). Perhitungan jumlah mikroba dianggap valid jika dalam satu cawan
tumbuh koloni sebanyak 30-300 cfu. Jika pertumbuhan mikroba terlalu padat, maka harus
dilakukan pengenceran terlebih dahulu.

Angka Lempeng Total (ALT) adalah pertumbuhan bakteri mesofil aerob setelah sampel
diinkubasi dalam perbenihan yang cocok selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Uji ALT
mengandung prinsip bahwa pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah diisolasi,
diinokulasikan pada lempeng agar dengan cara tuang atau sebar dan diinkubasi pada suhu
yang sesuai. Pengujian dilakukan secara duplo. Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari satu
pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-300 koloni. Jumlah koloni rata-rata
dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan
sebagai Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram sampel bahan makanan.
 13

B. Alat dan Bahan

Alat Bahan

1. Tip mikropipet 1. Bahan makanan siap konsumsi

2. Mikropipet 2. Media Plate Count Agar (PCA)

3. Pembakar spirtus (Bunsen) 3. Media Manitol Salt Agar (MSA)

4. Mortar dan pestle 4. Media Eosin Metilen Blue Agar (EMBA)

5. Spatula 5. Alkohol 70%

6. Vortex 6. Akuades Steril

7. Cawan petri

8. Tabung reaksi

9. Rak tabung reaksi

10. Inkobator

11. Colony counter

C. Tujuan Praktikum
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu:
1. Mengetahui angka lempeng total pada bahan makanan
2. Mengetahui potensi bahan makanan sebagai sumber pencemar mikroba patogen.

D. Cara Kerja/ Prosedur Kerja

1. Preparasi sampel dilakukan dengan menimbang sebanyak 1gram bahan makanan,
kemudian dimaserasi dan dimasukkan ke dalam 9 mL akuades steril, lalu dihomogenkan.
2. Selanjutnya dilakukan serangkaian pengenceran hingga 10-4 dengan cara mengambil
suspensi dari pengenceran sebelumnya sebanyak 1 mL.
3. Sebanyak 1 mL dari pengenceran 10-1 dan 10-2 dipipet ke dalam cawan petri steril secara
duplo. Kemudian dituang sebanyak 15 mL media MSA dan EMBA ke dalam masing-
masing cawan untuk mengetahui kehadiran S. aureus dan E. coli pada sampel. Cawan
petri kemudian digoyang dengan hati-hati agar sampel tersebar merata.
4. Sebanyak 1 mL dari pengenceran 10-3 dan 10-4 dipipet ke dalam cawan petri steril secara
 14

duplo. Kemudian dituang sebanyak 15 mL media PCA ke dalam masing- masing cawan
untuk mengetahui angka lempeng total pada sampel bahan makanan. Cawan petri
kemudian digoyang dengan hati-hati agar sampel tersebar merata.
5. Uji sterilitas media dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dalam cawan petri
dan dibiarkan memadat.
6. Uji sterilitas pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dan 1 mL
pengencer BPW lalu dibiarkan memadat.
7. Seluruh cawan petri diinkubasi terbalik pada suhu 37°C selama 24 - 48 jam.
8. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

Perhitungan koloni:
1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-
300 koloni.
2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni ≤30 atau ≥300 maka
dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan satu per faktor
pengencerannya.
3. Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah
koloni antara 30-300 maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat
pengenceran, dikalikan dengan satu per faktor pengencerannya.
4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi diperoleh jumlah
koloni rata-rata ≥2 kali jumlah koloni rata-rata pengenceran di bawahnya, maka dipilih
tingkat pengenceran yang lebih rendah.
5. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni
rata-rata ≤2 kali jumlah rata-rata pada pengenceran di bawahnya, maka dihitung dari rata-
rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut.
6. Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Angka Lempeng Total dinyatakan
sebagai <1 dikalikan satu per faktor pengenceran terendah.
7. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni ≥250, dipilih cawan dari tingkat
pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa sektor (2, 4, atau 8) dan
dihitung jumlah koloni dari satu sektor.
8. Jika jumlah koloni rata-rata dari 1/8 bagian cawan ≥200, maka Angka Lempeng Total
dinyatakan ≥ 200 x 8 dikalikan satu per faktor pengenceran.
9. Koloni spreader 1/4 - 1/2 bagian cawan: dihitung koloni yang tumbuh di luar daerah
spreader.
 15

10. Koloni spreader 75% dari seluruh cawan dicatat sebagai ’spr’. Untuk keadaan ini
harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya (pengujian diulang).
11. Koloni spreader tipe rantai: Tiap 1 deret koloni yang terpisah dihitung sebagai 1
koloni.
12. Spreader terdiri dari beberapa rantai: Tiap rantai dihitung sebagai 1 koloni.

Catatan:
- Perhitungan dan pencatatan hasil ditulis dalam dua angka, sebagai contoh: 523 x 103
dibulatkan menjadi 52 x 104
83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103, angka berikutnya dibulatkan ke bawah jika
<5 dan dibulatkan ke atas apabila >5. Hasil dinyatakan dalam cfu per tiap gram atau tiap
mL sampel.
- Jika menggunakan metode spread plate, maka pada perhitungan jumlah kuman dikalikan
lagi dengan satu per 0,1.
E. Evaluasi Hasil
Deteksi E. coli dan S. aureus pada plate
Plate nomor Pengenceran ke- Jumlah koloni Angka kuman
E. coli S. aureus (cfu/gram)

Perhitungan koloni pada plate

Plate nomor Pengenceran ke- Jumlah koloni Angka kuman
(cfu/gram)
16
 17

PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL

ALAT MAKANAN

A. Materi

Sanitasi makanan adalah upaya-upaya yang ditujukan untuk kebersihan dan keamanan
makanan agar tidak menimbulkan bahaya keracunan dan penyakit pada manusia. Dengan
demikian, tujuan sebenarnya dari upaya sanitasi makanan, antara lain menjamin keamanan
dan kebersihan makanan, mencegah penularan wabah penyakit, mencegah beredarnya produk
makanan yang merugikan masyarakat, dan mengurangi tingkat kerusakan atau pembususkan
pada makanan.

Upaya pengamanan makanan dan minuman pada dasarnya meliputi orang yang menangani
makanan, tempat penyelenggaraan makanan, peralatan pengolahan pangan dan proses
pengolahannya. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi terjadinya keracunan makanan,
antara lain adalah hygiene perorangan yang buruk, cara penanganan makanan yang tidak
sehat dan perlengkapan pengolahan makanan yang tidak bersih.

Dalam mendapatkan makanan dan minuman yang memenuhi syarat kesehatan, maka perlu
diadakan pengawasan terhadap hygiene dan sanitasi makanan dan minuman, utamanya adalah
usaha diperuntukkan untuk umum seperti restoran, rumah makan, ataupun pedagang kaki
lima mengingat bahwa makanan dan minuman merupakan media yang potensial dalam
penyebaran penyakit.

Kontaminasi makanan dapat terjadi setiap saat, salah satunya dari peralatan makanan yang
digunakan tidak memenuhi syarat kesehatan. Di Indonesia peraturan telah dibuat dalam
bentuk Permenkes RI No. 1096/Menkes/Per/VI/2011, bahwa untuk persyaratan peralatan
makanan tidak boleh bakteri lebih dari 0 koloni/cm2.

Peranan peralatan makanan dalam pedagang makanan merupakan bagian yang tak
terpisahkan dari prinsip-prinsip penyehatan makanan (food hygiene). Setiap peralatan makan
(piring, gelas, sendok) harus selalu dijaga kebersihannya setiap saat digunakan. Alat makan
(piring, gelas, sendok) yang kelihatan bersih belum merupakan jaminan telah memenuhi
persyaratan kesehatan, karena di dalam alat makan (piring, gelas, sendok) tersebut tercemar
 18

bakteri E. coli yang menyebabkan alat makan (piring, gelas, sendok) tersebut tidak memenuhi
kesehatan. Untuk itu pencucian peralatan sangat penting diketahui secara mendasar, dengan
pencucian secara baik akan menghasilkan peralatan yang bersih dan sehat pula. Dengan
menjaga kebersihan peralatan makan (piring, gelas, sendok), berarti telah membantu
mencegah pencemaran atau kontaminasi makanan yang dikonsumsi.

B. Alat dan Bahan

Alat Bahan

1. Alat makan siap pakai 1. Akuades steril

2. Cotton bud steril 2. Media Plate Count Agar (PCA)

3. Pembakar spirtus (Bunsen) 3. Media Manitol Salt Agar (MSA)

4. Tip mikropipet 4. Media Eosin Metilen Blue Agar (EMBA)

5. Mikropipet 5. Alkohol 70%

6. Vortex 6. Pepton water steril

7. Cawan petri

8. Tabung reaksi

9. Rak tabung reaksi

10. Inkobator

11. Colony counter

C. Tujuan Praktikum
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu:
1. Mengetahui angka lempeng total pada alat makan
2. Mengetahui potensi alat makan sebagai sumber pencemar mikroba patogen.
D. Cara Kerja/ Prosedur Kerja
1. Cutton bud steril yang telah dilembabkan dengan pepton water disiapkan, diusapkan pada
permukaan alat makan seluas 10 cm2, selanjutnya bagian ujung cutton bud dimasukkan
ke dalam 9 mL akuades steril, dihomogenkan.
2. Selanjutnya dilakukan serangkaian pengenceran hingga 10-4 dengan cara mengambil
suspensi dari pengenceran sebelumnya sebanyak 1 mL.
3. Sebanyak 1 mL dari pengenceran 10-1 dan 10-2 dipipet ke dalam cawan petri steril
 19

secara duplo. Kemudian dituang sebanyak 15 mL media MSA dan EMBA ke dalam
masing-masing cawan untuk mengetahui kehadiran S. aureus dan E. coli pada sampel.
Cawan petri kemudian digoyang dengan hati-hati agar sampel tersebar merata.
4. Sebanyak 1 mL dari pengenceran 10-3 dan 10-4 dipipet ke dalam cawan petri steril
secara duplo. Kemudian dituang sebanyak 15 mL media PCA ke dalam masing- masing
cawan untuk mengetahui angka lempeng total pada sampel bahan makanan. Cawan petri
kemudian digoyang dengan hati-hati agar sampel tersebar merata.
5. Uji sterilitas media dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dalam cawan petri
dan dibiarkan memadat.
6. Uji sterilitas pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dan 1 mL
pengencer BPW lalu dibiarkan memadat.
7. Seluruh cawan petri diinkubasi terbalik pada suhu 37°C selama 24 - 48 jam.
8. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
Perhitungan koloni:
1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-
300 koloni.
2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni ≤30 atau ≥300 maka
dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan satu per faktor
pengencerannya.
3. Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah
koloni antara 30-300 maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat
pengenceran, dikalikan dengan satu per faktor pengencerannya.
4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi diperoleh jumlah
koloni rata-rata ≥2 kali jumlah koloni rata-rata pengenceran di bawahnya, maka dipilih
tingkat pengenceran yang lebih rendah.
5. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni
rata-rata ≤2 kali jumlah rata-rata pada pengenceran di bawahnya, maka dihitung dari rata-
rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut.
6. Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Angka Lempeng Total dinyatakan
sebagai <1 dikalikan satu per faktor pengenceran terendah.
7. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni ≥250, dipilih cawan dari tingkat
pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa sektor (2, 4, atau 8) dan
dihitung jumlah koloni dari satu sektor.
8. Jika jumlah koloni rata-rata dari 1/8 bagian cawan ≥200, maka Angka Lempeng Total
 20

dinyatakan ≥ 200 x 8 dikalikan satu per faktor pengenceran.

9. Koloni spreader 1/4 - 1/2 bagian cawan: dihitung koloni yang tumbuh di luar daerah
spreader
10. Koloni spreader 75% dari seluruh cawan dicatat sebagai ’spr’. Untuk keadaan ini
harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya (pengujian diulang).
11. Koloni spreader tipe rantai: Tiap 1 deret koloni yang terpisah dihitung sebagai 1
koloni.
12. Spreader terdiri dari beberapa rantai: Tiap rantai dihitung sebagai 1 koloni.
Catatan:
- Perhitungan dan pencatatan hasil ditulis dalam dua angka, sebagai contoh: 523 x 103
dibulatkan menjadi 52 x 104
83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103, angka berikutnya dibulatkan ke bawah jika
<5 dan dibulatkan ke atas apabila >5. Hasil dinyatakan dalam cfu per tiap gram atau tiap
mL sampel.
- Jika menggunakan metode spread plate, maka pada perhitungan jumlah kuman dikalikan
lagi dengan satu per 0,1.

E. Evaluasi Hasil
Deteksi E. coli dan S. aureus pada plate
Plate nomor Pengenceran ke- Jumlah koloni Angka kuman
E. coli S. aureus (cfu/gram)

Perhitungan koloni pada plate

Plate nomor Pengenceran ke- Jumlah koloni Angka kuman
(cfu/gram)
21
 22

UJI BIOKIMIA
A. Materi
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan pengujian sifat fisiologisnya berdasarkan
reaksi biokimia yang terjadi pada media uji selain dengan pengamatan morfologi
bakteri tersebut. Uji biokimia merupakan tahapan lanjutan yang diperlukan untuk
mengidentifikasi suatu bakteri.

Uji biokimia bakteri adalah suatu kegiatan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan
mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melewati sifat-sifat
fisiologisnya. Bagian biokimia erat kaitannya dengan metabolisme sel, yakni selama
reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang
memakai energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan seluler,
seperti pergerakan.

Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia dengan menggunakan nutrisi yang

diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul didalam
dan diluar dari bakteri yang diatur oleh enzim. Setiap bakteri memiliki kemampuan
dengan menggunakan enzim yang dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak,
protein dan asam amino. Metabolisme ini biasanya menghasilkan produk yang dapat
digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri. Pada prinsipnya pengamatan
aktivitas biokimia mikroorganisme diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk
menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks dan molekul yang
sederhana. Selain itu, metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang
dapat digunakan untuk identifikasi.

B. Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Ose bulat 1. Isolat bakteri
2. Ose jarum 2. Media TSIA
3. Pipet 3. Media IMVIC
4. Pembakar spiritus 4. Media gula-gula
5. Tabung reaksi 5. Indikator phenol red
6. Rak tabung reaksi 6. Reagen Kovac
 23

7. Object glass 7. Alpha naphtol 5%

8. Jembatan pewarnaan 8. KOH 40%
9. Mikroskop 9. Methyl red
10. Inkubator 10. Kristal Violet
11. Lugol
12. Safranin
13. Hidrogen peroksida 3%
14. Alkohol

C. Tujuan praktikum

1. Mahasiswa mampu melakukan uji biokimia untuk identifikasi bakteri

2. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi E. coli, S. aureus, dan S. typhi dari
sampel makanan.

D. Cara Kerja/Prosedur Praktikum Pewarnaan Gram

1. Siapkan alat dan bahan yang telah disteril dan bersih di atas meja praktikum.

2. Lakukan pembuatan preparat dari isolat bakteri.

3. Warnai dengan kristal violet, diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan
akuades.
4. Tetesi dengan lugol, diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan akuades.

5. Dekolorisasi dengan alkohol 96% selama 30 detik atau sampai tetesan tidak berwarna,
bilas dengan akuades.
6. Warnai dengan safranin, diamkan selama 1-2 menit, lalu bilas dengan akuades,
keringkan.
7. Lakukan pengamatan dengan perbesaran lensa obyektif 100x.
 24

Gambar 1. Pengamatan mikroskopis hasi pewarnaan gram

Uji Fermentasi Karbohidrat

1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, inokulasikan pada media cair
glukosa, laktosa, sukrosa, maltose yang telah diberi indikator phenol red.
4. Inkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C.
5. Amati perubahan warna yang terjadi pada media gula-gula.

Gambar 2. Uji fermentasi harbohidrat, (a) Tidak diinokulasi, (b) positif, asam dan gas, (c) positif asam,
(d) negatif
 25

Uji TSIA
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, goreskan dan tusukkan pada
media TSIA.
4. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C.
5. Catat reaksi perubahan warna pada bagian slant dan butt media.

Gambar 3. Reaksi pada Triple Sugar Iron Agar (TSIA). (a) Tidak diinokulasi; (b) slant
basa/butt asam, H2S; (c) slant basa/butt asam; (d) slant asam/butt basa, gas; (e) slant
asam/butt asam

Uji Indol
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, inokulasikan pada media
indol.
4. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37°C.
5. Tambahkan 0,5 ml reagen Kovac pada kultur, kocok tabung, catat perubahan warna.
 26

Gambar 4. Hasil Uji Indole. (a) Tidak diinokulasi; (b) negatif; (c) positif

Uji Methyl Red

1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, inokulasikan pada media
methyl red.
4. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37°C.
5. Teteskan 5-6 tetes methyl red per 5 ml media.
6. Catat perubahan warna yang terjadi.

Uji Voges-Proskauer
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, inokulasikan pada media VP.
4. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37°C.
5. Tambahkan 0,6 ml α-naphtol dan 0,2 ml KOH 40%, kocok tabung.
6. Amati perubahan warna selama 5 menit.
 27

Gambar 5. Uji Methyl Red. (a) Tidak diinokulasi; (b) positif; (c) negatif

Gambar 6. Uji Voges Proskauer. (a) Tidak diinokulasi; (b) negatif; (c) positif
 28

Uji Sitrat
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, inokulasikan pada media
simon sitrat
4. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35°C.
5. Amati perubahan warna media.

Gambar 8. Uji Sitrat. (a) Negatif, terjadi pertumbuhan pada permukaan agar miring, media
berwarna biru kehijauan; (b) positif, terjadi pertumbuhan pada permukaan agar miring,
warna media biru keunguan
Uji Katalase
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Panaskan jarum ose sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin.
3. Ambil satu koloni bakteri dari media EMBA atau MSA, kemudian letakkan pada
object glass
4. Tetesi object glass berisi isolate bakteri dengan 3-4 tetes hidrogen peroksida 3%
5. Amati terbentuk atau tidaknya gelembung/busa pada object glass. Hasil uji
menunjukkan bakteri positif katalase jika terbentuk gelembung atau busa.

Gambar 9. Uji Katalase. Hasil negatif ditunjukkan pada slide atas, sedangkan slide bawah
menunjukkan hasil positif
 29

E. Hasil Evaluasi

Hasil Pengamatan Uji Fermentasi Karbohidrat

Spesies Bakteri Glukosa Laktosa Sukrosa
Asam Gas Asam Gas Asam (+) Gas
(+) / (-) (+) / (-) (+) / (-) (+) / (-) / (-) (+) / (-)

Hasil Pengamatan Uji TSIA

Spesies Bakteri Fermentasi Karbohidrat Produksi H2S (+) / (-)
Warna Slant Warna Butt

Hasil Pengamatan Uji Indol

Spesies Bakteri Warna Permukaan Media Hidrolisis Tryptophan (+)
atau (-)

Hasil Pengamatan Uji Methyl Red dan Voges Proskauer

Spesies Bakteri Uji Methyl Red Uji Voges Proskauer

Warna Media (+) atau (-) Warna Media (+) atau (-)
 30

Hasil Pengamatan Uji Sitrat

Spesies Bakteri Terjadi Warna Kemampuan bakteri
pertumbuhan media menggunakan sitrat
bakteri (+) atau (+) atau (-)
tidak (-)

Hasil Pengamatan Uji Katalase

Spesies Bakteri Ada/Tidak Gelembung Katalase (+) atau (-)
 31

DAFTAR PUSTAKA
1. Cappuccino, Welsh. Microbiology A Laboratory Manual. Eleventh Edition. Pearson.
2. Kuswiyanto. 2015. Bakteriologi 1 Buku Ajar Analis Kesehatan. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
3. Murray, Patrick R. 2018. Basic Medical Microbiology. Philadelphia: Elsevier.
 32

GLOSARIUM