Penuntun Praktikum

Mikrobiologi Nutrisi

Tim Penyusun

Dr. Sri Suharti, S.Pt, M.Si

Dr. Ir. Suryahadi, DEA
Prof. Dr. Ir. Komang G. Wiryawan
Dr. Dwierra Evvyernie A., MS.M.Sc
Adriani, S.Si
Afdola R. Nasution, S.Pt
Ima Imaniati, S.Pt
Tim Asisten Praktikum 2022

Departemen Ilmu Nutrisi & Teknologi Pakan

Fakultas Peternakan
Institut Pertanian Bogor
2022
 KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum wr. wb.

Alhamdulillahirrobil’alamin, segala puji dipanjatkan kepada Allah swt atas

perkenan-Nya jua Penuntun Praktikum Biokimia Nutrisi ini dapat diselesaikan.
Penuntun Praktikum Mikrobiologi digunakan sebagai petunjuk pelaksanaan
praktikum bagi mata kuliah Mikrobiologi Nutrisi yang diajarkan untuk mahasiswa S1
dari Departemen Ilmu Nutrisi & Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan – Institut
Pertanian Bogor.
Penuntun praktikum ini akan selalu mengalami perbaikan dan pengayaan materi,
untuk itu kritik dan saran dari berbagai pihak sangat diharapkan. Semoga Penuntun
Praktikum ini dapat bermanfaat, terutama bagi mahasiswa yang mengikuti kuliah ini.

Wassalamu’alaikum wr. wb.

Bogor, Januari 2022

Koordinator

Sri Suharti

2
 DAFTAR ISI

Percobaan Halaman
1 Kontrak praktikum dan pembagian kelompok
2 Pengenalan Alat 4
3 Penggunaan Mikroskop 6
4 Pembuatan Media dan Sterilisasi 10
5 Pewarnaan Gram 17
6 Teknik Counting Protozoa 20
7 Teknik Counting Bakteri Aerob 24
8 Teknik Counting Bakteri Anaerob 28
9 Teknik Isolasi Bakteri 32
10 Teknik Counting Kapang Anaerob 36
11 Teknik Isolasi Kapang 39
12 Uji Antibakteri : Metode Zona Bening 42
Daftar Pustaka 45

3
Percobaan 2.
PENGENALAN ALAT LABORATORIUM

Dasar Teori
Pemahaman mahasiswa akan jenis-jenis alat laboratorium dan glassware sangat
penting sebelum memulai kegiatan penelitian atau praktikum. Karena pengetahuan
tentang hal tersebut akan memperlancar kegiatan analisis sesuai dengan Prosedur
Operasioan Baku (POB).

Tujuan
Memperkenalkan kepada mahasiswa jenis-jenis alat laboratorium dan
gkasssware beserta fungsi dan cara pengoperasiannya.

Metode
1. Praktikan diperkenalkan jenis-jenis alat laboratorium dan glassware satu persatu
2. Pranata laboratorium/asisten praktikum menjelaskan fungsi dan pengoperasian
alat/glassware tersebut.

4
Hasil Praktikum

Gambarlah alat – alat laboratorium yang sudah diamati

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

5
Percobaan 3.
PENGGUNAAN MIKROSKOP

Dasar Teori

Mikroskop merupakan alat yang sering dipakai dalam lab mikrobiologi untuk
melihat mikroorganisme yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Mikroskop
terdiri atas 2 jenis mikroskop, yaitu mikroskop dengan menggunakan sumber cahaya
dan mikroskop yang menggunakan sumber electron. Mikroskop cahaya menggunakan
system lensa dan sinar dengan panjang gelombang tertentu (mikroskop medan terang,
mikroskop medan gelap, mikroskop kontras fase, dan mikroskop fluoresen). Mikroskop
electron terdiri atas mikroskop electron transmisi dan mikroskop electron skanning
(pemindai).

Mikroskop medan terang merupakan mikroskop yang paling sering digunakan

di lab dengan prinsip latar belakang lapangan penglihatan terlihat terang,
mikroorganisme terlihat gelap karena menyerap cahaya, daya serap cahaya oleh
mikroorganisme meningkat dengan pewarnaan dan akan terdapat perbedaan yang
kontras dengan lingkungan, pembesaran yang dapat dihasilkan adalah 1000x – 2000x,
pembesaran yang lebih dari 2000x menghsilkan gambar yang buram, lensa objektif
pada mikroskop ini adalah minyak imersi (100x), perbesaran lemah (10x), dan
perbesaran kuat (40x). Factor pembatas pada mikroskop ini adalah sudut antara garis
tengah dan garis cahaya paling luar dan panjang gelombang cahaya yang digunakan
400 nm (biru) – 700 nm (merah).

Mikroskop medan gelap memiliki prinsip latar belakang terlihat gelap karena
adanya kondensor khusus (sebagian besar cahaya tidak masuk ke dalam lensa objektif),
mikroorganisme terlihat terang karena adanya pemantulan cahaya/sinar yang masuk.
Mikroskop ini berfungsi untuk melihat preparat basah dan preparat tetes bergantung.

Mikroskop fluoresen memiliki prinsip penggunaan bahan kimia (fluoresen)

yang dapat menyerap cahaya dan menyebarkan cahaya dengan panjang gelombang
yang lebih panjang. Mikroorganisme ditambah dengan bahan fluoresen diterangi
cahaya biru, maka cahaya biru akan diserap, sehingga cahaya hijau dari fluoresen akan

6
dikeluarkan. Pada mikroskop ini terdapat filter yaitu filter ‘exciter’ (memantulkan
semua cahaya, kecuali cahaya biru) dan filter ‘barrier’ untuk menahan cahaya biru dan
membolehkan cahaya hijau (atau lainnya yang dipantulkan zat warna).

Mikroskop kontras – fase memiliki prinsip penggunaan kondensor dan obyektif

khusus, dapat melihat preparat yang tidak diawarnai berdasarkan reraksi
indeks/ketebalannya., jika terjadi perbedaan tebal struktur sel akan terjadi perubahan
indeks refraksi dan perubahan fase (struktur sel mikroorganisme dapat terlihat jelas).
Mikroskop ini berfungsi untuk melihat preparat hidup.

Mikroskop electron transmisi memiliki prinsip menggunakan berkas electron

dengan panjang gelombang sangat pendek, menggunakan pewarna bahan kimia (asam
fosfotungstat) untuk mendapat gambaran obyek yang lebih jelas, bahan kimia pewarna
tidak dapat ditembus oleh berkas electron, mampu melihat mikroorganisme dengan
ukuran 10 A0 (memerlukan sayatan tipis), daya pisah meningkat 100x, pembesaran
meningkat 400.000x. mikroskop ini berfungsi untuk melihat struktur sel yang sangat
halus (flagella dan virus).

Mikroskop electron skanning memiliki prinsip menggunakan berkas electron

dengan panjang gelombang sangat pendek sehingga meningkatkan daya pisah, terdapat
gerakan cepat dari berkas electron meliputi seluruh permukaan specimen sehingga
terjadi pelepasan electron dari permukaan specimen, pelepasan electron bergantung
ditangkap oleh detector akan dihasilkan gambar berdimensi 3 melalui system
elektronik. Mikroskop electron skanning memiliki daya pisah lebih rendah dan dapat
menghasilkan gambar berdimensi tiga sehingga topografi permukaan terlihat dengan
jelas.

Alat dan Bahan

1. Mikroskop
2. Kaca preparat
3. Cover glass

7
Metode
1. Mikroskop dibawa dengan dua tangan. Tangan kanan memegang lengan mikroskop,
sedangkan tangan kiri memegang bagian bawah (kaki) mikroskop.
2. Mikroskop diletakkan di meja lab.
3. Pahami bagian alat, fungsi, dan cara kerja mikroskop.
4. Sumber cahaya dinyalakan
5. Preparat sediaan diletakkan diatas meja mikroskop
6. Difragma iris dibuka penuh
7. Kondensor dinaikkan sampai sama tinggi dengan meja mikroskop
8. Pengamatan dimulai dengan obyektif kekuatan rendah (10x)
9. Tombol pengatur kasar diputar untuk memposisikan lensa obyektif ± 5-6 mm dari
preparat yang diamati
10. Preparat diperikasa agar terletak langsung dibawah obyektif
11. Posisi preparat diatur agar fokus dengan menjauhkan lensa obyektif dari preparat
(agar lensa tidak tergores) dengan memutar tombol pengatur halus
12. Gunakan lensa obyektif kering tinggi (40-45x) dengan memutar lensa pada posisi
kerja yang baik
13. Amati obyek dan catat hasilnya
14. Gunakan obyektif celup minyak
15. Putar lensa obyektif kering tinggi dari posisi kerja
16. Teteskan minyak imersi pada preparat
17. Putar lensa obyektif (100x)
18. Atur posisi lensa obyektif sampai menyentuh minyak celup
19. Putar tombol pengatur halus untuk mendapatkan gambar yang fokus
20. Amati obyek dan catat hasilnya
21. Setelah selesai digunakan, mikroskop dibersihkan dan diletakkan ditempat semula.

8
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

9
Percobaan 4.
PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

Dasar Teori
Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari tersedianya air. Bahan – bahan
yang terlarut dalam air yang digunakan oleh mikroorganisme untuk membentuk bahan
sel dan memperoleh energy yaitu bahan makanan. Kebutuhan nutrient mikroorganisme
berbeda – beda, tetepai pada dasarnya suatu larutan media sekurang – kurangnya harus
memenuhi syarat – syarat berupa ketersediaan unsur – unsur yang ikut serta pada
pembentukan bahan sel dalam bentuk berbagai senyawa yang dapat diolah misalnya,
kandungan mineral, sumber – sumber karbon dan energy serta bahan lain yang
merupakan unsur essensial.

Media ialah bahan atau campuran nutrisi yang digunakan mikroorganisme

untuk tumbuh dan berkembang biak. Media dibagi menjadi 2 yaitu media cair dan agar.
Media cair (broth) umumnya digunakan untuk pembiakan mikroorganisme dalam
jumlah besar (Enrichment), sedangkan media padat umumnya digunakan untuk
morfologi atau pengamatan koloni dan isolasi bakteri murni.

Keasaman (pH) medium merupakan hal penting bagi pertumbuhan organisme

terutama kerja enzim. Sebagian besar bakteri tumbuh pada pH 7,0 namun untk bakteri
yang bersifat pathogen biasanya menghendaki pH yang lebih alkalin yaitu 7,3.
Konsistensi medium dapat dibuat dalam berbagai macam bentuk bergantung pada
keperluannya misalnya untuk medium cair digunakan untuk pembiakan organisme
dalam jumlah besar. Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati penampilan
atau morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni. Bahan untuk membuat medium
padat dapat menggunakan agar – agar, gelatin atau silica gel, namun yang paling umum
digunakan adalah agar – agar. Agar – agar menjadi larut atau mencair bila dipanaskan
pada suhu hamper 100oC dan tetap berbentuk cair bila didinginan sampai kurang lebih
43oC.

10
Tabel 1. Jumlah medium dan wadah yang digunakan
Medium jumlah Wadah untuk sterilisasi
Agar miring 4 ml Tabung biakan
Cawan tusuk 6 ml Tabung biakan
Cawan tuang 12 Tabung biakan
(agar cawan) 100-200 ml Erlenmeyer
(8-16)
Kaldu 5-10 ml Tabung biakan
Kaldu dengan tabung fermentasi 5-7 ml Tabung biakan

Media dapat dibuta sendiri dengan beberapa komponen atau dapat dibeli
dipasaran, contoh media padat yang dapat dibuat sendiri adalah extrac toge.

Media anaerob digunakan untuk bakteri yang tidak dapat hidup jika ada oksigen,
sehingga dalam pembuatannya memerlukan aliran gas CO2 atau dapat memenfaatkan
CO2. Menurut Schlegel (1994), media anaerob menggunakan larutan biak yang sudah
dimasak dan dihilangkan udaranya, bejana tertutup tanpa gelembung udara dan bebas
O2. Media anaerob digunakan untuk bakteri total, bakteri selulolitik, bakteri amilolitik,
dan bakteri proteolitik. Contoh media tersebut adalah BHI (Brain Heart Infusion) yang
digunakan untuk bakteri total.

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua

mikroorganisme yang terdapat padala alat atau didalam suatu benda. Ada tiga cara
utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan
kimia, penyaringan filtrasi. Sterlilsasi panas terdiri atas sterilisasi panas lembab atau
strelilasi basah alat yang digunakan adalah autoclave dengan suhu 121oC dan sterililasi
panas kering (oven 160oC – 170oC). Contoh sterilisasi dengan penggunaan bahan kimia
adalah dengan menggunakan gas etilena oksida, formaldehyde atau glutaraldehyd
alkalin. Sterilisasi penyaringan filtrasi menggunakan penyaring yang pori – pori sangat
kecil sehingga bakteri tertahan dipermukaan penyaring tersebut, sedangkan filtratnya
ditampung dalam wadah steril.

11
Alat dan Bahan
1. Panci
2. Kompor
3. Kain kasa
4. Kapas
5. Aluminium foil
6. Plastik tahan panas
7. Tabung erlenmeyer
8. Tabung hungate
9. Autoclave
10. Bulb
11. Pipet mohr
12. Gas CO2
13. Aquadest
14. Kentang
15. Bacto agar
16. Glucose
17. Pati
18. BHI
19. CMC
20. Resazurin
21. Hemin
22. Cystein
23. Na2CO3
24. Cystein CO3
25. Larutan mineral I
26. Larutan mineral II
27. Gliserol

12
Metode
Pembuatan media aerob
1. Kupas kentang terlebih dahulu, kemudian kentang dicuci sampai bersih lalu
dipotong dadu.
2. Timbang kentang yang sudah dipotong sebanyak 300 gram
3. Rebus kentang dalam 1 liter air steril selama kurang lebih 1 jam atau sampai kentang
lunak, pastikan volumenya tidak berkurang
4. Saring ekstrak kentang dengan kain kasa, dan ambil supernatannya sedangkan
ampasnya dibuang
5. Ambil ekstrak kentang sesuai kebutuhan
6. Tambahkan bacto agar sebanyak 2% dari volume yang akan dibuat
7. Letakkan dalam panci berisi air yang dipanaskan dalam kompor (untuk melarutkan)
sambil diaduk hingga warna homogen
8. Angkat dari kompor (sesuai kebutuhan dan isi ½ dari kapasitas alat agar tidak meluap
ketika autoclave)
9. Tutup dengan kapas dan aluminium foil
10. Masukkan dalam plastik tahan panas
11. Sterilisasi 121℃ selama 15 menit
12. Setelah selesai, keluarkan media dari autoclave
13. Bila tidak segera digunakan, simpan media dalam lemari es

Pembuatan media bakteri anarob untuk total bakteri

1. Timbang glukosa 0.05 gram

2. Timbang pati 0.05 gram
3. Timbang BHI 3.7 gram
4. Semua bahan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer, larutkan dengan aquadest
hingga 50 ml dan aduk hingga merata
5. Tambahkan CMC 0.5 ml
6. Tambahkan indikator resazurin 0.1% sebanyak 0.05 ml
7. Tambahkan larutan hemin 0.05% sebagai vitamin sebanyak 0.5 ml
8. Tambahkan aquadest hingga volumenya mencapai 100 ml, aduk hingga larut

13
 9. Panaskan dalam kompor hingga terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning
bening
10. Angkat media tersebut lalu aliri dengan gas CO2
11. Masukkan cystein 0.1 ml dan masih dialiri gas
12. Siapkan beberapa tabung hungate yang masing-masing berisi bacto agar 0.9 gram
13. Masukkan masing-masing 5 ml media ke dalam tabung hungate sambil dialiri gas
CO2
14. Tutup dengan sumbat dan diisolasi
15. Masukkan dalam plastik tahan panas
14. Sterilisasi pada suhu 121℃ selama 15 menit

Metode Pembuatan media pengencer :

1. Timbang Na2CO3 0.3 ml
2. Timbang cystein CO3 0.1 ml
3. Masukkan dalam tabung erlenmeyer
4. Tambahkan larutan mineral I dan larutan mineral II , masing-masing 7.5 ml
5. Tambahkan aquadest hingga volumenya mencapai 100 ml, aduk hingga larut
6. Aliri dengan gas CO2 sampai bening
7. Siapkan beberapa tabung hungate
8. Masukkan gliserol 0.2 ml (ditambahkan jika media tidak langsung digunakan)
9. Masukkan media ke dalam tabung hungate sebanyak 4.75 ml (jika terdapat gliserol)
10. Apabila tanpa gliserol, media diambil dan dimasukkan dalam tabung hungate
sebanyak 4.5 ml (langsung digunakan)
11. Tutup dengan sumbat dan diisolasi
12. Masukkan dalam plastik tahan panas
15. Sterilisasi pada suhu 121℃ selama 15 menit

Metode Sterilisasi (autoclave)

1. Pertama periksa autoclave (kkondisi air bagian dalam dan luar dirigen)
2. Setelah itu alat-alat yang akan di sterilisasi disiapkan dengan cara membungkusnya
dengan kertas dan plastik tahan panas atau alumunium foil
3. Alat -alat yang akan di sterilkan dimasukan kedalam autoclave, lid/tutup kemudian
dikunci dengan memutar kran sampai terasa terkunci
4. Kemudian, memastikan semua saluran tertutup (exhause terkunci)
14
5. Lalu, set temperature/suhu yang diinginkan (110oC, 115oC, 121oC)
6. Autoclave kemudian dihubungkan dengan listrik
7. Putar tombol timer untuk menentukan waktu yang diinginkan (standar yang sering
digunakan internasional selama 15 menit (jika sudah dipanaskan) pada suhu 121o C)
8. Alarm akan berbunyi jika ssterilisasi sudah selesai
9. Setelah itu, tombol alarm dimatikan dengan cara menekan kearah 0 tombol timer
10. Autoclave dibuka kembali perlahan dengan posisi tangan dibelakang pintu
11. Terakhir, autoclave ditutup kembali

15
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

16
Percobaan 5.
PEWARNAAN GRAM

Dasar Teori
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Tujuan pewarnaan gram adalah untuk
memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk
melihat sruktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan
sifat – sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan
kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua
yaitu gram positif dan gram negatif.

Teknik pewarnaan gram yaitu bakteri diwarnai dengan suatu zat warna Kristal
violet dan yodium, dibilas dengan alcohol kemudian diwarnai lagi dengan zat warna
safranin. Ketika diwarnai dengan Kristal violet bakteri gram positif yang memiliki
peptidoglikan lebih bamyak maka akan menyerap zat warna Kristal violet (biru)
tersebut sedangkan bakteri gram negative karena memiliki peptidoglikan lebih sedikit
dan memiliki lipolisakarida pada sel membrannya maka akan mudah terbilas oleh
alcohol menjadi tidak berwarna kembali dan ketika diwarnai dengan safranin akan
menyerap warna merah dari safranin.

Alat dan Bahan

1. Kultur bakteri umur 24 jam
2. Kristal violet (pewarna primer)
3. Kaca objek
4. Mikroskop
5. Minyak imersi
6. Lampu spirtus
7. Spidol permanen
8. Tisu
9. Ose/spoit
17
 10. Syringe
11. Aquadest
12. Alcohol 70%

Metode
1. Gelas / kaca objek dibersihkan menggunakan tisu dan alcohol 70 %
2. Kemudian difiksasi diatas pemanas api spirtus sampai kering
3. lalu , pada kaca objek dibuat lingkaran dengan menggunakan spidol pada
permukaan bagian bawah kaca objek
4. Kultur bakteri yang akan dianalisa diambil menggunakan ose/spoit sebanyak satu
tetes, kemudian oleskan ditenagh tanda lingkaran yang sudah dibuat di kaca objek
5. Kaca objek yang sudah ditetesi difiksasi diatas pembakar spirtus dengan gerakan
memutar sampai kering tetapi jangan sampai hangus
6. Setelah itu, larutan zat pewarna kristal violet diteteskan diatas kultur yang sudah
difiksasi dan dibiarkan selama 1 menit
7. Bilas dengan aquadest sampai air bilasan tidak berwarna biru lagi (ketika
membilas dengan aquadet, aliran air jangan langsung mengenai preparat, karena
mungkin bakteri akan ikut terbilas)
8. Kemudian, larutan I2 dalam KI diteteskan ke atas preparat sampai tereendam dan
biarkan selama 2 menit
9. Bilas dengan larutan alcohol sampai air bilasan tidak berwarna biru, dan bilas
kembali dengan aquadest untuk membersihkan sisa-sisa alcohol
10. Teteskan kembali preparat dengan zat pewarna safranin selama 30 detik
11. Bilas kembali dengan larutan aquadest sampai bilasan air tidak berwarna merah,
lap sisa cairan dengan tisu jangan sampai preparat ikut terhapus
12. Setelah itu, tetesi preparat dengan minyak imersi sebanyak 1 tetes
13. Kemudian, lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan lensa objektif
perbesaran 100x dan lensa okuler perbesaran 10 x
14. Gambar dan amati bentuk dan warna yang dihasilkan
15. Mikroskop dibersihkan menggunakan tisu, serta alat-alat yang digunakan
dirapihkan dan dibersihkan kembali

18
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

19
Percobaan 6.
TEKNIK COUNTING PROTOZOA

Dasar Teori
Protozoa ditemukan didalam dalam rumen domba dan sapi yang memakan
ransum berserat kasar tinggi (gula-gula terlarut rendah), namun dengan populasiyang
sangat sedikit (kurang dari 100.000 per ml). Namun, sebaiknya pada rumen ternak yang
mengkonsumsi ransum kaya akan pati-patian atau gula-gula mudah larut, populasi
tersebu meningat dan dapat mencapai 4.000.000 per ml cairan rumen. Ransum juga
menentukan proporsi spesies protozoa rumen. Teknik counting protozoa perlu
dilakukan untuk mengetahui populasi protozoa dalam rumen. Protozoa ditemukan
didalam dalam rumen domba dan sapi yang memakan ransum berserat kasar tinggi
(gula-gula terlarut rendah), namun dengan populasi yang sangat sedikit (< 100.000 per
ml). Ransum yang diberikan pada ternak dapat berpengaruh pada proporsi protozoa
dalam rumen. Populasi protozoa dapat meningkat sampai 4.000.000 per ml saat ternak
mengonsumsi ransum kaya akan pati-patian atau gula mudah larut.
Dalam kaitannya dengan penelitian atau percobaan-percobaan nutrisi
ruminansia, protozoa tersebut sering dikelompokan sebgai berikut :
a) Entodiniomorphis, terdiri sebagian besar dari Entodinia sp.
b) Holotrioha, terutama terdiri dari : Isotricha atau Dasytricha.
Entodinis sp. banyak ditemukan pada rumen hewan yang di beri pakan pati (starch) dan
atau ransum berserat kasar, sedangkan Holotricha banyak ditemukan pada rumen
hewaan yang diberi pakan rumpt segar dipadang penggembalaan.
Effisiensi pertumbuhan mikroba rumen lebih rendah bila didalam rumen
terdapat protozoa serta lebih banyak protein murni yang masuk ke dalam usus pada
hewan yang mengalami defaunasi. Beberapa protozoa bersifat selulolitik, namun
sebagian besar protozoa memaanfaatkan gula atau pati sebagai substrat yang dengan
mudah dimanfaatkannya dan disimpan dalam tubuhnya sebagai polidextran.
Polidextran ini akan dirombaknya untuk memenuhi kebutuhan energy protozoa
tersebut, baik untuk prtumbuhan maupun maintenance. Sesuai dengan hal ini, maka
protozoa mampu mempertahankan (buffer) pH rumen. Apabila populasi protozoa
tinggi, maka biomassa mikroba rumen terdiri dari 70% protozoa dan 30% bakteri dalam
cairan rumen.

20
Alat dan Bahan
1. Counting chamber
2. Mikroskop
3. Cairan rumen
4. Larutan TBFS (Trypan Blue Formaline Salin)
5. Syringe
6. Labu erlenmeyer

Metode
A. Pemisahan Protozoa dengan Isi Rumen Lainnya
1. Cairan rumen disentrifugasi 150x g selama 5 menit, hampir seluruh
supernatant diambil (dibuang)
2. Sebanyak 10 ml presipitan ditambahkan 40 ml larutan sukrosa 30% (w/v) ke
dalam tabung sentrifuse 50 ml.
3. Sentrifuse 50xg selama 3 menit.
4. Supernatan diambil (dibuang)
5. Cuci presipitan yang diperoleh dengan menambahkan larutan NaCl 0.9%
kemudian sentrifugasi. Lakukan percobaan sebanyak 3 kali.

B. Membedakan Protozoa hidup dan mati

1. Campurkan contoh yang berisikan protozoa dengan larutan TBFS tersebut
dengan perbandingan 1 : 5 sampai 10.
2. Lakukan Pengamatan dibawah mikroskop.
Protozoa hidup : hanya inti (nucleus) saja yang terwarnai (berwarna biru),
sedangkan bagian isinya hampir atau tidak terwarnai.
Protozoa mati : Seluruh tubuh dari protozoa tersebut terwarnai (biru gelap)

C. Perhitungan Jumlah Protozoa Rumen

1. Cairan rumen sebanyak 1 ml dimasukan kedalam botol film kemudian

ditambahkan dengan larutan TBFS (trypan blue formaline salin) 1 ml.
(perbandingan cairan rumen dan TBFS adalah 1:1)
2. Larutan tersebut diteteskan kedalam counting chamber dan diamati serta
dihitung di bawah mikroskop.

21
Rumus Perhitungan Populasi Protozoa:

𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒍
𝑷𝒐𝒑𝒖𝒍𝒂𝒔𝒊 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒐𝒛𝒐𝒂 =
𝟏
𝟎. 𝟐 × 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟓 × × 𝟏𝟎−𝟑 × 𝟏𝟎−𝟏 × 𝟏𝟔 × 𝟏𝟔
𝟐
𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒍 × 𝟐 × 𝟏𝟎. 𝟎𝟎𝟎
=
𝟎. 𝟐 × 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟓 × 𝟏𝟔 × 𝟏𝟔

Keterangan:
0.2 x 0.0625 : L x t (luas chamber terletak dalam counting chamber)
1
: FP (1 ml sampel dan 1 ml TBFS)
2
10−3 : Dari mm ke ml
10−1 : Sampel yang dimasukan kedalam chamber
16 × 16 : Jumlah kotak besar dan kotak

Hasil Praktikum

22
Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

23
Percobaan 7.
TEKNIK COUNTING BAKTERI AEROB

Dasar Teori
Teknik perhitungan bakteri aerob dapat dilkaukan dengan menggunakan media
cair dan media agar. Metode dengan menggunakan media agar biasanya menggunakan
metode hitung cawan yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel dapat hidup dan
berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan
suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung didalam sampel.
Teknik yang harus dikuasai dalam metode ini adalah mengencerkan sampel dan
dilakukan pengembangbiakan sampl dengan menggunakan metode cawan dan
diinkubasi.
Metode perhitungan bakteri aerob dengan media cair (Optical Density)
dilakukan untuk mengetahui kosentrasi sel sejumlah besar biakan. Data yang diperoleh
dari pengukuran ini dapat dinyatakan sebagai konsentrasi organisme, namun
memerlukan kurva standar yang menyatakan korelasi anatara kekeruhan biakan dengan
jumlah organisme per ml biakan. Metode ini menggunakan spektrofotometer, dimana
cahaya yang mengenai sel – sel mikroorganisme di dalam ssampel suspense akan
dihamburkan, sedangkan cahaya yang lolos (diteruskan) setelah melewati sampel.
Makin sedikit jumlah sel didalam suspensi, makin besar intensitas cahaya yang lolos
dan semakin tinggi pula persen transmitan yang tercatat.

Alat dan Bahan

1. Tabung 5 buah
2. Media EMBA
3. Spoit 1 ml
4. Pipet Mohr
5. Cawan Petri 5 buah
6. Water Bath
7. Alkohol
8. Lampu SPirtus
9. Bakteri Asam Laktat

24
Metode
Metode cawan tuang
1. Bersihkan meja kerja dengan alcohol 70%
2. Siapkan 5 buah tabung pengencer disusun dan beri kode 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5
3. Basahi tangan dengan alcohol 70% (lakukan setiap anda mengambil sampel
baru atau setiap pengenceran)
4. Kocoklah suspense bakteri asam laktat sampai kekeruhannya merata
5. Ambil sampel secara asptic (lakukan dekat lampu spirtus) sebanyak 1 ml dengan
menggunakan pipet atau spoit dan masukkan kedalam tabung pengencer 10-1,
(letakkan spoit atau pipet dalam wadah yang telah disediakan), kocok sampai
rata dengan cara bolak balik (min 20 kali) atau dapat juga menggunakan vortex
6. Secara aseptic pipetlah 1 ml sampel dari tabung pengencer 10-2 dengan
menggunakan spoit atau pipet yang steril dan masukkan kedalam tabung
pengencer 10-3 kocok sampai merata
7. Lakukan hal yang sama untuk mendapatkan pengenceran 10-4 dan 10-5
8. Siapkan 5 buah cawan petri kosong yang syudah steril dan beri kode pada
permukaan cawan yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
9. dengan menggunakan spoit atau pipet setril pindahkan cairan sampel sebnayak
0,1 ml dari tabung pengencer 10-5 kedalam cawan petri koson yang berkode 10-
5
(lakukan didekat lampu spirtus)
10. lakukan untuk cawan – cawan petri lainnya
11. setiap tabung yang berisi media agar EMBA cair letakkan diatas water bath suhu
50oC (bila masih padat dipanaskan diatas kompor sampai cair, kemudian
letkkan dodalam penangas air suhu 50oC)
12. Ambil 1 tabung media tersebut kedalam cawan lakukan dekat lampu spirtus
sampai permukaan bagian dalam petri tertutupi oleh media. Putar – putar cawan
petri diatas meja anda perlahan – lahan sebanyak 20 kali sehingga tercampur
merata
13. Lkaukan hal yang sama untuk cawan – cawan petri lainnya
14. Biarkan agar dalam cawan petri itu memadat setelah dingin cawan petri tadi
dibalikan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC

25
15. Pilihlah cawan yang jumlah koloninya antara 30 sampai 300
16. Rumus perhitungan koloni/ml sampel :
𝐴
𝐹𝑝 𝑥 0,1

Keterngan
A = jumlah koloni terhitung
FP = Faktor pengenceran yang terdapat pada cawan koloni A
0,1 = ml sampel yang dimasukkan kedalam cawan

26
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

27
Percobaan 8.
TEKNIK COUNTING BAKTERI ANAEROB

Dasar Teori
Berdasarkan bentuk morfologinya maka bakteri dapat dibedakan atas tiga
golongan, yaitu golongan basil, kokus dan spiril. Basil (dari basillus) adalah bakteri
berbentuk tongkat pendek dan silindris. Sebagian besar bakteri adalah basil. Kokus (dari
coccus) adalah bakteri berbentuk serupa bola kecil-kecil. Bakteri ini tidak banyak
seperti basil. Spiril (dari spirillum) adalah bakteri berbentuk bengkok atau berbengkok-
bengkok serupa spiral. Bakteri ini tidak banyak terdapat, dan merupakan golongan yang
paling kecil jika dibandingkan dengan basil maupun kokus.
Bakteri merupakan biomassa mikroba rumen yang terbanyak. Berdasarkan
sebarannya dalam rumen, bakteri ini dapat dibedakan sebagai berikut :
a. Bakteri bebas yang terdapat dalam cairan rumen. Populasinya mencapai 30%
dari total bakteri rumen.
b. Bakteri yang melekat pada partikel makanan yang jumlahnya paling tinggi
yaitu dapat mencapai 70% dari total bakteri.
c. Bakteri yang menempel pada dinding rumen.
d. Bakteri yang menempel pada protozoa. Bakteri ini umumnya bakteri
membentuk methan (methanogenesis).
Perkembangan ilmuwan atau ahli bakteriologi cenderung mengembangkan
teknik untuk mengkultur dan mengisolasi mikroba rumen dalam kondisi terkontrol di
laboratorium. Teknik kultur baik dalam preparasi media, inokulasi serta transfer bakteri
diuraikan secara rinci oleh Hungate (1966). Pencegahan kontaminasi merupakan suatu
problem dalam teknik tersebut, namun permasalahan yang paling besar adalah untuk
mempertahankan kondisi anaerobik yang cukup untuk mendukung pertumbuahan
bakteri. Namun demikian, percobaan dengan kultur bersama (mixed culture)
memperlihatkan bahwa kondisi yang sangat anaerobik bukanlah suatu faktor yag sangat
menentukan.

28
 Banyaknya bakteri dalam rumen dapat diduga dengan mempergunakan beberapa
metode. Carayang paling umum digunakan oleh para ahli bakteriologi adalah :
a. Perhitungan Langsung
Merupakan metode untuk menghitung jumlah bakteri rumen yang hidup maupun
yang mati, dengan cara melakukan pengenceran isi rumen terlebih dahulu yang
kemudian akan dilarutkan dengan formalin dan diwarnai sehingga mudah terlihat.
Perhitunga dapat dilakukan dengan ruang hitung (Counting Chamber) atau
disebarkan dalam suatu gelas objek yang bersih, dikeringkan, difiksasi, dan
diwarnai.
b. Teknik Turbidimetri
Teknik perhitungan bakteri dengan menggunakan Kolorimeter atau
Spektrofotometer, yang menduga jumlah mikroba dari suatu suspensi. Panjang
gelombang yang digunakan adalah 600 nm, diperoleh bahwa 0.3 rapat optis
(Optical density) akan setara dengan 1.000.000 sel/ml.
c. Hitungan koloni
Hitungan koloni dapat diperoleh setelah melakukan pengenceran yang tepat
terhadap isi rumen dan menginokulasi contoh yang belum diketahui populasi
bakterinya ke dalam suatu media kultur yang umumnya dalam tabung reaksi.
Setelah beberapa lama diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 39oC, kemudian
penghitungan koloni dilakukan. Umumnya perhitungan koloni hanya menghitung
10-30% total bakteri yang diperoleh melalui perhitungan mikroskopis langsung.

Alat dan Bahan

1. Hungate tube
2. Syiringe
3. Inkubator
4. Isolasi
5. Tabung gas CO2
6. Termos
7. Roler tube
8. Water bath
9. Gas CO2
10. Rumen
11. Media BHI
29
Metode
1. Alat dan bahan yang sudah disterilkan dalam autoclave dikeluarkan
2. Media yang sudah dibuat pada tabung hungate sebelumnya dicairkan dalam waterbath
3. Cairan rumen yang sudah diambil langsung dari sapi fistula diletakkan didalam termos
dan dialiri dengan gas CO2
4. Cairan rumen kemudian ditambahkan sebanyak 0.5ml kedalam hungate tube 1 yang
sudah berisi media
5. Dari hungate tube 1 diambil lagi dengan syiringe sebanyak 0.05 ml dan dipindahkan
pada hungate tube 2
6. Hal tersebut dilakukan sampai hungate tube ke-5
7. Seluruh hungate tube dilapisi dengan solasi agar tidak ada udara yang masuk ataupun
keluar
8. Setelah itu hungate tube diletakkan pada roller tube agar media memadat dan koloni
bakteri menyebar pada seluruh tabung
9. Media yang sudah padat kemudian diinkubasi pada inkubator selama 1-3 hari
10. Setelah 3 hari koloni bakteri dihitung

30
 Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

31
Percobaan 9.
TEKNIK ISOLASI BAKTERI (BAKTERI ASAM LAKTAT/BAL)

Dasar Teori
Bakteri Asam laktat (BAL) yaitu kelompok bakteri gram positif, katalase negatif
yang dapat memproduksi asam laktat dengan cara memfermentasi karbohidrat, selnya
berbentuk kokus, tersusun berpasangan atau berbentuk rantai, tidak bergerak, tidak
berspora, anaerob fakultatif, bersifat non motil dan mesofil. Bakteri Asam Laktat (BAL)
merupakan bakteri anaerob fakultatif yang mampu hidup pada berbagai habitat yang
cukup luas di alam seperti pada tanaman, saluran pencernaan hewan dan manusia. BAL
merupakan jenis bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, hidrogenperoksida,
antimikroba, dan hasil metabolisme lain yang memberikan pengaruh positif bagi
produktivitasnya. BAL menghasilkan antibakteri berupa asam organik, bakteriosin,
metabolit primer, hidrogen peroksida, diasetil, karbondioksida, asetaldehid. BAL dapat
menurunkan pH lingkungannya dengan mengeksresikan senyawa yang mampu
menghambat bakteri patogen.

Dalam memisahkan satu populasi mikroba dari populasi campuran maka

diperlukan suatu teknik yang disebut dengan isolasi mikroba. Isolasi mikroba adalah
mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu
medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba
dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba.
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum
untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan
paling utama adalah habitat inang.

Alat dan Bahan

1. Cawan petri (petri dish) kosong dan steril

2. Lampu spirtus
3. Jarum ose
4. Autoclave
5. Labu erlenmeyer
6. Incubator

32
 7. Spidol
8. Cairan rumen (BAL)
9. Alkohol
10. Media Na

Metode

1. Meja yang akan digunakan selama praktikum di semprot menggunakan alcohol 70%
terlebih dahulu, begitupun dengan tangan dan baju lab praktikan
2. Setelah itu, ambil Petridish dan disterilisasikan menggunakan autoclave
3. Media Nutrient Agar (NA) yang sudah dipanaskan, dituangkan ke dalam petridish
yang sudah steril sebanyak 12,5 ml
4. Setelah dingin, bagian belakang petridish di bagi menjadi 4 bagian dengan
menggunakan spidol
5. Selanjutnya jarum ose dipanaskan menggunakan lampu spirtus sampai membara.
Setelah itu, jarum ose didinginkan sebentar ± selama 1 menit di udara
6. Kemudian sampel bakteri yaitu bakteri asam laktat dari cairan rumen diambil dengan
menggunakan jarum ose yang sudah steril
7. Berikutnya, jarum ose yang sudah berisi sampel BAL digoreskan pada permukaan
petridish secara zig-zag, pada luasan atau area 1
8. Setelah itu, jarum ose dipanaskan kembali dan didinginkn di suhu udara selama 1
menit, kemudian sampel BAL diambil dari ujung torehan pertama, dan ditorehkan
pada area 2 secara zig-zag. Cara tersebut diulangi hingga area ke 3 dan yang ke 4
9. Selanjutnya di inkubasi selama 48 jam
Berikut ini contoh gambar petridish yang di bagi menjadi 4 bagian:

1 2

3 4

33
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

34
 Percobaan 10.
TEKNIK COUNTING KAPANG ANAEROB

Dasar Teori

Jamur anaerobik rumen pertama kali ditemukan oleh Orpin (1975). Jamur memiliki

peranan yang sangat besar dalam pencernaan serat kasar. Jamur memiliki kemampuan

dalam mendegradsi selulosa menjadi gula-gula sederhana. Jamur dewasa terdiri dari

sporangium dan rizhoid yang tumbuh pada jaringan dari tanaman yang dilekati. Sporangium

berkembang dibagian luar dari bagian tanaman, dan bila mencapai dewasa panjangnya dapat

mencapai 100 mikron. Zoospora tumbuh di dalam sporangium, dan apabila terjadi

penghancuran dinding sporangium, zoospora akan terbebas dan bergerak dengan flagelanya.

Setiap zoospora mampu mengkolonisasi jaringan tumbuhan dan akan meneruskan siklus

hidupnya. Jamur/ fungi merupakan organisme yang bersifat heterotrop yang mendapatkan

nutrisi dengan cara menyerap zat-zat makanan dari medium disekitarnya. Populasi fungi di

dalam rumen merupakan populasi mikroba terkecil dibandingkan mikroba lainnya yaitu

hanya sekitar 8% dari total biomassa mikroba dalam rumen. Fungi rumen dikelompokkan

ke dalam fungi fakultatif anaerob yang hidup tanpa atau sedikitnya membutuhkan oksigen

dalam rumen. Kemampuan fungi dalam mendegradasi polisakarida pada dinding sel

tanaman lebih baik bila dibandingkan dengan protozoa dan bakteri. Fungi memiliki

pengaruh besar terhadap aktivitas fibrolitik pada rumen.

Populasi jamur akan diperoleh banyak apabila makanan ruminansia tersebut banyak

mengandung serat kasar. Hal ini disebabkan makanan yang berserat tersebut akan tinggal

dalam rumen lebih lama, sehingga jamur akan sempat memperbanyak diri. Berkurangnya

populasi fungi dapat menyebabkan penurunan degradasi serat pakan, akibatnya pakan akan

35
mengalami penurunan proses fermentatif, terutama ketika pakan memilki kualitas yang

kurang baik. Tingginya konsentrasi fungi dalam rumen akan disebarkan ke usus halus

melalui abomasum. Fungi bekerja memisahkan serat kasar pada tanaman menggunakan

rhizoid yang nantinya akan mempermudah mikroba lain untuk mencernanya. Kemampuan

inilah yang dapat memperbaiki hasil fermentasi pada rumen dan selanjutnya akan dicerna

dalam usus untuk diabsorpsi sebagai energi pada tubuh ruminansia.

Alat dan Bahan

1. Gelas
2. Botol film
3. Akuades steril
4. Cawan petri steril
5. Larutan pengencer (akuades steril)
6. Syringe steril
7. Alkohol 70%
8. Lampu spirtus
9. Tissue
10. Label
11. Spidol permanen
12. Tutup karet
13. Rak tabung reaksi
14. Media aerob

Metode

1. Sebanyak 1 gram tempe ditimbang lalu dilarutkan dengan 10 ml akuades steril.

2. Disiapkan 5 tabung reaksi berisi larutan pengecer (akuades steril) masing-masingnya
sebanyak 9 ml. Lalu tukar tutup tabung reaksi dengan sumbat karet yang telah
disterilkan dengan alkohol.
3. Selanjutnya sebanyak 1 ml supernatan tempe dimasukkan ke dalam larutan
pengencer 1, lalu dihomogenkan dengan gerakan angka 8 sebanyak 20 kali.

36
 4. Setelah homogen, sampel kapang dari larutan pengencer 1 diambil sebanyak 1 ml
dan dimasukkan ke dalam tabung pengencer kedua, begitu selanjutnya hingga
tabung pengencer ke-5. Lakukan pekerjaan didekat lampu spirtus serta sterilisasi
tutup karet tabung reaksi dengan tissue yang telah disemprot alkohol.
5. Setelah semua media pengencer diisi, selanjutnya disiapkan 5 cawan petri steril.
6. Masing-masing cawan petri dimasukkan sampel kapang di dalam media pengencer
sebanyak 1 ml.
7. Selanjutnya sampel kapang di dalam cawan petri dicampur dengan media aerob.
8. Media kapang yang telah selesai selanjutnya diinkubasi selama 48 jam.
9. Setelah 48 jam, lakukan counting kapang pada media cawan petri.

Hasil Praktikum

37
Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

38
 Percobaan 11.
TEKNIK ISOLASI KAPANG

Dasar Teori

Kapang merupakan mikroorganisme eukariotik, tidak berklorofil, memiliki hifa,

dinding sel terdiri dari kitin atau selulosa, serta berkembang biak secara seksual dan
aseksual. Kapang pada umumnya hidup secara aerob, tumbuh optimal pada kisaran suhu 25-
30 °C dan dapat tumbuh pada kisaran pH yang cukup luas yaitu 2,0-8,5 meskipun pada
kenyataannya kapang lebih suka pada kondisi asam (Winarno, 1994 dalam Agustin 2016;
Pitt & Hocking, 2009). Spora kapang berukuran kecil dan ringan sehingga dapat terhembus
ke udara dan menyebar kemana-mana.
Tempe mengandung nutrisi yang cukup tinggi, beberapa penelitian menunjukkan
bahwa zat gizi tempe lebih mudah dicerna, diserap, dan dimanfaatkan oleh tubuh
dibandingkan dengan zat gizi kedelai yang dikonsumsi secara langsung (Dwinaningsih
2010). Proses fermentasi tempe mikrobia strain-strain anggota spesies Rhizopus yang
terlibat adalah Rhizopus oligosporus, R. oryzae, R. stolonifer (kapang roti), atau R. arrhizus.
R. oligosporus dan R. oryzae adalah strain anggota spesies Rhizopus yang paling dominan
dan merupakan komponen yang paling penting dalam fermentasi tempe ( Sine & Soetarto,
2018 ), hal ini karena R.oligosporus dan R. oryzae mempunyai karakteristik yang sangat
berperan dalam fermentasi tempe.
Percobaan ini dilakukan untuk mengidentifikasi bentuk koloni kapang Rhizopus
pada tempe kacang kedelai.

Alat dan Bahan

1. Cawan petri steril
2. Ose
3. Lampu spirtus
4. Alkohol
5. Spidol
6. Media PDA
7. Kultur kapang tempe dalam tabung

39
Metode

1. Tuang media agar PDA yang sudah dipanaskan ke cawan petri steril sebanyak 12,5
ml kemudian dinginkan.
2. Setelah dingin, bagian belakang petri dibagi 4 seperti gambar dibawah ini
3. Panaskan ose menggunakan lampu spirtus sampai membara, setelah membara
dinginkan ose selama 1 menit diudara
4. Ambil sampel kapang dalam tabung denganmenggunakan ose tersebut.
5. Kemudian goreskan ose yang berisi sampel kapang ke permukaan petri secara zigzag
pada area 1.
6. Panaskan kembali ose tersebut, kemudian dinginkan diudara 1 menit, kemudian
ambil sampel kapang dari ujung torehan pada area 2 secara zigzag
7. Lakukan hal yang sama untuk area 3 dan 4
8. Inkubasi selama 48 jam

Hasil Praktikum

40
Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

41
Percobaan 12.
UJI ANTIBAKTERI : METODE ZONA BENING

Dasar Teori
Antibakteri adalah senyawa yang digunakan untuk mengendalikan
pertumbuhan bakteri yang bersifat merugikan. Pengendalian pertumbuhan
mikroorganisme bertujuan untuk mencegah penyebaran penyakit dan infeksi,
membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan
serta perusakan bahan oleh mikroorganisme. Mekanisme penghambatan terhadap
pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibakteri dapat berupa perusakan dinding sel
dengan cara menghambat pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai
terbentuk, perubahan permeabilitas membran sitoplasma sehingga menyebabkan
keluarnya bahan makanan dari dalam sel, perubahan molekul protein dan asam nukleat,
penghambatan kerja enzim, dan penghambatan sintesis asam nukleat dan protein.
Uji antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode sumur agar yang
mengacu pada metode Wolf dan Gibson (1996). Mikroba yang mampu menghasilkan
substansi anti mikroba (bakteriosin) akan melakukan penghambatan terhadap bakteri
pathogen yang dibuktikan dengan adanya zona bening disekitar sumur agar. Besarnya
aktivitas antimikroba ditentukan dengan cara mengukur diameter zona bening disekitar
sumur agar.

Alat dan Bahan

1. Mortal alu
2. Spirtus
3. Botol film
4. Cawan petri
5. Timbangan analitik
6. Penggaris
7. Spatula
8. Syiringe
9. Mikropipet 100 milimikron
10. Bawang putih
11. Aquades steril (didinginkan jika masih panas)
12. Tetrasiklin
42
Metode
1. Haluskan bawang putih menggunakan mortar dan alu dekatkan dengan spirtus
2. Timbang bawang putih yang sudah dihaluskan kedalam 3 tempat botol film dengan
perbandingan 10,20,30 gr (jangan lupa ditera)
3. Tetrasiklin dicampurkan dengan air aquadest sebanyak 10 ml
4. Kemudia didiamkan selama 24 jam
5. Bersihkan tempat dengan alkohol 70%
6. Ambil bakteri masukkan kedalam cawan petri steril sebanyak 1 ml menggunakan
spoit
7. Tambahkan NA yang sudah ditambahkan bakto agar, setengah cawan petri
8. Kemudian didinginkan sampai memadat
9. Setelah media memadat buat tanda dibelakang cawan sebanyak 5 tanda untuk
dibuat lubang (control, 10 gr,20 gr,30 gr, tetrasiklin), setelah itu dibuat lubang
sebanyak 5 lubang pada media yang sudah ditandaai
10. Tetesi masing masing larutan sebanyak 1 ml kedalam lubang (kecuali control)
11. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
12. Hitung zona bening disekitar lubang menggunakan penggaris
13. Hasil diameter zona hambat dibandingkan dengan zona hambat tetrasiklin sebagai
control positif.

43
Hasil Praktikum

Bogor, ...............................................................
Asisten Praktikum,

(....................................................................... )

44
 DAFTAR PUSTAKA

Hungate, R. E. 1966. The Rumen Microbial Ecosystem. Elsvier Applied science.

London and New York.

Pratiwi AE. 2015. Isolasi, seleksi dan uji aktivitas antibakteri mikroba endofit dari daun
tanaman Garcinia benthami Pierre terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium
[skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Islam Negeri.

Wolf, C.E. dan Gibbons, W.R. 1996. Improved method for the determination of nisin.
Journal Appl. Bacteriology 80(4): 453-457.

Suhastyo A A, Iswandi Anas, Dwi Andreas Santosa, dan Yulin Lestari. 2013. Studi
Mikrobiologi dan Sifat Kimia Mikroorganisme Lokal (MOL) yang Digunakan
pada Budidaya Padi Metode SRI (System of Rice Intensification). J. Sainteks
10(2): 29-39.

Patra AK. 2006. Effect of plant extracts on in vitro methanogenesis, enzyme activites and
fermentation of feed in rumen liquor of buffallo. Animal Feed Sci and Technol.
128:276-291.

Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Anal Chem. 31(3):367-369.

Mamilianti, W dan Adip Yusron. 2012. Pengaruh MOL (Mikroorganisme Lokal)

Terhadap Penggemukan Sapi Potong sebagai Upaya Peningkatan Pendapatan
Peternak. J. Agromix 3(2): 84-92

45