OLEH :
JURUSAN BIOLOGI
Penulis
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
B. Tujuan Praktikum
C. Manfaat Praktikum
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Metode Paraffin
C. Morfologi Nipple
C. Prosedur Kerja
1. Sampling
2. Fiksasi
3. Dehindrasi
4. Clearing
5. Embedding
6. Bloking
7. Sectioning
8. Staining
9. Mouting
10. Mikrofotografi
A. Hasil Pengamatan
B. Pembahasan
BAB V PENUTUP
A. Kesimpulan
B. Saran
LAMPIRAN
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Meneliti suatu organisme baik dari tingkat sel, jaringan, organ dan
sebagainya memerlukan cara tertentu untuk mempermudah penelitian
tersebut. Hewan dan tumbuhan dapat diteliti dengan terlebih dahulu
membuat preparat dengan berbagai metode yang telah ditemukan, metode
tersebut yang paling umum adalah mikroteknik.
C. Manfaat Praktikum
1. Untuk menambah pengetahuan tentang struktur dan bagian-bagian
jaringan hewan yang diamati.
2. Untuk mengetahui cara pembuatan preparat dengan metode paraffin
dari organ hewan yang diamati
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Metode parafin
Metode parafin merupakan metode yang paling sering digunakan
dalam hal pembuatan sediaan sayatan. Metode ini memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan dengan metode sediaan sayatan dengan
embedding lainnya yaitu prosesnya lebih cepat dan hasil sayatan sangat
tipis yaitu 6-8 µm. Metode ini dapat melarutkan beberapa enzim penting
pada jaringan, karena selama prosesnya, jaringan akan dimasukan kedalam
beberapa larutan kimia yang berbeda konsentrasi dan beda karakter
sehingga dibutuhkan konsentrasi dan ketepatan urutan saat melakukan
metode ini (Roberts, 2009)
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu
tumbuhanataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-
kebaikan metode ini ialahirisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan
metoda beku atau metoda seloidin.Dengan metoda beku, tebal irisan rata-
rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat
mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifatseri dapat
dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini.Kelemahan dari
metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.
Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila
menggunakanmetode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada
jaringan akan larutdengan menggunakan metode ini (Santoso, 2002).
Untuk pemrosesan jaringan dan pembuatan blok parafin, bahan
yang digunakan adalah alkohol absolut, 90%, 80%, 70%, xilol dan parafin
cair. Xilol, alkohol dengan konestrasi menurun, aquadest, pewarna alum
hematoksilin, alkohol asam, larutan amonia, pewarna eosin, serta etanol
digunakan untuk mewarnai jaringan dengan pewarnaan hematoksilin
eosin, sedang bahan yang digunakan untuk pewarnaan toluidine blue
adalah xilol, etanol 70%, pewarna toluidine blue (working solution) yang
dibuat dari 5 ml larutan stok toluidine blue (1 gram Toluidine Blue O
dalam 100 ml alkohol 70%) dalam 50 ml larutan NaCl 1%. Alat yang
digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan nekropsi, tissue cassete,
automatic tissue prosesor, embeding machine, mikrotom, penangas air,
inkubator, gelas objek, gelas penutup, mikroskop dan kamera set untuk
menganalisa hasil (Olympus CX21FS1 dan OptiLab Viewer)
(Kuncorojakti, 2014).
Metode parafin digunakan untuk membuat sediaan sayatan dengan
ketebalan yang kecil. Metode ini sangat baik digunakan pada hewan
maupun tumbuhan. Proses yang dilakukan dalam metode ini antara lain
sediaan organ, fiksasi, pencucian, pewarnaan, dehidrasi, penjernihan, dan
penempelan pada gelas objek (Sariowati, 2008).
Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai
berikut :
1. Sampling
Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini
diambil beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka
dipotong-potong terlebih dahulu.
2. Pengambilan jaringan :
a. Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer
b. Pemotongan harus dengan pisau yang tajam
c. Ukuran potongan sebaiknya 1 cm
d. Secepatnya difiksasi
Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca
mati dan perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam
pengamatan. Kesulitan dari tahap ini adalah waktunya yang sedikit harus
dipercepat dalam pengerjaannya sehingga terkesan menjadi terburu-buru.
3. Fiksasi (fixation)
Tujuan utama fiksasi adalah memberikan perlakuan tertentu
terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga
dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan
aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan
yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim
yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis.
Dengan kata lain fiksasi bertujuan :
a. Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan
dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan
aslinya.
b. Mencegah autolisis
c. Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras
yang merupakan komponen cairan fiksatif.
d. Kesulitan dari tahap ini hanyalah memerlukan waktu yang lama
untuk pengerjaannya, karena fiksasi membutuhkan waktu yang lama untuk
dapat membuat spesimen awet.
4. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu
dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupakan
langkah penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak
terputus-putus. Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya
proses penamanan dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah
proses dehidrasi tersebut. Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang
kita gunakan hedaklah memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut :
a. Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air
tersebut
b. Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh medium
penjernih
c. Tidak merusak dan mengganggu tisu yang telah difiksasi
sebelumnya sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunak kembali
ataupun malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh. Kesulitan dari
tahap ini adalah dalam pemilihan dehidran yang digunakan agar sesuai
sehingga tisu tidak menjadi terlalu lunak dan malah menjadi terlalu keras
(Dasumiati, 2008).
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok
parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris
dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom
menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan
menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca
objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut
diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki
kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang
sangat baik .Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi
dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin
pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna
hematoxilin ini bersifat aquaosa (Steven, 2000).
Mikrotom ada beberapa macam yaitu:
1. Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap
berada pada tempatnya,sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya
jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang
tanpa penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita
irisan. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan
pewarnaan tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini
banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2. Mikrotom beku (freezing microtome). Alat ini dihubungkan
dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini,
keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada pada
tempatnya sedang pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke
belakang.
3. Mikrotom putar (rotary microtome). Berbeda dengan 2 jenis
mikrotom diatas, yaitu bahwa pada mikrotom ini, pisau tetap pada
tempatnya sedang jaringannya yang bergerak ke atas dan ke bawah. Jenis
mikrotom ini yang biasanya digunakan untuk pembuatan sediaan irisan
dengan metode parafin (Amelia,2005).
Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas
berbagai elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan
ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan
dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan
Hematoxilin-eosin.Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan
terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin
digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan
kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari
pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain
yang intensitas pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan
hematoxilin.Kesulitan tahapan ini adalah memilih jenis pewarna, karena
dengan ketepatan pemilihan bahan pewarna dapat menyesuaikan bagian
apa pada spesimen tersebut yang akan dilihat. Jika terjadi kesalahan dapat
terjadi kekeliruan dalam tujuan penglihatan spesimen (Dasumiati, 2008).
C. Nipple
2. Bahan
a. Kambing (Capra aegagrus hircus)
b. Larutan fiksatif (Bouin)
c. Alkohol seri (70% - 100% atau absolute)
d. Xylol (1-3)
e. Soft parafin (1-2)
f. Hard Parafin (3)
g. Pewarna eosin – hemaxtosillin
h. Air ledeng
i. Aquades
C. Prosedur Kerja
Adapun dalam hal atau tahapan yang dilakukan dalam mikroteknik antara lain
adalah sebagai berikut :
1. Pengambilan Jaringan (Sampling/ Obtain the sample)
a. Hewan yang akan diambil jaringannya terlebih dahulu dikorbankan
(bisa menggunakan kloroform atau eter, dislokasi leher atau
disembelih)
b. Lakukan pembedahan jika jaringan yang akan dibuatkan preparat
merupakan jaringan dari organ-organ visera.
c. Jaringan diambil dengan ukuran 1x1 cm
2. Pengawetan Jaringan (Fixation),
a. Organ yang diambil dibersihkan dengan larutan fisiologis.
b. Kemudian organ atau sampel disimpan dan ke dalam larutan
Bouins. Selama 24 jam
c. Sampel diletakkan dalam botol sampel yang telah diberi label
dengan jelas.
3. Penarikan Air (Dehdrationi),
a. Merendam jaringan sampel yang telah tersimpan dalam kotak jaringan
atau tissue box. Penarikan air yang ada dalam jaringan sampel dengan
menggunakan larutan alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, absolut I, absolut II,
dan absolut III Secara sederhana waktu yang diperlukan untuk kegiatan
dehidrasi adalah sebagai berikut :
Alkohol 70% 12 jam (resting point)
Alkohol 80% 3 jam (24 jam)
Alkohol 90% 3 jam
Alkohol 95% 3 jam
Alkohol Absolut I 1 jam
Alkohol Absolut II 1 jam
Alkohol Absolut III 1 jam
4. Penjernihan (Clearing)
a. Setelah sampel jaringan didehidrasi maka kemudian dilakukan
penjernihan atau clearing. Waktu yang diperlukan pada proses
penjernihan didalam xylol adalah sebagai berikut:
A. HASIL PENGAMATAN
PERBESARAN 10X10
B. PEMBAHASAN
Pada pengamatan pratikum kali ini mengenai tentang preparat
jaringan, yang mana saya mendapatkan bagian Nipple membujur kambing (Capra
aegagrus hircus) . Pada glandula mammae terdapat tiga bagian utama yaitu:
Korpus (badan) yakni bagian yang membesar, lalu Aerola yakni bagian yang
mengelilingi nipple, yang seringkali bewarna lebih gelap dari kulit sekitarnya dan
nipple atau papila atau puting yakni bagian yang menonjol . Pada mamalia, nipple
atau puting susu disebut juga papilla mammae atau dot. Pada Korpus terdapat
Alveolus, yaitu unit terkecil yang memproduksi susu. Bagian dari alveolus adalah
sel Aciner, jaringan lemak, sel plasma, sel otot polos dan pembuluh darah.
Lobulus, yaitu kumpulan dari alveolus. Landula mammae terutama tersusun atas
jaringan kelenjar tetapi juga mengandung sejumlah jaringan lemak dan di tutupi
oleh kulit. Struktur didalamnya dikatakan menyerupai segmen buah anggur atau
jeruk yang dibelah.
Pada pengamatan saya mengalami kesalahan. Hal ini didapatkan ketika
pewarnaan yang terlalu lama dan tebal, dan saat di masukkan kembali ke alkohol
seri naik, warnanya tidak juga luntur. Seharusnya pada saat staining atau
pewarnaan haematoksilin itu hanya 30 detik saja. Agar warna yang diserap tidak
terlalu banyak atau tebal. Lalu pada saat pemotongan jaringan terlalu tebal
sehingga nampak saat pengamatan jika sayatan mikrotom saya ini tebal.
Kendala yang kami alami pada saat mengambil pemotongan jaringan
hewan dengan menggunakan metode paraffin ini salah satunya kurangnya
keterampilan pada saat menggunakan mikrotom. Ada beberapajenis alat mikrotom
yang digunakan pada pemotong sediaan antara lain adalah hand mikrotom, rotary
mikrotom, freezing mikrotom, dan sliding mikrotom. Sedangkan yang digunakan
pada saat pemotongan yaitu rotary mikrotom (mikrotom putar) menggunakan
mikrotom ini sangat gampang, dengan mengatur ketebalan dan perbesaran pada
mikrotom dan mengatur mata pisau yang digunakan, sehinnga didapatkan
pemotongan yang tebal dan ada juga yang terlalu tipis, menyebabkan irisan
sediaan mudah hancur pada saat diletakkan di gelas objek.
Beberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain; pita
tidak terbentuk, hal ini kemungkinan karena pisau yang tumpul; pita melengkung
atau bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata sayatan
tertekan, mengerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau
yangterlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin; sayatan remuk
dan cenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi
danclering yang tidak sempurna, pita belah, sayatan terangkat dari pisau saat blok
parafin naik; dan permukaan sayatan yang bergelombang.
Saat pengamatan menggunakan mikroskop dapat dilihat bagian bagian dari
nipple membujur, dapat dilihat histologinya walaupun pewarnaan agak tebal.
Namun, pada akhirnya kami berhasil membuat sebuah preparat jaringan nipple
membujur kambing walaupun dengan hasil yang kurang baik, tapi kami merasa
senang dengan apa yang telah kami lakukan walaupun hanya mengerjakan dengan
pengalaman tapi kami mendapatkan ilmu yang sangat banyak pada saat
mempelajari mikroteknik ini.
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Metode paraffin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan
menggunakan paraffin sebagai media embedding dengan tebal irisan
kurang lebih mencapai 6 µm-8 µm.
2. Tahap-tahap pembuatan preparat dengan metode paraffin yaitu :
a. Pengambilan jaringan
b. Fiksasi
c. Dehidrasi
d. Penjernihan (clearing)
e. Infiltrasi
f. Penanaman (embedding)
g. Penyayatan
h. Penempelan sayatan
i. Pewarnaan
j. Mounting
3. Proses fiksasi merupakan tahap yang penting, larutan fiksasi yang
digunakn yaitu bouine. Setiap tahap dalam metode ini memiliki fungsinya
masing-masing sehingga pada akhirnya dihasilkan preparat awetan yang
baik untuk diamati dan dipelajari.
B. Saran
1. Diperlukan kelengkapan alat dan bahan yang akan digunakan dalam pratikum
mikroteknik ini
Dasumiati. 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fakultas Sains dan
Teknologi UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah
Press.
Lerias, Joana R., dkk. 2014. The Mammary Gland In Small Ruminants: Major
Morphological and Functional Events Underlying Milk Production – A
Review. Journal of Dairy Research.1 (15)
Fixtation (Fiksasi)
Dehidration (Dehidrasi)
Clearing (penjernihan)
Embeding (Penanaman)
Bloking (Pemasangan ke Blok Kayu)