UNIVERSITAS SEBELAS MARET

FAKULTAS KEDOKTERAN
LABORATORIUM BIOMEDIK
Kampus kentingan Jl. Ir.Sutami No.36 A Surakarta

BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL DAN HEMATOLOGI

Nama :
NIM :
Kelompok :
Tahun :
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
FAKULTAS KEDOKTERAN
LABORATORIUM BIOMEDIK
2021
 BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

PENYUSUN:
Dono Indarto, dr., M. Biotech.St., Ph.D.
Betty Suryawati, dr., M. Biomed Sci., Ph.D.
Dr. Yulia Sari, S.Si., M.Si.
Yuliana Heri Suselo, dr., M.Sc.
Alfin Titian Permata, S.Si., M.Si.
Evi Irina Sadyastuti, S.Si.

Laboratorium Biomedik
Program Studi Pendidikan Dokter
Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret Surakarta
2021

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 1

 DAFTAR ISI

Halaman Judul ........................................................................... 1

Daftar Isi .................................................................................... 2

Peraturan Dan Tata Tertib................................................................ 3

Jadwal Praktikum ............................................................................. 5

Praktikum I Isolasi Deoxyribonucleic Acid (DNA) Dari Sampel

Darah ............................................................................................... 6

Praktikum II POLYMERASE CHAIN REACTION ......................... 16

Praktikum III Elektroforesis ......................................................... 23

Praktikum IV Bioenergitika .............................................................. 29

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 2

 PERATURAN DAN TATA TERTIB

KEGIATAN PRAKTIKUM BIOMEDIK

BLOK BIOLOGI SEL DAN HEMATOLOGI

1. Setiap praktikan wajib memiliki buku petunjuk praktikum.

2. Setiap praktikan diwajibkan hadir tepat pada waktunya. Praktikan

yang terlambat lebih dari 15 menit, tidak diperkenankan mengikuti
praktikum, kecuali seizin kordinator topik praktikum yang sedang
dilaksanakan.

3. Praktikan harus hadir pada setiap kegiatan praktikum dan responsi,

tanpa ada alasan yang jelas dan dapat diterima, tidak
diperkenankan untuk mengikuti responsi maupun remidi.

4. Alasan yang dapat diterima adalah:

a. Praktikan dalam kondisi sakit dengan Surat Keterangan Dokter.

b. Orang tua kandung meninggal dunia.

c. Praktikan bersangkutan menikah (bukan kakak/saudara).

d. Praktikan merupakan perwakilan delegasi dengan Surat Tugas

dari Dekan, Wakil Dekan III atau Ka.Prodi Kedokteran.

5. Sebelum memasuki laboratorium, praktikan wajib memakai jas lab.

Praktikan harus menggunakan sarung tangan dan masker selama
praktikum dilaksanakan.

6. Praktikan wajib menyerahkan kartu praktikum kepada dosen atau

asisten pembimbing praktikum pada masing-masing kelompok.

7. Selama praktikum, praktikan tidak diperkenankan makan, minum

dan melakukan kegiatan di luar kegiatan praktikum.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 3

 8. Setelah melakukan praktikum, praktikan diwajibkan membersihkan
alat-alat yang dipakai dan disimpan kembali pada tempat semula
dalam keadaan bersih. Sampah harus dibuang ditempat sampah
dan praktikan wajib menjaga kebersihan laboratorium.

9. Selama kegiatan praktikum, praktikan diwajibkan membuat laporan

sementara per individu dan mendapat persetujuan (acc) dari asisten
yang bertugas.

10. Laporan praktikum dikumpulkan pada praktikum selanjutnya atau

dapat dikumpulkan 1 minggu setelah laporan sementara dibagikan
oleh asisten. Keterlambatan pengumpulan laporan dikenankan
pengurangan nilai (per jam minus 10).

11. Praktikan yang diperbolehkan mengikuti responsi adalah:

a. Hadir pada setiap kegiatan praktikum.

b. Telah mengumpulkan laporan praktikum.

c. Surat ijin yang dapat dipertanggungjawabkan (poin 4).

d. Selama diadakan responsi, praktikan tidak diperkenankan

meminta/memberikan jawaban kepada praktikan lain. Jika hal
tersebut terjadi, maka nilai responsi 0 (nol).

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 4

 JADWAL PRAKTIKUM

NO HARI, TANGGAL TOPIK KET.

1 Senin, Praktikum I Isolasi Tim Dosen,

DNA Genom Darah Laboran, Asisten
30 Agustus 2021
dan Pelaksana.

2 Rabu, Praktikum II: Polymerase Tim Dosen,

Chain Reactions (PCR) Laboran, Asisten
1 September 2021
Praktikum III: dan Pelaksana
Elektroforesis

3 Selasa, Praktikum IV: Tim Dosen,

Bioenergetika Laboran, Asisten
7 September 2021
dan Pelaksana

*Jadwal detail mengenai responsi tiap kelompok akan

diumumkan kemudian

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 5

 PRAKTIKUM I

ISOLASI Deoxyribonucleic Acid (DNA) DARI SAMPEL DARAH

A. PRINSIP KERJA
Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah molekul yang membawa
intruksi atau kode genetik yang digunakan untuk pertumbuhan,
perkembangan, fungsi, dan reproduksi seluruh organisme hidup dan
virus. Isolasi DNA merupakan teknik untuk mendapatkan DNA dari
makluk hidup dan bertujuan untuk memisahkan DNA dalam suatu sel
dari senyawa-senyawa selain DNA, seperti protein, lemak dan
karbohidrat. Prinsip isolasi DNA adalah lisis, ekstraksi, presipitasi dan
pemurnian. Isolasi DNA dari berbagai macam jenis sel ataupun
jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya mempunyai prinsip
yang sama hanya diperlukan modifikasi dalam teknik dan bahan yang
digunakan.

Prokariot merupakan organisme bersel tunggal yang terbagi

menjadi dua kingdom yaitu, eubacteria dan archaea. Sel prokariotik
ditutup oleh membran plasma. Sebagian besar (dengan beberapa
pengecualian), sel prokariotik tidak memiliki membran intraseluler.
Pada prokariot tidak ditemukan organela bermembran seperti
mitokondria, aparatus golgi, retikulum endoplasma, lisosom-sentriol,
chloroplast. Ukuran ribosom pada prokariot 70S. Prokariot juga
memiliki dinding sel dan membran luar. Bakteri merupakan organisme
prokariot yang memiliki dinding sel. Komponen penyusun dinding sel
pada bakteri terdiri dari peptidoglikan, polimer gula yang saling
berikatan dengan peptida. Penyusun dinding sel pada bakteri gram
positif komponen utamanya berupa peptidoglikan, sedangkan pada
bakteri gram negatif tersusun lebih komplek , berupa peptidoglikan
(lapisan dalam) dan lipid, protein serta liposakaradida (pada lapisan
luar).

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 6

 Materi genetik pada prokariot terletak pada inti sel yang tak
bermembran, single, kromosom berbentuk supercoiling, dan DNA
berbentuk double stranded. Proses sintesis DNA dan RNA pada
prokariot terjadi secara bersamaan. Ukuran genom dalam salah satu
prokariot yang paling banyak dipelajari, E.coli, adalah 4,6 juta
pasangan basa (sekitar 1,1 mm, jika dipotong dan diregangkan). Enzim
DNA Girase berperan mempertahankan bentuk superkoil kromosom
pada bakteri. Selain pada inti sel, materi genetik ekstrakromosom pada
bakteri berukuran DNA kecil disebut plasmid.

Sel eukariotik, di samping membran plasma, memiliki berbagai

macam membran intraseluler yang membentuk organel sel eukariotik.
Organel ini termasuk (tetapi tidak terbatas pada) retikulum
endoplasma, Golgi, lisosom, peroksisom, mitokondria, kloroplas,
endosom, dan nuklei, semuanya dibatasi oleh membran. Organel-
organel ini memberikan beragam fungsi biologis untuk sel eukariotik.
Dalam kasus sel tumbuhan, sel eukariotik mungkin juga memiliki
dinding sel. Dalam sel eukariotik, sintesis DNA dan RNA terjadi dalam
kompartemen terpisah dari sintesis protein. Ukuran ribosom pada
eukariot sebesar 80S.

Sel eukariota, yang kromosomnya masing-masing terdiri dari

molekul DNA linier, ditemukan pada nukleolus. DNA melilit protein
yang dikenal sebagai histones untuk membentuk struktur yang disebut
nukleosom. Nukleosom yang memadat menjadi kromosom. Membran
dan nukleus serta struktur lainnya didukung oleh filamen
penghubung silang, yaitu protein baru, tubulin, dan aktomiosin.
DNA pada eukariota tidak semuanya mengandung materi genetik
atau tidak semuanya diterjemahkan yang dikenal dengan istilah
intron (intragenic region). Bagian DNA yang diterjemahakan ke dalam
RNA mature disebut ekson. Bakteri tidak memiliki intron.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 7

 Gambar 1. Struktur sel prokariotik (a) dan eukariotik (b)
(https://www.cliffsnotes.com/studyguides/biology/microbiology/prokaryotes-and-
eukaryotes/introduction-to-prokaryotes-eukaryotes)

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 8

 Tahapan isolasi DNA:

1. Lisis
Pelisisan dilakukan untuk menghancurkan dinding sel atau
membran sel. Untuk melisiskan dinding sel ataupun membran
ada beberapa cara, secara fisik (menggerus sampel dengan
mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan method
freezing thawing dan radiasi) atau kimiawi (detergen/sodium
dodecyl sulphate) maupun dengan menggunakan enzim
tertentu.
2. Ekstraksi
Adalah proses penghancuran sel/membran sehingga materi
yang ada dalam sel dapat keluar. DNA yang telah diekstraksi
dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi ini akan menghasilkan 2 fase
yang terpisah, fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus
(air) pada lapisan atas. DNA dan RNA akan berada pada fase
aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang
terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada
pada fase organik. Kontaminasi oleh RNA pada hasil isolasi DNA
dapat dihilangkan dengan pemberian RNAse.
3. Pengendapan/presipitasi
DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Proses
presipitasi ini dapat menggunakan etanol atau isopropnol,
dimana dua senyawa ini akan mempresipitasi DNA pada fase
aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber
dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi.
4. Rehidrasi
Rehidrasi DNA merupakan teknik pemurnian DNA dengan cara
mengeringkan atau menguapkan.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 9

B. TUJUAN PRAKTIKUM:
1. Agar mahasiswa memahami prinsip-prinsip isolasi DNA
2. Agar mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA dari sampel
darah

C. PRAKTIKUM ISOLASI DNA DARI SAMPEL DARAH

a. Alat
1. Mikropipet ukuran 1000µ
2. Mikropipet ukuran 100µ
3. Sentrifus suhu 4°C
4. Thermal Block
5. Rak rainbow atau rak sampel

b. Bahan
1. Whole blood
2. Kultur Isolat Bakteri
3. Kit isolasi DNA genom ;
- Binding Bufer Solution
- Lysosim
- Proteinase K
- Gram + Solution
- Inhibitor Remover Bufer
- Wash Bufer
- Elution Bufer
4. Ethanol pro analis
5. Tabung mikrosentrifus 1.5ml
6. Filter tips ukuran 1000µ
7. Filter tips ukuran 200µ
8. Facial tissue
9. Alkohol 70%
10. Plastik wrap
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 10
 11. Larutan Clorin
12. Masker
13. Glove berbahan nitril

c. Cara kerja:
Persiapan alat dan bahan
Persiapkan sampel darah.
Sterilkan alat-alat yang akan digunakan: Spray meja kerja,
mikropipet, gloves dan lain-lain dengan alkohol 70%
kemudian usap menggunakan Facial tissue. Buang Facial
tissue ke dalam tempat sampah padat.
 Isolasi DNA dari sampel darah menggunakan
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)
(terlampir).

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 11

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 12
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 13
Prosedur Isolasi DNA dari kultur isolate Bakteri menggunakan
PrestoTM Mini gDNA Bacteria Kit Protocol

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 14

REFERENSI

- Clouse, R. Purpose of Cell Lysis

Solution. 1999. http://www.ehow.com/about_6652172_purpose-
cell-lysis-solution.html: 1hlm. 30 April 2014, pk 14.46 WIB.
- Jönsson J and Martin W S. 2017 PCR-based Lab
Protocolshttp://www.biology.lu.se/internal/sites/biology.lu.se.in
ternal/files/pcrbasedlabprotmeeljan2017.pdf
- Killham K and Prosse JI. 2015. The Bacteria and Archaea- Soil
Microbiology, Ecology, and Biochemistry. pp 41-75
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-415955-6.00003-7
- Parker J. 2001. Bacteria. Academic Press, pp 146-150. doi:
10.1006/rwgn. 2001.0102
- Sanchez, L. 2001. TCA protein precipitation
protocol.http://www.its.caltech.edu/~bjorker/Protocols/TCA_p
pt_protocol.pdf: 1hlm. 30 April 2014, pk 14.00 WIB.
- Snustad, D.P. & M.J. Simmons. 2003. Principles of
genetics. John Willey & Sons inc, U.S : 840hlm.
- William RJP and Frausto da Silva JJR. 2006. Unicellular
Eukaryotes Chemotypes (About One and a
- Half Billion Years Ago?)- The Chemistry of Evolution, pp277-
312. https://doi.org/10.1016/B978-044452115-6/50050-6
- http://www.geneaid.com/products/genomic-
dnapurification/dna-extraction-kit-bacteria-miniprep

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 15

 PRAKTIKUM II
POLYMERASE CHAIN REACTION DAN ELEKTROFORESIS

1. PRAKTIKUM POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

A. Prinsip Kerja
Polymerase chain reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
merupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) DNA secara
enzimatik. Teknik ini banyak dilakukan di bidang biokimia,
bidang kedokteran/medis dan biologi molekuler karena
mempunyai kelebihan cukup praktis dan murah, hanya
memerlukan sampel yang sedikit, dan dapat dihasilkan DNA
dalam jumlah besar dengan waktu singkat.
B. Tujuan Praktikum
1. Agar mahasiswa memahami prinsip kerja dan kegunaan
Polymerase chain reaction (PCR).
2. Agar mahasiswa memahami pembuatan reaksi PCR.
3. Agar mahasiswa memahami cara menjalankan alat Thermal
Cycle (PCR).

C. Komponen dalam penggunaan teknik PCR

Berbagai komponen dalam Polymerase chain reaction (PCR) yaitu:
1. DNA Template (cetakan), yaitu DNA untai ganda yang
membawa urutan basa fragmen yang akan digandakan.
2. DNA Polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis polimerisasi
nukleotida menjadi untaian DNA.
3. Oligonukleotida Primer, yaitu DNA utas tunggal atau
oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus
membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.
Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang
urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal
dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis
menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer.
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 16
 4. dNTP (deoxynucleoside triphosphate), sebagai „batu bata‟
penyusun DNA yang baru, terdiri atas 4 macam sesuai
dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan
dTTP.
5. Buffer, yaitu bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan
reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan DNA
polymerase.
6. Ion Logam, sebagai kofaktor DNA polymerase, tanpa ion ini
DNA polymerase tidak dapat bekerja. Umumnya ion bivalen
(Mg2+) dan monovalen (K+).
D. Tahapan Reaksi
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler
yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu
cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Setiap siklus reaksi PCR
terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua
utas tunggal melalui pemanasan pada temperatur 94-96 °C
selama 30-60 detik.Selama proses denaturasi, DNA untai
ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini
disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak
berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang
sebelumnya.
2. Annealing atau Penempelan, yaitu hibridisasi antara
oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA
pada suhu 45-60 °C.
3. Ekstensi/elongasi, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu
utas DNA baru oleh enzim DNA polymerase pada suhu 70-
72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan
dNTP yang sesuai pada pasangannya.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 17

 Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri
oleh tahapan berikut:
1. Pra-denaturasi, dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi
untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi
DNA Polimerase.
2. Final Elongasi, dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC)
selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal
yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini
dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

E. Peranan dan Fungsi PCR

Teknik Polymerase Chain Reaction berperan untuk :
1. Amplifikasi urutan nukleotida.
2. Menentukan kondisi urutan nukleotida yang mengalami
mutasi.
3. Bidang kedokteran forensik.
4. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger
print.
F. Aplikasi teknik PCR
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai
macam kebutuhan, diantaranya :
1. Isolasi Gen, untuk mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA
genom manusia dan menyisipkannya ke sel bakteri,
diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama „probe‟
yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang
kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR
menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
2. DNA Sequencing, urutan basa suatu DNA dapat ditentukan
dengan teknik DNA Sequencing, dimana proses awalnya
adalah reaksi PCR menggunakan satu primer dengan
tambahan dideoxynucleotide.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 18

 3. Forensik, jika proses identifikasi korban secara fisik sulit
dilakukan, maka dilakukan pengujian DNA dengan mengambil
sampel dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan
analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu
DNA yang disebut fingerprints. Hasilnya dibandingkan dengan
DNA sidik jari keluarga yang memiliki pertalian darah.
4. Diagnosa Penyakit, PCR merupakan teknik yang sering
digunakan untuk diagnosa penyakit berbahaya seperti
Influenza A(H1N1).

G. Cara Kerja PCR

1. Alat
a. Thermal clycler
b. Mikropipet ukuran 100µ
c. Mikropipet ukuran 10µ
d. Sentrifus suhu 4°C
e. Rak rainbow
2. Bahan
a. Template (asam nukleat/ DNA genom darah dan DNA
genom Bakteri)
b. Enzim Polimerase
c. Primer upstream
d. Primer downstream
e. Nuclease free water
f. MgCl
g. DNTP
h. Tabung PCR ukuran 200µ
i. Masker
j. Glove berbahan nitril

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 19

 3. Cara Kerja:
a. Ambil tabung PCR ukuran 200µ dan buka tabung. Berikan
kode pada tabung dengan bolpoin marker di bagian sisi
samping tabung BUKAN pada tutup tabung.
b. Ambil nuclease free water dengan mikropipet lengkap
dengan filter tips, masukan ke dalam tabung PCR.
c. Tambahkan MgCl ke dalamnya dengan mikropipet lengkap
dengan filter tips baru.
d. Tambahkan dNTP ke dalamnya dengan mikropipet lengkap
dengan filter tips baru.
e. Tambahkan primer upstream ke dalamnya dengan
mikropipet lengkap dengan filter tips baru.
f. Tambahkan primer downstream ke dalamnya dengan
mikropipet lengkap dengan filter tips baru.
g. Tambahkan polimerase ke dalamnya dengan mikropipet
lengkap dengan filter tips baru.
h. Tambahkan template (asam nukleat) ke dalamnya dengan
mikropipet lengkap dengan filter tips baru.
i. Tutup tabung. Masukan tabung ke dalam mesin Thermal
Cycler.
j. Atur siklus pada mesin Thermal cycler sesuai kondisi.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 20

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 21
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 22
 PRAKTIKUM III
ELEKTROFORESIS

A. Pengertian
Elektroforesis adalah istilah yang mendeskripsikan migrasi zat-
zat koloidal ataupun ion-ion yang relatif kecil karena pengaruh medan
listrik. Elektroforesis menggunakan prinsip dasar yang mirip dengan
sedimentasi. Perpindahan tempat pada sedimentasi didasarkan atas
molar dan massa padat, sedangkan pada elektroforesis perpindahan
tempat didasarkan pada perbedaan muatan listrik suatu senyawa.
Teknik elektroforesis ini digunakan untuk memisahkan suatu senyawa
berdasarkan perbedaan muatan listrik. Muatan molekul dapat positif
ataupun negatif, misalnya protein dan turunannya, namun ada juga
yang tidak bermuatan seperti lemak dan karbohidrat. Molekul-molekul
dalam suatu senyawa tersebut akan bergerak ke arah kutub-kutubnya.
Kecepatan pergerakan ion-ion dan molekul ke arah kutub ini berbeda-
beda yang dipengaruhi oleh beberapa fator, yaitu: besarnya tegangan
medan listrik, jumlah muatan yang dibawa oleh ion, besar koefisien
friksional (gesekan), viskositas larutan dan ukuran (berat dan besar)
ion.
Ukuran ion atau molekul sering dikaitkan dengan massa ion
atau molekul tersebut. Kecepatan gerakan molekul dipengaruhi oleh
jumlah muatan dan besarnya massa yang dinyatakan sebagai rasio
jumlah massa dengan muatan (c-rn ratio). Suatu ion atau molekul
yang memiliki c-rn ratio yang makin besar akan memiliki gerakan ion
atau molekul yang semakin cepat. Perbedaan ukuran inilah yang
mendasari adanya perbedaan kecepatan pergerakan ion-ion di dalam
medan listrik. Ion-ion maupun molekul kecil dengan muatan yang
banyak, akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan ion-ion
ataupun molekul yang besar tapi muatannya sedikit.
Teknik elektroforesis ini dapat digunakan untuk menentukan
ukuran DNA, berdasarkan migrasi DNA di dalam gel agarose atau gel
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 23
poliakrilamid. DNA yang bergerak di dalam gel ini sebelumnya
diwarnai, salah satunya dengan ethidium bromida agar dapat
divisualisasikan dengan sinar ultra violet (sinar UV). Ethidium ini akan
mengikat molekul DNA, molekul ethidium bromida ini dapat
menangkap sinar UV sehingga pendaran dari UV ini dapat terlihat.
Elektroforesis gel agarose ini umumnya digunakan untuk
memisahkan asam nukleat dari beberapa kondisi, diantaranya :
1. Hasil isolasi DNA
2. Hasil restriksi pengguntingan pita DNA
3. Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) baik DNA dan/atau
RNA
DNA memiliki molekul yang bermuatan negatif, sehingga bila
diberi medan listrik akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan migrasi DNA ini dipengaruhi oleh :
(1) ukuran molekul DNA, (2) kerapatan media (gel) yang dilalui
oleh DNA , (3) arus listrik yang diberikan untuk memicu migrasi
molekul DNA. Semakin kecil ukurannya, DNA akan bermigrasisemakin
cepat. Semakin rapat media yang digunakan, semakin lambat DNA
bermigrasi. Kerapatan media tersebut ditentukan oleh konsentrasi
media. Semakin besar arus yang digunakan, semakin cepat DNA
bermigrasi.
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur
dengan penyangga muatan pewarna ( loading buffer/dye). Loading
buffer ini berfungsi untuk : (1) menambah densitas, sehingga DNA
berada di bagian bawah dari sumur (well), (2) memudahkan
meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, (3) penanda laju migrasi
DNA.Beberapa pewarna yang biasa digunakan diantaranya: (1)
bromofenol biru (Blue bromophenol), dan xylene cyanol. Kecepatan laju
bromofenol biru di dalam gel agarosa 2x lebih cepat dibandingkan
dengan laju xylene cyanol. Laju migrasi bromofenol biru di dalam gel
agarosa (0,5 – 1,4%) di dalam larutan penyangga 0,5 X TBE kira-kira

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 24

sebanding dengan laju migrasi DNA untai ganda linier sebesar 300 pb
(pasangan basa).

B. Tujuan Praktikum
1. Agar mahasiswa memahami prinsip kerja dan kegunaan tehnik
elektroforesis
2. Agar mahasiswa memahami pembuatan gel agarosa
3. Agar mahasiswa memahami cara memisahkan asam-asam
nukleat dan molekul protein dengan menggunakan peralatan
elektroforesis
C. Alat dan Bahan
Alat
1. Mesin elektroforesis
2. Chamber elektroforesis
3. Power supply
4. Mikropipet ukuran 10µ
5. Water bath
6. Cetakan agarose
7. Sisir agarose
8. Erlemeyer
9. Microwave
10. Gel Doc
11. Komputer

Bahan
1. Produk PCR
2. Gel Agarose
3. Buffer TAE
4. Marker 100bp
5. Loading dye
6. SYBR Safe DNA Gel Stain
7. Facial Tissue
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 25
 8. Masker
9. Glove berbahan nitril

Cara membuat larutan penyangga/buffer elektroforesis: 1xTAE

atau 1xTBE
TAE 50X (stok):
- Tris-HCl; pH 8,3 2 M
- Asam asetat pekat 0,99 M
- EDTA 50 mM
*Catatan: Sebelum digunakan harus diencerkan 50X,
sehingga konsentrasi akhirnya menjadi 1X

D. Prosedur/Cara kerja
1. Ambil bubuk agarose lalu timbang dengan neraca analitik.
(berat menyesuaikan).
2. Masukan bubuk agarose yang telah ditimbang ke dalam
tabung erlemeyer.
3. Tambahkan buffer TAE sejumlah yang diinginkan. Masukan
magnetic stirrer ke dalam erlemeyer.
4. Tutup tabung menggunakan plastik wrap hingga rapat.
5. Masukan tabung ke dalam microwave. Nyalakan microwave
selama 30 detik.
6. Matikan Microwave. Amati bubuk agarose. Jika masih belum
larut ulangi langkah “5” hingga bubuk agarose larut. Proses
ini jangan sampai plastik penutup tabung meletup.
7. Masukan tabung erlemeyer ke dalam waterbath bersuhu
55°C.
8. Tambahkan SYBR Safe DNA Gel Stain ke dalam larutan
agarose dengan perbandingan 1:10.000X.
9. Pasang sisir agarose ke dalam cetakan agarose.
10. Tuang larutan agarose yang sudah suma-suam kuku ke
dalam cetakan. Diamkan hingga beku.
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 26
 11. Ambil gel agarose beku lalu masukan ke dalam chamber
elektroforesis.
12. Tambahkan buffer TAE ke dalam chamber hingga menutup
seluruh permukaan agarose.
13. Ambil produk PCR dengan mikropipte yang telah terpasang
dengan filter tips.sebanyak 1/10 total volume produk PCR.
Tambahkan loading dye jika perlu (jika produk PCR berwarna
bening).
14. Masukan semua produk PCR hingga semua sumuran pada
agarose tinggal satu sumur.
15. Ambil marker dengan mikropipet yang telah terpasang
dengan filter tips, campur dengan loading dye hingga
sempurna.
16. Masukan marker yang telah tercampur dengan loading dye
ke dalam sumur agarose.
17. Tutup chamber elektroforesis, pastikan warna katup kabel
pada tutup tidak tertukar dengan warna katup pada
chamber.
18. Hubungkan kabel cahmber ke dalam power supply.
19. Nyalakan power supply, atur tombol voltage, tombol waktu
yang sesuai. Lalu tekan tombol “on” pada power supply.
20. Tunggu hingga proses running selesai.
21. Matikan power supply. Buka tutup chamber dengan hati-
hati. Hindari menghirup uap dari chamber.
22. Nyalakan Gel Doc dan Komputer.
23. Ambil beberapa lapis tissue facial. Letakan di tangan kiri.
Ambil gel agarose dari chamber dengan tangan kanan lalu
letakan di tangan kiri.
24. Letakan gel agarose ke dalam mesin Gel Doc.
25. Buang glove dan tissue yang tercemar oleh SYBR Safe DNA
Gel Stain ke dalam sampah khusus B3.
26. Nyalakan gel Doc untuk visualisasi hasil PCR.
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 27
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 28
 BIOENERGETIKA

Yuliana Heri Suselo dan Dono Indarto

A. TUJUAN PEMBELAJARAN
1. Mahasiswa mampu menjelaskan konsep bioenergetika seluler
2. Mahasiswa mampu menjelaskan hubungan metabolisme sel dan
metabolisme antara
3. Mahasiswa mampu menjelaskan pemeriksaan kadar ATP, ADP
dan rasio ATP/ADP
4. Mahasiswa mampu melakukan pemeriksaan kadar ADP dan ATP
pada sampel manusia dan menginterpretasikan hasil
pemeriksaan
5. Mahasiswa mampu menganalisis hasil pemeriksaan dengan
aplikasi klinis

B. DASAR TEORI

Adenosine triphosphate (ATP) merupakan sumber energi utama

untuk aktivitas seluler dalam berbagai organ tubuh makhluk hidup.
ATP jumlahnya terbatas sehingga perlu pembentukan secara
berkesinambungan untuk menjaga aktivitas tersebut tetap
berlangsung. Pembentukan ATP dapat berlangsung melalui
metabolisme tanpa menggunakan oksigen (proses anaerobik) dan
dapat menggunakan oksigen (proses aerobik). Proses pembentukan
energi tersebut terjadi di organela mitokondria. Dengan demikian,
metabolisme energi merupakan seluruh rangkaian reaksi kimia yang
berlangsung dalam sel setiap makhluk hidup untuk menghasilkan
ATP.
Secara umum, metabolisme dibagi menjadi 2 yaitu katabolisme
(membebaskan energi) dan anabolisme (membutuhkan energi).

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 29

 Selama proses katabolisme, energi yang dilepaskan dalam bentuk
ATP dengan bantuan sejumlah enzim dan koenzim sebagai donor
elektron seperti NADH dan FADH2. Sel-sel organ tubuh mengatur
jalur metabolisme melalui lima cara dasar :
1. Mengatur konsentrasi enzim.
2. Menghasilkan modulator yang dapat mengubah kecepatan
reaksi.
3. Menggunakan dua enzim berbeda untuk mengkatalisis reaksi
reversibel.
4. Memilah enzim-enzim di dalam organel intraseluler
(kompartementasi).
5. Mempertahankan rasio optimal ATP/ADP.

Dalam sel-sel makhluk hidup, seluruh reaksi enzimatis dalam

metabolisme terangkai dengan adenin nukleotida baik dalam
mensintesis maupun menggunakan energi. ATP, ADP dan AMP
merupakan senyawa esensial dalam sel untuk reaksi katabolisme
maupun anabolisme. ATP, ADP dan AMP adalah allosteric effector
untuk banyak enzim. Ketiga senyawa tersebut juga berperan sebagai
regulator untuk menentukn apakah jalur yang menghasilkan sintesis
ATP berjalan atau tidak.
Hampir semua metabolisme selular ditentukan oleh status energi
dalam sel. Rasio adenin nukleotida jauh lebih penting dibandingkan
dengan konsentrasi masing-masing sehingga Atkinson merumuskan
dalam bentuk adenylate energy charge (AEC) atau status energi:
AEC = ATP + (0,5 ADP/ATP + ADP +AMP)
Nilai EC berkisar dari 0 tanpa keberadaan ATP dan ADP atau 1 semua
dalam bentuk ATP. Dalam keadaan steady state, nilai AEC adalah 0,7
sampai 0,95 untuk menjaga pertumbuhan sel secara optimal. Dengan
demikian, keseimbangan terjadi antara reaksi-reaksi yang
menghasilkan energi dan menggunakan energi. Apabila nilai AEC

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 30

kurang dari 0.7, sel mengalami kondisi stres dan dapat memicu
terjadinya kematian sel.
Adenosine diphosphate (ADP) adalah produk defosforilasi ATP dan
dapat mengalami refosforilasi kembali. Proses defosforilasi dan
refosforilasi terjadi melalui jalur fosfatase, fosforilase dan kinase.
Kadar ADP menentukan regulasi beberapa enzim yang berpengaruh
terhadap metabolisme antara. Konversi ADP menjadi ATP terutama
terjadi di mitokondria meskipun proses secara keseluruhan terjadi di
sitoplasma. Konversi AMP dan ADP menjadi ATP memerlukan enzim
penting yang disebut AMP-Kinase (AMPK). AMPK adalah sensor energi
seluler, jika ATP tinggi maka AMPK akan inaktif sedangkan jika ATP
rendah maka AMPK akan terfosforilasi dan teraktivasi untuk
mengontrol metabolisme sel.

C. CARA KERJA
(Perhatian : seluruh sampel dan standar harus dikerjakan secara
duplicate).

Standar ATP untuk deteksi kolorimetrik (Sesuai Technical Bulletin

ATP Assay Sigma-Aldrich®)
1. Larutkan 10 µL 10 mM (10 nmol/µL) ATP Standard Solution
dengan 90 µL ATP Assay Buffer menjadi 1 mM (1 nmol/µL)
larutan standar.
2. Masukkan 0, 2, 4, 6, 8, and 10 µL 1 mM ATP larutan standar
pada microplate 96 sumuran
3. Tambahkan ATP Assay Buffer tiap sumuran sampai volume 50
µL.

Persiapan sampel
1. Sampel yang berbentuk cairan misalnya plasma atau serum bisa
langsung diperiksa.
Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 31
 2. Jaringan (10 mg) atau sel (1x 106) dihomogenisasi dalam 100 µL
ATP Assay Buffer. Kemudian disentrifus 13.000xg selama 10
menit untuk menghilangkan material tidak larut.
3. Ambil 5 µL sampel dan masukkan ke dalam microplate 96
sumuran
4. Tambahkan ATP Assay Buffer ke dalam tiap sampel sampai
volume 50 µL.

Pemeriksaan ATP
1. Buat Master Mixed Reaction sesuai Tabel 1 sehingga menjadi
50 µL volume
Tabel 1. Cara Pembuatan Master Mixed Reaction

2. Tambahkan 50 µL Reaction Mix pada tiap sumuran kemudian

dihomogenisasi dengan shaker atau pipeting dan diinkubasi
selama 30 menit. Tutup plate dengan sempurna dan terhindar
dari cahaya langsung.
3. Ukur absorbansi pada 570 nm (A570)

D. INTERPRETASI HASIL
Latar belakang pemeriksaan ATP ditunjukkan warna hasil
pengukuran pada sumuran blanko. Semua hasil pengukuran sumuran
standar dan sampel dikurangi dengan hasil pengukuran blanko. Buat
kurva standar untuk menentukan rumus kadar ATP yang tepat.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 32

 Konsentrasi ATP
C = Sa/Sv

Sa = Jumlah ATP sampel (nmol)

Sv = Jumlah volume sampel (µL) yang ditambahkan di tiap sumuran
C = Konsentrasi ATP pada sampel
Berat molekul ATP: 507,17 g/mol
Contoh perhitungan
Diketahui: Sa = 5,84 nmol (dari kurva standard), Sv = 50 µL
Konsentrasi ATP pada sampel
5,84 nmol/50µL = 0,1168 nmol/µL
0,1168 nmol/µL x 507,17 ng/nmole= 59,24 ng/µL

Standar ADP untuk deteksi kolorimetrik (Sesuai Technical Bulletin

ADP Assay Sigma-Aldrich®)
1. Larutkan 10 µL 10 mM (10 nmol/µL) ADP Standard Solution
dengan 90 µL ADP Assay Buffer menjadi 1 mM (1 nmol/µL)
larutan standard.
2. Tambahkan 0, 2, 4, 6, 8, and 10 µL 1 mM ADP larutan standard
pada 96 sumuran, menjadi 0 (blank), 2, 4, 6, 8, and 10
nmol/sumuran standard.
3. Tambahkan ADP Assay Buffer tiap sumuran sampai volume 50
µL.
Persiapan sampel
5. Sampel yang berbentuk cairan misalnya plasma atau serum bisa
langsung diperiksa.
6. Jaringan (10 mg) atau sel (1x 106) dihomogenisasi dalam 100 µL
ADP Assay Buffer. Kemudian disentrifus 13.000xg selama 10
menit untuk menghilangkan material tidak larut.
7. Ambil 5 µL sampel dan masukkan ke dalam microplate 96
sumuran

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 33

 8. Tambahkan ATP Assay Buffer ke dalam tiap sampel sampai
volume 50 µL.
Pemeriksaan ADP
4. Buat Master Reaction Mixes sesuai tabel sehingga menjadi 50 µL
Master Reaction Mix tiap sumuran baik blank, standard,
maupun sampel.

5. Tambahkan 50 µL Reaction Mix pada tiap sumuran kemudian

dihomogenisasi dengan shaker atau pipeting dan diinkubasi
selama 30 menit. Tutup plate dengan sempurna dan terhindar
dari cahaya langsung.
6. Ukur absorbansi pada 570 nm (A570)

E. INTERPRETASI HASIL
Warna latar belakang diindikasikan dengan hasil pengukuran
pada sumuran blanko. Koreksi semua sumuran dengan mengurangi
absorbansi yang diperoleh dari blanko. Buat kurva standard untuk
menentukan rumus kadar ADP yang tepat.
Konsentrasi ADP
Sa/Sv = C
Sa = Jumlah ADP dari sampel (nmol)
Sv = Jumlah volume sampel (µL) yang ditambahkan di tiap sumuran
C = Konsentrasi ADP pada sampel
Berat molekul ADP: 427,2 g/mol

Contoh perhitungan
Diketahui: Sa = 5,84 nmole (dari kurva standard), Sv = 50 µL

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 34

 Konsentrasi ADP pada sampel
5,84 nmol/50µL = 0,1168 nmol/µL
0,1168 nmol/µL x 427.2 ng/nmol= 49,9 ng/µL

F. DISKUSI
1. Bagaimana kontrol metabolisme sel melalui enzim?
2. Bagaimana kontrol metabolisme sel melalui kompartementasi?
3. Bagaimana kontrol metabolisme sel melalui rasio ATP/ADP?
4. Bagaimana hubungan antara kadar ADP dengan aplikasi klinis?
5. Bagaimana hubungan rasio ATP/ADP dengan aplikasi klinis?
6. Bagaimana peran AMPK terhadap regulasi metabolisme seluler?

G. DAFTAR PUSTAKA
1. Guyton AC & Hall JE 2011, Guyton and Hall Textbook of Medical
Physiology, 12th ed, Elsevier, Philadelphia.
2. Hardie, D.G. And Ashford, M.L.J. 2014. AMPK: Regulating energy
balance at the cellular and whole body levels. Physiology Review
29: 99–107.
3. Lim, C.T., Kola, B. and Korbonits, M. 2010. AMPK as a hormon
mediator signalling. Journal of Molecular Endocrinology 44 : 87-
97.
4. Martini F, Nath J and Bartholomew. 2012. Fundamentals of
Anatomy & Physiology 9th ed. Pearson Benjamin Cummings.
San Fransisco.
5. Mihaylova, M.M. and Shaw, R.J. 2011. The AMPK signalling
pathway coordinates cell growth, autophagy and metabolism.
Nature Cell Biology 13 (9) :1016-1023
6. Silverthorn, D.U. 2010. Human Physiology. 5th edition. Benjamin
Cumming-Pearson Publisher. pp :724-42.
7. Towler, M.C. and Hardie, D.G. 2007. AMP-activated protein
kinase in metabolic control and insulin signalling. Circulation
Research 100 : 328-41.
8. Sigma-Aldrich Co.LLC. 2012. Technical Bulletin : ATP/ADP
Colorimetric/Fluorometric Assay Kit. sigma-aldrich.com. St Louis,
USA.
9. De la Fuente1, I.M., Cortés, J.M., Valero, E., Desroches, M.,
Rodrigues, S., Malaina, I. and Martínez, L. 2014. On the
dynamics of the adenylate energy system: homeorhesis vs
homeostasis. Plos One 9(10): e108676.

Buku Panduan Praktikum Biomedik_2021 35