PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI I

OLEH :
OEMERIA SHITTA SUBADRA, M.Farm., Apt

PRODI DIII FARMASI

POLTEKKES KEMENKES SURAKARTA
2021

i
 HALAMAN PENGESAHAN

Buku petunjuk praktikum Jurusan Jamu Politeknik Kesehatan Surakarta dengan judul
buku petunjuk praktikum:

“MIKROBIOLOGI I”

Telah diperiksa dan telah mendapat pengesahan sebagai buku petunjuk praktikum di
laboratorium Jurusan Jamu.

Klaten, Januari 2021

Ketua Jurusan Jamu

Indarto A.S., S.Pd., M.Kes

NIP. 19601130 198303 1 005

ii
 KATA PENGANTAR

Puji Syukur kami panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
rahmat dan karunia-Nya sehingga penyusunan buku Pedoman Praktikum Mikrobiologi
I ini dapat selesai pada waktunya. Buku pedoman ini disusun untuk memudahkan
mahasiswa dalam pelaksanaan praktikum DIII Farmasi Jurusan Jamu Poltekkes
Kemenkes Surakarta. Buku petunjuk disusun berdasarkan pada materi kuliah dan
mengacu pada buku-buku standar dan sesuai perkembangan ilmu pengetahuan.

Semoga buku ini sangat bermanfaat bagi mahasiswa dalam upaya peningkatan
pengetahuan dan keterampilannya dan selanjutnya dapat meningkatkan pelayanan
kepada masyarakat di bidang kesehatan. Akhirnya kritik dan saran yang membangun
kami harapkan untuk penyempurnaan buku ini.

Klaten, Januari 2021

Penyusun

DAFTAR ISI

iii
 Halaman
Halaman Judul........................................................................................................... i
Halaman Pengesahan ................................................................................................ ii
Kata Pengantar .......................................................................................................... iii
Visi dan Misi ............................................................................................................. iv
Daftar Isi.................................................................................................................... v
Tata Tertib ................................................................................................................. vi
Praktikum I Pengenalan Alat .............................................................................. 1
Praktikum II Sterilisasi......................................................................................... 6
Praktikum III Pembuatan Media Pertumbuhan ..................................................... 13
Praktikum IV Pewarnaan Bakteri .......................................................................... 18
Praktikum V Isolasi Bakteri ................................................................................. 30
Praktikum VI Penentuan Angka Mikroba (ALT) .................................................. 42
Praktikum VII Penentuan Angka Mikroba (AKK) ................................................. 46
Praktikum VIII Penentuan Angka Mikroba (MPN) ................................................. 49
Praktikum IX Uji Sensitivitas Antimikroorganisme (Metode Difusi)................... 53
Praktikum X Uji Sensitivitas Antimikroorganisme (Metode Dilusi) ................... 58
Praktikum XI Uji Potensi Antibiotik ..................................................................... 60
Praktikum XII Uji Koefisien Fenol......................................................................... 62
Praktikum XIII Uji Biokimia ................................................................................... 64
Format Laporan ........................................................................................................ 67

TATA TERTIB MEMASUKI LABORATORIUM

iv
1. Praktikan memasuki laboratorium dengan tenang dan tertib setelah dipanggil
memasuki laboratorium dengan memakai jas praktikum yang dikancingkan secara
rapi.
2. Praktikan membawa peralatan pribadi dan buku standar yang ditentukan oleh
pembimbing praktikum.
3. Sebelum praktek dilakukan, praktikan melakukan cek kelengkapan alat,
melaporkan bila ada pecah/ retak/ kotor.
4. Selama praktikum berlangsung, praktikan diharapkan mengerjakan praktek
dengan tenang tanpa mengganggu praktikan lain.
5. Tidak diperkenankan saling meminjam alat sesama praktikan selama praktikum
berlangsung terutama untuk peralatan pribadi.
6. Selama praktikum berlangsung, mahasiswa membuat laporan sementara yang
harus diacc-kan dosen pembimbing setelah praktikum selesai, format laporan
sementara ditentukan tersendiri.
7. Setelah praktikum selesai, praktikan membersihkan alat praktikum dan
bertanggungjawab atas kebersihan meja dan kelengkapan alat yang telah
digunakan.
8. Sebelum meninggalkan ruangan, praktikan membersihkan laboratorium sesuai
giliran piket.
9. Praktikan membuat laporan resmi praktikum dengan format yang ditentukan
dengan menempelkan laporan sementara yang sudah diacc oleh dosen
pembimbing. Laporan resmi dikumpulkan paling lambat satu minggu setelah
praktikum atau pada hari ketika praktikum berikutnya dimulai.
10. Pretest dan posttest menyesuaikan perencanaan praktikum.

v
 PRAKTIKUM I
PENGENALAN ALAT

I. Tujuan Praktikum
Sesudah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan mengenal dan
mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat.
II. Dasar Teori
1. Mikroskop
Mikroskop merupakan alat yang sangat erat hubungannya dengan
mikrobiologi, hal ini dikarenakan kita harus bekerja dengan mikrobia yang
ukurannya sangat kecil. Mikroskop adalah alat yang sangat peka sehingga harus
digunakan dengan hati-hati. Apabila saudara masih raguh dalam
penggunaannya mintalah pertolongan dengan para asisten saudara. Kebersihan
dari alat ini juga harus dijaga. Setiap praktikan harus membersihkan
mikroskopnya apabila telah selesai menggunakan alat tersebut. Dalam kegiata
ini para praktikan harus membersihkannya dengan menggunakan kertas lensa
yang telah tersedia dan juga minyak emersi. Mikroskop berguna untuk melihat
sel-sel mikroorganisme seperti sel bakteri.
Adapun bagian-bagian dari mikroskop cahaya antara lain adalah:
1. lensa okuler untuk memperbesar bayangan yang terbentuk oleh lensa
objektif,
2. lensa objektif untuk memperbesar specimen,
3. Lensa objektif,
4. Pengatur fokus kasar: skrup untuk menaikkan dan menurunkan mejabenda
5. Pengatur fokus halus: skrup untuk menaikkan dan menurunkan meja benda
secara halus
6. meja benda tempat meletakan spesimen,
7. Sumber cahaya,
8. Kondesor cahaya dan penjepit spesimen

1
 Gambar 1. Mikroskop Cahaya

Cara kerja:
Lensa objektif berfungsi untuk pembentukan bayangan pertama dan
menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat bayangan akhir serta
kemampuan untuk memperbesar objek sehingga dapat memiliki suatu ukuran
daya pisah suatu lensa objektif yang akan menentukan daya pisah spesimen
sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai suatu
dua benda terpisah.
Lensa adalah lensa yang terdapat dibagian ujung atas tabung berdekatan dengn
mata pengamat dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan
oleh lensa objektif sampai 4 hingga 25 kali.
Lensa kondensor merupakan lensa yang berfungsi mendukung terciptanya
pencahayaan pada objek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang
tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal.

2
2. Autoklaf
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan seperti
media yang akan digunakan dalam praktikum mikrobiologi. Alat ini
menggunakan uap air panas bertekanan kira 2 atm(=15 Psi) dengan lama
strerilisasi umumnya 15 menit (Gambar 2).

Gambar 2. Autoklaf
3. Inkubator
Inkubator merupakan alat untuk menginkubasikan mikrobia pada suhu yang
telah ditentukan (Gambar 3a).
4. Colony counter
Adalah alat yang berguna untuk menghitung koloni tang tumbuh dalam cawan
petri (Gambar 3b)

Gambar 3a. Inkubator, 3b. Colony counter

3
5. Laminar air flow
Laminar air flow untuk pengerjaan sacara aseptis karena
mempunyai pola pengaturan dan penyaringan aliran
udara sehingga aseptis dan aplikasi sinar UV beberapa
jam sebelum digunakan.
Gambar 4. Laminar air flow
6. Hot plate stirrer dan Stirrer bar
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)
berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan
pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini
dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses
homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang
magnet.
Gambar 5. Hot plate stirrer
dan Stirrer bar
7. Mikro pipet dan Tip
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup
kecil, biasanya kurang dari 1000 μL. Banyak pilihan kapasitas dalam
mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya
(adjustable volume pipette) antara 1-20 μL, atau mikropipet yang tidak bias
diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette)
misalnya mikropipet 5μL. Dalam penggunannya, mikropipet memerlukan tip.

Gambar 6. Mikropipet dan Tip

4
III. Alat dan Bahan
A. Alat elektrik 4. Tabung reaksi
1. Mikroskop 5. tabung durham
2. Autoklaf 6. Labu Erlenmeyer
3. Incubator 7. Glass beads
4. Lemari pendingin 8. Mortar dan stamper
5. Colony counter 9. Beaker glass
B. Alat keramik 10. Buncen burner
1. Cawan porselin 11. Gelas ukur
2. Cawam krusible 12. Batang L / drugalsky
3. Corong Buchner D. Alat non gelas
4. Plat tetes 1. Jarum inokulum
5. Mortar dan stemper 2. Pinset
C. Alat gelas 3. Rubber bulb
1. Cawan petri 4. pH meter
2. Pipet ukur 5. mikropipet dan tip
3. Pipet tetes

IV. Diskusi
Gambarkan alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, tunjukkan bagian-
bagiannya serta fungsinya. Kerjakan di buku gambar.

5
 PRAKTIKUM II
STERILISASI

I. Tujuan
Mahasiswa mengerti dan memahami cara sterilisasi dengan baik.
II. Dasar Teori
Sterilisasi adalah suatu proses pembebasan suatu bahan atau alat dari semua
bentuk organisme hidup.
Macam-macam Stresilisasi:
Sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu:
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang
berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba
tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan
yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotic.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran
a. Pemanasan
• Pemijaran(dengan api langsung) : membakar alat pada api secara
langsung, contoh alat: jarum inoculum, pinset, batang L, dll.
• Panas kering : sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180 C.
Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca
misalnya Erlenmeyer, tabung reaksi dll.
• Uap air panas : konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak
terjadi dehidrasi.
• Uap air bertekanan : menggunakan autoklaf.

6
 b. Penyinaran dengan UV
Sinar UV juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety
Cabinet dengan disinari lampu UV.
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan
antara lain alcohol.

III. Alat dan Bahan

A. Alat
1. Labu Erlenmeyer
2. Batang Pengaduk
3. Gelas ukur
4. Cawan petri
5. Tabung reaksi
6. Pembakar Bunsen
7. Timbangan analitik
8. Pipet volume
9. Autoklaf
10. Pembakar spitus
B. Bahan
1. Kasa
2. Kapas
3. Kertas payung
4. Aquades
5. Alkohol
6. Spiritus

7
IV. Prosedur Kerja
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan
Teknik aseptis :
1. Desinfeksi meja kerja

8
2. Memindahkan biakan secara aseptis

9
3. Memindahkan Biakan dari Cawan

10
4. Memindahkan Cairan dengan Pipet

11
5. Menuang Media

Catatan Kerja Aseptis:

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung / cawan /
Erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan
kontaminan masuk) dibakar / dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset / batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol 70% terlebih dahulu
lalu dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu
atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat
transfer panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke
bagian api.

12
 5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu menggunakan pembakar Bunsen,
tetapi jika di luar safety cabinet maka semakin banyak sumber api semakin
terjamin kondisi aseptisnya.

V. Diskusi
No Alat / Bahan Metode Sterilisasi Alasan

13
 PRAKTIKUM III
PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN

I. Tujuan
Mahasiswa mengerti serta memahami mengenai media pertumbuhan, fungsi
serta cara pembuatan media pertumbuhan.
II. Dasar Teori
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikrobia untuk
pertumbuhan dan perkembangannya. Dalam mempelajari morfologi maupun
fisiologi serta untuk keperluan identifikasi suatu mikrobia umumnya akan
sangat berhubungan dengan media pertumbuhan. Media pertumbuhan bagi
mikrobia dapat berupa media cair ataupun media padat. Suatu media
pertumbuhan umumnya terdiri dari bahan dasar seperti air sebagai pelarut, agar
atau gelatin ataupun silica gel yang berfungsi memadatkan media. Disamping
itu media pertumbuhan harus mengandung unsur atau senyawa yang diperlukan
oleh mikrobia. Unsur-unsur tersebut dapat berupa C, H, O, N dan P (unsur
makro), Fe, dan Mg (unsur mikro) serta vitamin serta bahan tambahan lainnya
seperti phenol red yang berguna sebagai indikator tingkat kemasaman media
dan antibiotik.

MACAM_MACAM MEDIA PERTUMBUHAN

Berdasakan sifat fisiknya media pertumbuhan dapat dibedakan atas 3 yaitu:
6. Medium padat: medium yang komposisi agarnya 15%
7. Medium setengah padat: medium yang komposisi agarnya 0.4%
8. Medium cair: yaitu medium yang tidak mengandung agar contoh nutrient
broth (NB), lactose broth (LB).

14
 Berdasarkan komposisnya medium pertumbuhan dikelompokkan dalam :
1. Medium sintetis yaitu medium yang komposisi zat kimianya (glukosa agar
dll) diketahui secara jelas dan pasti.
2. Medium semi sintetis yaitu medium yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti contoh PDA yang terdiri dari agar, deskstrosa dan ekstrak
kentang (ekstrak kentang tdk dikethui apa komposisi senyawanya)
3. Medium non sintesis yaitu medium yang dibuat langsung dari bahan
dasarnya. Contoh tomato juice agar.
Berdasarkan tujuan penggunaannya:
1. Media untuk isolasi: umumnya media yang mengandung semua unsure
essensial untuk pertumbuhan contoh NA
2. Medium slektif: medium yang selain mengandung nutrisi juga mengandung
senyawa tertentu yang berfungsi untuk menghambat atau menekan
pertumbuhan mikrobia bukan sasaran. Contoh medium yang ditambah
dengan amphisilin untuk menekan mikrobia lainnya.
3. Medium diperkaya: medium yang mengandung bahan dasar untuk
pertumnuhanmikrobia tetapi ditambah komponen komplek lainnya seperti
serum, kuning telur atau lainnya.
4. Medium untuk peremajaan kultur
5. Medium untuk karakterisasi bakteri.

III. Alat dan Bahan

A. Alat
1. Labu Erlenmeyer 6. Pembakar Bunsen
2. Batang Pengaduk 7. Timbangan analitik
3. Gelas ukur 8. Autoklaf
4. Cawan petri 9. LAF
5. Tabung reaksi

15
 B. Bahan
1. Beef extract 8. HCl
2. Peptone 9. Alkohol 70%
3. Agar 10. Spiritus
4. Akuades 11. pH stick
5. Nutrient agar 12. Kapas, kassa
6. Aquades 13. Kertas payung
7. NaOH
IV. Prosedur Kerja
A. Nutrient Agar
Prosedur 1
1. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitik
untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut :
a. Beef extract 3 gr
b. Peptone 5 gr
c. Agar 15 gr
d. Akuades ad 1000 ml
2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk
melarutkan beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan
agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak.
3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara
konstan diatas hotplate (jangan sampai overheat karena akan terbentuk
busa dan memuai sehingga tumpah)
4. Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone
dan beef extract cukup dengan pengadukan.
5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk
sampai homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan
kertas pH indkator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan
NaOH/HCl.

16
 6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilkan
dengan autoklaf
7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan
media tegak atau miring, media pada point 5 langsung dituang ke tabung
kemudian di sterilisasi.
Prosedur 2
1. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitik
untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
a. Nutrient agar 23 gr
b. Aquades ad 1000 ml
2. Larutkan nutrient agar ke dalam 1000 ml aquadest
3. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan
menambahkan larutan HCl 1 N atau NaOH 1 N dan ukur dengan pH
indikator universal.
4. Sterilkan media menggunakan autoclave
5. Apabila sterilisas telah selesai, dinginkan media
6. Tuangkan secara aseptis dalam laminar flow untuk membuat media
tegak ataupun miring.
B. Nutrient Broth
Komposisi untuk media NB sama dengan NA, tetapi tidak memakai agar
sebagai pemadat. Proses pembuatannya lebih sederhana. Peptone dan beef
extract dilarutkan dengan akuades, kemudian ditampung dalam labu
Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap untuk di sterilisasi. Proses ini tidak
memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah dilarutkan pada
air suhu kamar jika diaduk
V. Diskusi
Masing-masing media dibungkus dengan kertas payung, kemudian diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Amati apakah tumbuh bakteri/kapang.

17
 PRAKTIKUM IV
PEWARNAAN BAKTERI
I. Tujuan
Mahasiswa mengetahui morfologi dan struktur sel mikroorganisme dengan
mewarnai sel.
II. Dasar Teori
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum
digunakan, karena pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu jenis zat
warna. Pewarnaan sederhana memungkinkan dapat membedakan bakteri
berdasarkan perbedaan bentuknya yaitu coccus, batang, spiral. Dengan
pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri.
Macam pewarnaan:
a. Pewarnaan sederhana
- Pewarnaan positif
- Pewarnaan negatif
b. Pewarnaan diferensial
- Pewarnaan gram
- Pewarnaan acid fast dll
c. Pewarnaan khusus
- Pewarnaan endospore
- Pewarnaan flagella dll
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop
dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat prearat
ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk
memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel
bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga
kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan

18
 mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan
sel. Contoh zat warna asam antara lain Cystal violet, methylene blue, safranin,
base fuchsin, malachite green dll. Sedangkan warna basa antara lain eosin,
congo red dll.
Morfologi bakteri:

III. Alat dan Bahan

A. Alat
1. Object glass
2. Deck glass
3. Pencil glass
4. Mikroskop
5. Pinset
6. Pembakar Bunsen

19
 B. Bahan
1. Suspense bakteri
2. Olie immerse
3. Kapas
4. Etanol 70%, 96%
5. Aquades
6. Methylene blue
7. Safranin
8. Crystal violet
9. Nigrosin
10. Mordant (Lugol’s iodine)
11. Malachite green
12. HCl

IV. Prosedur Kerja

A. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan positif
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass
yang kemudian di fiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang
terlalu padat, tetapi jika terlalu encer maka akan kesulitan saat mencari
bakteri di mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
1. Kaca objek bebas lemak dipanaskan sebentar diatas api. Diberi tanda
dengan pencil glass.
2. Jarum ose dipanaskan (disterilkan) diatas api Bunsen kemudian
didinginkan
3. Suspense banteri diambil dengan ose steril, kemudian digoreskan pada
object glass yang telah diberi tanda.

20
4. Object glass yang telah digoreskan bakteri didinginkan dan
dikeringkan, difiksasi dengan cara melewatkan diatas api Bunsen 3x
dan didinginkan.
5. Tetesi zat warna (metilen blue, safranin, cristal violet), diamkan selama
1-2 menit, buang warna berlebih dan keringkan.
6. Tetesi olie immerse, amati dibawah mikroskop dengan menggunakan
objective pembesaran 100x.

21
Pewarnaan negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, ehingga sel tampak transparan dengan
latar belakang hitam.
Cara Kerja :
1. Ambil 2 buah object glass, teteskan nigrosine/tinta cina di ujung kanan
salah satu object glass
2. Biakan diambil lalu diulaskan/diteteskan dalam tetesan nigrosine tadi,
lalu dicampurkan.
3. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping
kiri
4. Biarkan preparat mengering di udara, jangan di fiksasi/dipanaskan di
atas api

22
B. Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiogi, karena merupakan tahapan paling
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal
atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membrane sel bakeri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram
dibagi menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri
gram negatif mepunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel.
Cara Kerja :
1. Buat preparat ulas (smear) yang teah difiksasi
2. Teteskan Kristal violet sebagai pewarna utama, tunggu ± 1 menit. Cuci
dengan akuades mengalir
3. Teteskan mordant (lugol’s iodine), tunggu ± 1 menit. Cuci dengan akuades
mengalir
4. Beri larutan pemucat (etanol 96% / aseton) setetes demi setetes hingga
etanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak
(overdecolorize). Cuci dengan akuades mengalir
5. Teteskan counterstrain (safranin) dan tunggu ± 45 detik. Cuci dengan
akuades mengalir
6. Keringkan dengan kertas tisu yang ditempelkan di ulasan (jangan sampai
merusak ulasan), lalu biarkan mongering di udara.
7. Amati di bawah mikroskop.
8. Ulasan bakteri diamati warnanya, apakah berwarna biru gelap atau ungu
(gram positip) atau berwarna merah muda (gram negatif).

23
24
C. Pewarnaan Endospora
Bakteri dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetative, sehingga metabolismenya berifat
inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas,
kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa
pewarnaan, tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika
dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi
(keduany transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik
pewarnaan endospora.
Cara Kerja :
1. Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis
2. Tetesi ulasan pada object glass dengan malachite green. Letakkan di atas
air yang mendidih/panaskan di atas api. Biarkan 5 menit. Dijaga jangan
sampai kering. Jika bagian pinggir mulai mengering, tambahkan lagi
malachite green.
3. Setelah dingin, bilas object glass dengan akuades mengalir
4. Tetesi dengan safranin sebagai counterstrain, diamkan ± 45 detik
5. Cuci kering anginkan, lihat di mikroskop perbesaran 100 x

25
 Sel dan
endopsora

Sel terwarnai,
Suhu endopsora
normal tidak

Sel dan
Pemanasan endopsora
terwarnai

Pemberian Malachite green

Endopsora
Pelunturan
terwarnai,
sel tidak

Pelunturan dengan air mengalir

Endospora berwarna hijau,

sel berwarna putih

Penambahan safranin

Cuci dan keringkan

26
D. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap
larutan asam (biasanya genus mycobacterium) dan yang tidak tahan
terhadap larutan asam. Bakteri dari genus mycobacterium dan spesies
tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid
(berlemak) di dalam dinding-dinding selnya. Hal ini menyebabkan dinding
sel relatif tidak permeable terhadap zat-zat warna sehingga sel-sel bakteri
tidak terwarnai oleh metode biasa.
Cara Kerja:
1. Buat preparat ulas
2. Tetesi ulasan dengan carbol fuchsin. Letakkan di atas air yang
mendidih/panaskan di atas api. Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai
sampai kering. Jika bagian pinggir mulai mengering, tambahkan lagi
carbol fuchsin.
3. Setelah dingin, tetesi dengan alcohol asam (3% HCl dalam etanol 95%)
sebagai decolorize, diamkan selama ± 45 detik
4. Cuci kering anginkan, lihat di mikroskop perbesaran 100x
E. Pengamatan Motilitas (Pengamatan langsung dengan tetes gantung)
1. Oleskan vaselin pada 4 sudut deck glass
2. Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus sp. Atau E.coli ke deck
glass (sebaiknya dari biakan cair)
3. Tutup dengan object glass, balikkan dengan cepat.
4. Amati mengunakan mikroskop dengan perbesaran 40x. bakteri akan
tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati
jangan salah membedakan antara sel yang bergek sendiri karna flagel
atau bergerak karena aliran air

27
V. Hasil
Pengamatan Pewarnaan Bakteri
No Gambar Keterangan
1 Pewarnaan Sederhana (Positif) Morfologi :

2 Pewarnaan Sederhana (Negatif) Morfologi :

3 Pewarnaan Gram Morfologi :

Warna :

Jenis bakteri :
Bakteri gram ………………..

28
4 Pewarnaan Tahan Asam Morfologi:

Keterangan :

5 Pengamatan motilitas Morfologi:

Keterangan :

29
 PRAKTIKUM V
ISOLASI BAKTERI
I. Tujuan
Mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campuran sehingga didapat kultur
murni
II. Dasar Teori
Pada umumnya kita dapat menjumpai mikroba pada setiap tempat baik
dalam tanah,udara, air bahkan pada hampir semua yang ada terdapat mikrobia.
Tentu saja dalam mempelajari mikroorganisme mahasiswa harus mengerti dan
memahami bagaimana mengisolasi dan memisahkan mikrobia tersebut agar
didapat biakan murni sesuai dengan yang dikehendaki sehingga dapat dipelajari
morfologi, biologi ataupun karakteristik mikrobia tersebut. Sebelum dapat
melakukan isolasi maka yang harus dilakukan terlebih dahulu adalah
pengambilan sampel atau contoh. Sampel yang diambil dapat berupa tanah, air,
bagian tanaman ataupun manusia dan lain-lain.
Teknik Pengambilan Sampel
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah,
mak cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal
jika yang diinginkan mikroorganisme rhizofer maka sampel diambil dari
sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung akar.
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan
bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air
yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali. Jika ingin mengambil
sampel dari air keran maka sebelumnya keran dialirkan dulu beberapa saat
dan mulut kran dibakar

30
Teknik Preparasi Sampel
Sampel yang telah diambil kemudian disupensikan dalam akades steril.
Tujuan dari teknin ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan
mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya.
Macam-macam preparasi bergantung pada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada
sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya
sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut.
Contohnya meja, batu, batang kayu, dll. Caranya dengan
mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas
cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab lebih baik jika cotton
bud dicelupkan dahulu dalam larutan atraktan : pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang
menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran
kecil, misalnya daun, bunga, dll. Rinse merupakan prosedur kerja
dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan
perbandingan 1:9 (w/v). Contohnya sampel daun ditimbang 5 gr kemudian
dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass
c. Masceration (penghancuran), sampel yang berbentuk padat dapat
ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada
dipermukaan atau di dalam sampel dapat terlepas kemudian
dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji,
buah, dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama
adalah 1:9 (w/v). untuk sampel dari tanah tidak perlu dimaserasi.

31
Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan pengenceran bertingkat yaitu untuk memperkecil atau mengurangi

jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau
banyaknya tingkat pengenceran bergantung pada perkiraan jumlah mikroba
dalam sampel. Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran
pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10
sel mikroorganisme dari pengenceran berikutnya.
Penanaman Penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya
untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung
pengenceran terakhir.
a. Agar tabur (Spread Plate)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri
di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang
dapat dilakukan adalah: ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet
kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Kemudian
disebarkan dengan menggunakan batang L yang telah disterilkan pada
permukaan agar supaya tetesan suspensi merata.

32
b. Agar Tuang (pour plate)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45°C) untuk dituang
bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian
dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Cara ini akan menyebarkan sel-sel
bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar
(di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang
kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu
banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan
adalah sebagai berikut: Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang
akan ditanam dan media padat yang masih cair, teteskan 1 ml secara aseptis.
Suspensi sel ke dalam cawan kosong, tuangkan media yang masih cair ke
cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan
media, kemudian diinkubasi.

33
 Alasan diteteskan bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml
untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan
dipermukaan saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih
luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada
spread plate.
c. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru.
- Goresan Sinambung
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan
koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke media baru
Cara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara
kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar cawan 180°C
lanjutkan goresan sampai habis.

Gambar 6. Inokulasi secara goresan sinambung

- Goresan T
Cara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker,
inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum inokulan dan
tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak
pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang
sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3.

34
 Gambar 7. Teknik goresan secara T
- Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan
yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal
sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan
selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi
koloni tunggal.

Gambar 8. Teknik Goresan Kuadran

c. Metode miring (slank culture)
Cara kerja : menggunakan tabung reaksi, media dimasukkan ke
dalam tabung reaksi kemudian didiamkan hingga memadat.
Jarum ose di celupkan pada suspense bakteri kemudian di
tusukkan ke dalam agar.
d. Metode tegak (Stalo culture)
Cara kerja : menggunakan tabung reaksi, media dimasukkan ke dalam
tabung reaksi dengan keadaan miring kemudian didiamkan hingga
memadat. jarum ose tadi digoreskan di permukaan agar miring dengan hati-
hati dan diletakkan dalam incubator

35
Morfologi
Pertumbuhan pada Cawan Petri

Pertumbuhan pada Agar Miring

36
Pertumbuhan pada Agar Tegak
Ciri-ciri koloni berdasarkan bentuk :

Ciri-ciri koloni berdasarkan kebutuhan O2

37
 Pertumbuhan pada Media Cair

III. Alat dan Bahan

A. Alat B. Bahan
1. Petri dish 1. Suspense bakteri
2. Botol 2. Media PDA
3. LAF 3. Media NA
4. Jarum ose 4. Media NB
5. Bunsen 5. Alcohol 70%
6. Tabung reaks 6. NaCl
IV. Prosedur Kerja
A. Isolasi bakteri dari sampel air
1. Buatlah medium NB di tabung reaksi
2. Ambil sampel air sesuai dengan keadaan airnya (air mengalir, air
keran, air tenang).
3. Ambil 1 ml sampel, masukkan ke media NB lalu inkubasi pada suhu
37°C selama 1x24 jam.

38
B. Isolasi Bakteri dari lingkungan
1. Buat media NA di cawan petri
2. Ambil kapas lidi steril, celupkan dalam pengencer steril
3. Usapkan di permukaan benda/alat yang terdapat di sekitar
laboratorium (lantai, kran, air, meja, dinding, handle pintu, dll)
4. Tanam pada media NA padat dengan metode steak T.
5. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
C. Isolasi jamur dari sampel tanah
1. Mengambil tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung
pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan
pengenceran bertingkat sampai 10-5.
2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam pada
medium PDA cair (metode pour plate) kemudian diputar searah
jarum jam 5x dan berlawana arah jarum jam 5x atau membentuk
angka 68 sebanyak 5x.
3. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
4. Koloni yang tumbuh terpisah dipilih kemudian ditumbuhkan ke
media PDA baru dalam tabung dengan teknik streak.
D. Isolasi bakteri dari suspensi bakteri
1. Buatlah media NA tegak
2. Jarum ose dibakar di atas api, kemudian dicelupkan ke dalam
suspensi bakteri.
3. Tusukkan ke dalam media NA tegak
4. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
5. Buatlah media NA miring
6. Ambil sebagian koloni yang tumbuh, goreskan pada media NA
miring

39
V. Hasil Penanaman Bakteri
Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel :

Keterangan : Keterangan :

Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel :

Keterangan : Keterangan :

40
Hasil Isolasi Bakteri
Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel :

Keterangan : Keterangan :

Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel :

Keterangan : Keterangan :

41
 PRAKTIKUM VI
PENENTUAN ANGKA MIKROBA (METODE ANGKA LEMPENG TOTAL)

I. Tujuan
Mengetahui jumlah bakteri dalam sampel dengan metode ALT
II. Dasar Teori
Populasi mikroba di alam tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi
terdiri dari campuran berbagai jenis. Di dalam laboratorium, populasi mikroba
dapat diisolasi dari sumber / habitat seperti udara, tanah, air, makanan dan
lainnya. Hasil isolasi umumnya merupakan biakan mikroba campuran dan perlu
dimurnikan untuk memperoleh biakan murni yang terdiri dari satu jenis yang
dapat dipelajari morfologi, sifat fisiologi dan biokimiawinya. Isolasi dapat
dilakukan menggunakan beberapa teknik berikut :
1. Teknik Pengenceran
2. Teknik Penanaman
Teknik isolasi mikroba dengan metode pengenceran bertujuan untuk
memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan.

Gambar 4. Metode pengenceran

42
 Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 :
9 untuk sampel dari pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroba dari pengenceran
sebelumnya. Cara kerjanya sebagai berikut :
Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel masuk
lalu dilarutkan dengan 27 mengocoknya sampai homogen. Pengocokan
dilakukan dengan cara membenturkan tabung ke telapak tangan sampai
homogen. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan mikropipet kemudian
dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan
membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan
dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal
yang perlu diingat bahwa tip mikropipet yang digunakan harus selalu diganti.
Penentuan angka mikroba dapat dilakukan dengan metode plate count /
hitung cawan (Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir
(AKK)), dan Most Probable Number (MPN). Angka lempeng total adalah
angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1
gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung
pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam
pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian diinkubasi
selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Angka Kapang Khamir (AKK)
menunjukkan jumlah kapang/khamir dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel.
Prinsipnya sama dengan ALT namun suhu inkubasinya adalah pada suhu
kamar. MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang
menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair.

III. Alat dan Bahan

43
 A. Alat B. Bahan
1. Mortar & Stamper 1. Media PCA
2. Labu Erlenmeyer 2. NaCl
3. Cawan petri 3. Aquades
4. Hotplate stirrer & stirrer 4. Sampel makanan uji
5. Pembakar Bunsen 5. Etanol 70%
6. Laminar air flow
7. Mikropipet/pipet volume

IV. Prosedur Kerja

A. Angka Lempeng Total
1. Siapkan 5 buah tabung reaksi steril dan pipet ukur, simpan tabung reaksi
tersebut dalam rak tabung reaksi.
2. Masukkan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml ke dalam masing-masing tabung
reaksi, tutup tabung reaksi menggunakan kapas.
3. Beri label pada setiap tabung reaksi yang akan digunakan, penandaan di
mulai dari pengenceran 10-1 – 10-5.
4. Sampel dihancurkan dengan mortar dan stamper, timbang sebanyak 1 gr.
Apabila sampel berbentuk cair, pipet sebanyak 1 ml.
5. Masukkan ke dalam tabung reaksi dengan tanda 10-1, kocok dengan cara
menggoyangkan tabung ke satu arah atau gunakan vortex agar homogen.
6. Pipet 1 ml sampel dari tabung reaksi 10-1, masukkan ke reaksi dalam tabung
dengan tanda 10-2, kocok sampai homogen, ulangi prosedur hingga tabung
reaksi dengan tanda 10-5.
7. Buat media PCA dengan menimbang sebanyak 2,25 gr PCA, dilarutkan
dalam 100 ml aquades, panaskan diatas hotplate stirrer pada suhu 270°C
sampai larutan jernih. Sterilisasi menggunakan autoklaf.
8. Siapkan petri dish sebanyak 5 buah, beri tanda pada setiap petri dish sama
seperti pada tabung reaksi. Masukkan media PCA ke dalam petri dish.

19
 9. Pipet 1 ml sampel dari setiap tabung reaksi ke dalam masing petri dish
(tabung reaksi 10-1 dimasukkan ke dalam petri dish dengan tanda 10-1,
begitu seterusnya hingga tanda 10-5).
10. Putar petri dish searah jarum jam sebanyak 5 kali, kemudian berlawanan
arah jarum jam sebanyak 5 kali, atau membentuk angka 8 sebanyak 5 kali.
Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.

V. Hasil
Angka Lempeng Total
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3

Perhitungan :

PRAKTIKUM VII
PENENTUAN ANGKA MIKROBA (METODE ANGKA KAPANG KHAMIR)

45
I. Tujuan
Mengetahui jumlah bakteri dalam sampel dengan metode ALT
II. Dasar Teori
Penentuan angka mikroba dapat dilakukan dengan metode plate count /
hitung cawan (Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir
(AKK)), dan Most Probable Number (MPN). Angka lempeng total adalah
angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1
gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung
pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam
pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian diinkubasi
selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Angka Kapang Khamir (AKK)
menunjukkan jumlah kapang/khamir dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel.
Prinsipnya sama dengan ALT namun suhu inkubasinya adalah pada suhu
kamar. MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang
menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair.
III. Alat dan Bahan
A. Alat B. Bahan
1. Mortar & Stamper 1. Media PDA
2. Labu Erlenmeyer 2. NaCl
3. Cawan petri 3. Aquades
4. Hotplate stirrer & stirrer 4. Sampel makanan uji
5. Pembakar Bunsen 5. Etanol 70%
6. Laminar air flow
7. Mikropipet/pipet volume

IV. Prosedur Kerja

46
 1. Siapkan 5 buah tabung reaksi steril dan pipet ukur, simpan tabung reaksi
tersebut dalam rak tabung reaksi.
2. Masukkan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml ke dalam masing-masing tabung
reaksi, tutup tabung reaksi menggunakan kapas.
3. Beri label pada setiap tabung reaksi yang akan digunakan, penandaan di
mulai dari pengenceran 10-1 – 10-5.
4. Sampel dihancurkan dengan mortar dan stamper, timbang sebanyak 1 gr.
Apabila sampel berbentuk cair, pipet sebanyak 1 ml.
5. Masukkan ke dalam tabung reaksi dengan tanda 10-1, kocok dengan cara
menggoyangkan tabung ke satu arah atau gunakan vortex agar homogen.
6. Pipet 1 ml sampel dari tabung reaksi 10-1, masukkan ke reaksi dalam tabung
dengan tanda 10-2, kocok sampai homogen, ulangi prosedur hingga tabung
reaksi dengan tanda 10-5.
7. Buat media PDA dengan menimbang sebanyak 4 gr PDA, dilarutkan dalam
100 ml aquades, panaskan diatas hotplate stirrer pada suhu 270°C sampai
larutan jernih. Sterilisasi menggunakan autoklaf.
8. Siapkan petri dish sebanyak 5 buah, beri tanda pada setiap petri dish sama
seperti pada tabung reaksi. Masukkan media PDA ke dalam petri dish.
9. Pipet 1 ml sampel dari setiap tabung reaksi ke dalam masing petri dish
(tabung reaksi 10-1 dimasukkan ke dalam petri dish dengan tanda 10-1,
begitu seterusnya hingga tanda 10-5).
10. Putar petri dish searah jarum jam sebanyak 5 kali, kemudian berlawanan
arah jarum jam sebanyak 5 kali, atau membentuk angka 8 sebanyak 5 kali.
Inkubasi pada suhu kamar selama 5-7 hari.

V. Hasil

47
Angka Kapang Khamir
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3

Perhitungan :

PRAKTIKUM VIII

48
 PENENTUAN ANGKA MIKROBA UNTUK UJI KUALITAS AIR
(METODE MOST PROBABLE NUMBER)

I. Tujuan
Mahasiswa memahami tentang pengujian kualitas air.
II. Dasar Teori
Kualitas air dapat ditentukan berdasarkan parameter biologis /
mikrobiologis. Untuk parameter mikrobiologis, terdapat dua parameter yang
dapat diukur, yakni koliform tinja dan koliform total. Air yang mengandung
koliform tinja berarti air tersebut telah tercemar oleh tinja. Tinja sangat
potensial untuk menularkan penyakit yang berhubungan dengan air. Koliform
total dapat mengakibatkan penyakit-penyakit saluran pencernaan. Kuman
koliform total tidak sepenuhnya apatogen, beberapa tipe dapat menyebabkan
disentri pada bayi.
Pengujian kualitas air dapat dilakukan dengan metode MPN. Metode ini
terdiri dari 3 langkah yaitu :
1. Tes pendugaan (presumptive test) untuk mengetahui adanya bakteri yang
mampu memfermentasi laktosa, biasanya dilakukan inokulasi sampel pada
media laktosa cair.
2. Tes penegasan (confirmed test) untuk mengetahui adanya bakteri coliform
dengan cara menumbuhkan pada media selektif yaitu media BGLB
(Brilliant Green Lactose Bile Broth)
3. Tes pelengkap (complete test) untuk menentukan jenis bakteri coliform
dengan cara identifikasi pada media uji biokimia (IMVIC) atau cirri koloni
pada media selektif (endo agar) dan hasil pengecatan.
Namun untuk menghemat waktu maka dilakukan hanya kedua tes pertama yaitu
tes pendugaan dan tes penegasan saja, walau demikian ketepatan akan
berkurang sedikit.
III. Alat dan bahan

49
 A. Tes pendugaan B. Tes penegasan
- Laktosa broth 1,5% - BGLB 2%
- Lactose broth 0.5 % C. Alat
- Sampel air Tabung reaksi, pipet ukur,
incubator, rak tabung reaksi
IV. Prosedur kerja
Tes Pendugaan
1. Siapkan 3 seri media Laktosa broth (LB) 9 tabung yang telah dilengkapi
tabung durham, misalnya :
- 3 tabung berisi masing-masing 5 ml LB 1,5 %→ kelompok I
- 3 tabung berisi masing-masing 10 ml LB 0,5 % → kelompok II
- 3 tabung berisi masing-masing 10 ml LB 0,5 % → kelompok III
2. Pipet sampel asli tanpa pengenceran sebanyak :
- Masing-masing 10 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok I
- Masing-masing 1 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok II
- Masing-masing 0,1 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok III
3. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam
4. Amati jumlah tabung yang positif yaitu keruh dan ada gas ditandai dengan
adanya ruang kosong pada tabung durham
Tes Penegasan
1. Dari tabung yang positif diambil 1-2 ose secara aseptic dan masukkan ke
dalam media BGLB cair yang dilengkapi tabung durham
2. Inkubasi pada suhu suhu 37°C selama 24 untuk bakteri Coliform dan pada
suhu 44°C untuk Eschericia coli.
3. Amati jumlah tabung yang positif yaitu keruh dan ada gas ditandai dengan
adanya ruang kosong pada tabung durham
4. Hasil pengamatan dirujuk pada tabel MPN

19
Untuk sampel yang perlu pengenceran dilakukan seperti cara kerja tanpa
pengenceran dengan penyiapan sampel terlebih dahulu dibuat pengenceran
bertingkat misalnya 10-1, 10-2, 10-3 dst, lalu pipet sebanyak 1 ml tiap
pengenceran masukkan pada seri tabung media kelompok I, II dan III secara
aseptik.
1
𝑀𝑃𝑁 = 𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑀𝑃𝑁 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙 𝑥
𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑡𝑒𝑛𝑔𝑎ℎ

Tes pendugaan

Sampel air

10 ml
1 ml 0,1 ml

5 ml LB 1,5 % 10 ml LB 0,5 % 10 ml LB 0,5 %

Inkubasikan pada suhu 37°C 2x24 jam

Tes Penegasan
Dari hasil yang positif, pindahkan 1-2 ose pada tabung yang berisi larutan
BGLB 2% (10ml)

Inkubasi pada suhu 37°C 2x24 jam Inkubasi pada suhu 44°C 2x24 jam

51
 Tabel MPN
Nomor tabung yang positif Indeks Batas kepercayaan 95%
10 ml 1 ml 0,1 ml MPN/100 ml Terendah Tertinggi
0 0 1 3 <0.5 9
0 1 0 3 <0.5 13
1 0 0 4 <0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800

V. Hasil
Tes Pendugaan
Kelompok I Kelompok II Kelompok III

Tes Penegasan
Bakteri Coliform Bakteri E. coli

52
 PRAKTIKUM IX
UJI SENSITIVITAS ANTIMIKROORGANISME (METODE DIFUSI)
I. Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan pengujian sensitivitas antimikroba dengan metode
difusi
II. Dasar Teori
Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat
membunuh mikroba (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme (microbiostatic).
Uji sentifitas bakteri merupakan suatu metode untuk menentukan
tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk mengetahui
senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri. Uji sentivitas bakteri
merupakan suatu metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri
terhadap zat antibakteri dan untuk mengetahui senyawa murni yang memiliki
aktivitas antibakteri.
III. Alat dan Bahan
A. Alat B. Bahan
1. Jarum ose 1. Suspensi Bakteri E.coli
2. Mikro pipet 2. Suspensi bakteri Bacillus sp.
3. Cawan petri 3. Kertas cakram steril
4. Kertas cakram steril 4. media NA
5. Pinset 5. media MH
6. Inkubator 6. alcohol 70%
7. Beaker glass 7. Lysol 5%
8. Pembakar spiritus 8. povidone iodine
9. Penggaris 9. hipoklorit 5%
10. amoksisilin.

53
IV. Prosedur Kerja
A. Pengujian larutan desinfektan
1. Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan berisi NA dengan
metode perataan.
2. Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan desinfektan (alcohol
70%, Lysol 5%, povidone iodine, dan hipoklorit 5%). Setelah diangkat,
sisa tetesan yang berlebih diulaskan pada dinding wadah agar tidak
meluas di permukaan agar.
3. Kertas cakram diletakkan di permukaan agar dengan pinset. Tekan
dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.
4. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C.
5. Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya, bandingkan dengan
daya kerja berbagai desinfektan.
B. Pengujian antibotik dengan Metode Kirby-Bauer
1. Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri, kemudian
tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris.
2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara
merata. Biarkan cawan selama 5 menit.
3. Kertas cakram direndam dalam larutan antibiotic dengan konsentrasi
tertentu. Letakkan kertas cakram pada permukaan agar
4. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam
5. Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel
sensitivitas antibiotic

54
 Tabel Zone Diameter Interpretative Standards (mm)

Antimicrobial Agent Disc content Resistant Intermediate Moderate Susceptible

susceptible
Amdiocillin
for Enteobacteriaceae 10 μg ≤15 - - ≥16
Amikacin 30 μg ≤14 15-16 - ≥17
Amoxicillin/Clavulanic acid
for Haemophalus and Staphylococi 20/10 μg ≤19 - - ≥20
for other organism 20/10 μg ≤13 14-17 - ≥18
Ampicillin
for gram negative enteric organism 10 μg ≤11 12-13 - ≥14
for Staphylococci and B. catarrhalis 10 μg ≤28 - - ≥29
for Haemophilus species 10 μg ≤19 - - ≥20
for Enterococci 10 μg ≤16 - ≥17 -
for nonenterococcal Streptococci 10 μg ≤21 - 22-29 ≥30
for Listeria monocytogenes 10 μg ≤19 - - ≥20
Ampicillin/sulbactam
for gram negative enteric and 10/10 μg ≤11 12-13 - -
Staphylococci
for Haemophilus influenza 10/10 μg ≤19 - - ≥30
for Enterococci 10/10 μg ≤16 - ≥17 ≥18
for nonenterococcal Streptococci 10/10 μg 21 - 22-29 ≥22
and Listeria monocytogenes
Azlocillin for Pseudomonas 75 μg ≤14 15-17 - ≥23
Aztreonam 30 μg ≤15 - 16-21 ≥17
Carbenicillin
for Enteribacteriaceae 100 μg ≤17 18-22 - ≥18
for Pseudomonas 100 μg ≤13 14-16 - ≥18
Cefaclor
for Haemophilus influenza 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Cefamandole 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Cefazolin 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Cefonicid 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Cefoperazone 75 μg ≤15 - 16-20 ≥21
Cefotaxime 30 μg ≤14 - 15-22 ≥23
Cefotetan 30 μg ≤14 - 13-15 ≥16
Cefoxitin 30 μg ≤14 - 15-17 ≥18
Ceftazidime 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Ceftizoxime
for urinary isolates of P. aeruginosa 30 μg ≤10 - ≥11 -
for other organism 30 μg ≤14 - 15-19 ≥20
Ceftriaxone 30 μg ≤13 - 14-20 ≥21
Cefuroxime 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Cephalothin 30 μg ≤14 15-17 - ≥18
Chloramphenicol
for Haemophilus influenza 30 μg ≤26 - - ≥27
for other organism 30 μg ≤12 13-17 - ≥18

55
Cinoxacin 100 μg ≤14 15-18 - ≥19
Ciprofloxacin 5 μg ≤15 16-20 - ≥21
Clindamycin 2 μg ≤14 15-20 - ≥21
Doxyxycline 30 μg ≤12 13-15 - ≥16
Etithromycin 15 μg ≤13 14-22 - ≥23
Gentamicin 10 μg ≤12 13-14 - ≥15
Imipenem 10 μg ≤13 14-15 - ≥16
Kanamycin 30 μg ≤13 14-17 - ≥18
Methicillin for Staphylococci 5 μg ≤9 10-13 - ≥14
Mezocillin 75 μg ≤12 13-15 - ≥16
Minocycline 30 μg ≤14 15-18 - ≥19
Moxalactam 30 μg ≤14 - 15-22 ≥23
Nafcillin for Staphylococci 1 μg ≤10 11-12 - ≥13
Nalidixic Acid 30 μg ≤13 14-18 - ≥19
Netilmicin 30 μg ≤12 13-14 - ≥15
Nitrofurantoin 300 μg ≤14 15-16 - ≥17
Norfloxacin 10 μg ≤12 13-16 - ≥17
Oxacillin
for Staphylococci 1 μg ≤10 11-12 - ≥13
for Pneumococci 1 μg ≤19 - - ≥20
for penicillin G susceptibility
Penicillin G
for Staphylococci and B. catarrhalis 10 units ≤28 - - ≥29
for N. gonorrhoeae 10 units ≤19 - - ≥20
for Enterococci 10 units ≤14 - ≥15 -
for L. monocytogenes 10 units ≤19 - - ≥20
for nonenterococcal Streptococci 10 units ≤19 - 20-27 ≥28
Piperacillin 100 μg ≤14 15-17 - ≥18
Rifampin 5 μg ≤16 17-19 - ≥20
for N. meningitides only 5 μg ≤24 - - ≥25
Streptomycin 10 μg ≤11 12-14 - ≥15
Sulfonamides 250 or 300 μg ≤12 13-16 - ≥17
Tetracycline 30 μg ≤14 15-18 - ≥19
Ticarcillin 75 μg ≤11 12-14 - ≥15
Ticarcillin/Clavulanic Acid 75/10 μg ≤11 12-14 - ≥15
Tobramycin 10 μg ≤12 13-14 - ≥15
Trimethoprim 5 μg ≤10 11-15 - ≥16
Trimethoprim/Sulfamethoxazole 1.25/21.75 μg ≤10 11-15 - ≥16
Vancomycin 30 μg ≤9 10-11 - ≥12

56
V. Hasil
A. Desinfektan
Zona hambat (mm)
Jenis
Alcohol 70% Lysol 5% Povidone Hipoklorit ………….
Bakteri
Iodine

Kesimpulan :

B. Antibiotik : …………………..
Zona hambat (mm)
Jenis Bakteri
Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi
………….. ………….. ………….. …………..

Kesimpulan :

57
 PRAKTIKUM X
UJI SENSITIVITAS ANTIMIKROORGANISME (METODE DILUSI)
I. Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan pengujian sensitivitas antimikroba dengan metode
difusi
II. Dasar Teori
Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi antibiotic terendah
yang masih dapat menghambat pertumbuhan organism tertentu. KHM dapat
ditentukan dengan prosedur tabung dilusi. Prosedur ini digunakan untuk
menentukan konsentrasi antibiotic yang masih efektif untuk mencegah
pertumbuhan pathogen dan mengindikasikan dosis antibiotic yang efektif
dalam mengontrol infeksi pasien.
III. Alat dan Bahan
A. Alat
1. Tabung reaksi
2. Pembakar spirtus
3. LAF
4. Mikropipet
5. Cawan petri
6. Jarum ose
7. Incubator
B. Bahan
1. Antibiotic
kloramfenikol
2. Bakteri Salmonella
thypi
3. Aquades
4. Media BSA

58
IV. Prosedur Kerja
1. Metode dilusi dilakukan dengan cara membuat seri konsentrasi
kloramfenikol atau antibiotic lain, percobaan yang terdiri 10 tabung
reaksi dengan interval pengenceran dua kali.
2. Dimasukkan secara aseptis 1,0 ml aquades/pengencer ke dalam tiap-tiap
tabung kecuali tabung pertama.
3. Antibiotic dengan konsentrasi 100 ppm dimasukkan ke tabung pertama,
selanjutnya dibuat konsentrasi 50 ppm; 25 ppm; 12,5 ppm; 6,25 ppm;
3,125 ppm; 1,56 ppm; 0,78 ppm; 0,39 ppm; 0,19 ppm; 0,095 ppm.
4. Masukkan 1,0 ml larutan antibiotic ke tabung 2 dan dikocok kemudian
dari tabung kedua diambil 1,0 ml dan dimasukkan ke tabung 3 dan
dikocok, begitu seterusnya hingga tabung 10.
5. Ambil 1,0 ml dari tabung 10 dan buang.
6. Ditambahkan 1 ml suspense bakteri Salmonella thypi yang telah
disesuaikan dengan standar Brown II dan telah diencerkan 1:1000 kali
pada semua tabung dari 1-10
7. Inkubasi selama 1 hari pada suhu 37°C diamati kekeruhannya, tentukan
KHM nya
8. Selanjutnya diujikan pada media BSA secara goresan.
9. Konsentrasi minimum bakteriosida ditunjukkan dengan tidak adanya
pertumbuhan bakteri Salmonella thypi pada medium BSA
V. Hasil

PRAKTIKUM XI

59
 UJI POTENSI ANTIBIOTIK
I. Tujuan
Mahasiswa dapat menentukan potensi obat antibiotic dengan spesialite
tertentu dibandingkan dengan standar.
II. Dasar Teori
Aktivitas (potensi) antibiotic dapat ditunjukkan pada kondisi yang sesuai
dengan efek daya hambatan terhadap mikroorganisme. Suatu penurunan
aktivitas antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang
tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara
mikeobiologi atau biologi biasanya merupakan standar untuk mengatasi
keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas.
III. Alat dan bahan
A. Alat
1. Labu ukur B. Bahan
2. pipet volume 1. Biakan bakteri :
3. pipet tetes Staphylococcus aureus,
4. Erlenmeyer Escherichia coli
5. Beaker glass 2. Media BSA
6. cawan petri 3. Standar pembanding :
7. peroforator kloramfenikol, amoksisilin
(pelubang) 4. Aquades steril
8. spatel 5. Asam fosfat
9. jangka sorong. 6. natrium fosfat
7. Etanol 96%
VI. Prosedur kerja
1. Alat yang digunakan harus steril
2. Media dipilih sesuai dengan biakan dengan pH sterilisasi sesuai
persyaratan
3. Larutan dapar fosfat (LDF) dibuat seperti yang diperlukan oleh
antibiotic dan pH akhir sesuai persyaratan.
Sebanyak 4,8 ml asam fosfat dimasukkan ke dalam beaker glass,
tambahkan dengan aquades sampai 200 ml. Timbang 1,6 gr Natrium
fosfat, masukkan ke dalam beaker glass, tambahkan dengan aquades
sampai 200 ml. Campurkan larutan asam fosfat 30 ml dengan larutan
natrium fosfat 70 ml hingga membentuk pH sekitar 7
4. Persiapan baku/standar, dilakukan penimbangan secara seksama dengan
perhitungan kadar sesuai dengan rancangan penelitian.
5. Suspense mikroorganisme uji disiapkan sesuai persyaratan yang ada.

60
 6. Setelah semua alat dan bahan siap maka suspense bakteri diambil
dengan kapas lidi steril diratakan pada media yang sudah disiapkan
sehingga permukaan agar rata oleh suspense bakteri
7. Rataan suspense biakan dibiarkan 5 menit pada suhu kamar agar
terdifusi ke dalam media.
8. Lubangi lempeng agar dengan pelubang berdiameter 6 mm sebanyak 3
lubang tiap cawan petri dengan jarak yang sama tidak terlalu berdekatan
9. Sumuran pada cawan petri diisi dengan sediaan kloramfenikol
konsentrasi terkecil sampai tertinggi
10. Cawan diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam, lalu hasilnya diamati
dengan cara diameter daerah (zona) diukur hambatan di sekitar lubang
sediaan. Angka dinyatakan dalam satuan mm

Diameter zona hambat Standar (S) Uji (U)

Zona kons. rendah S1 U1
Zona kons. tengah S2 U2
Zona kons. Tinggi S3 U3
Jumlah sediaan S1+S2+S3 = S U1+U2+U3 = U
Kontras Linear S3-S1 = Ls U3-U1 = Lu
b = Ls + Lu Ys = S Yu = U Mu = Yu-Ys
(d-1) Inh nd nd b

Rasio potensi RU = antilog Mu

Potensi = RU x 100%
Keterangan :
B = slope regresi zona log konsentrasi semua sediaan
D = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan
H = banyaknya sediaan termasuk standar
N = banyaknya penggandaan setiap perlakuan
I = interval log konsentrasi berdampingan
(log S1 – log S2 = log S2 – log S3)

PRAKTIKUM XII
UJI KOEFISIEN FENOL
I. Tujuan

61
 Mempelajari dan menguji efektivitas dari suatu desinfektan.
II. Dasar Teori
Koefisien fenol adalah kemampuan desinfektan untuk membunuh bakteri
dibandingkan dengan fenol. Uji fenol adalah membandingkan aktivitas
antimikroba dari komponen-komponen kimia dengan fenol sebagai standar
uji. Pada prinsipnya uji koefisien fenol merupakan perbandingan aktivitas
fenol dengan pengenceran baku terhadap aktifitas sampel dengan
pengenceran tertentu MIC (minimum inhibition concentration/konsentrasi
terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat) suatu desinfektan
terhadap kuman tertentu.
III. Alat dan bahan
A. Alat
Pembakar Bunsen, kawat ose, Erlenmeyer, pipet volume, autoclave,
oven, botol semprot, tabung reaksi, rak tabung, cawan petri, aluminium
foil, kapas.
B. Bahan
Nutrient agar broth, NaCL, aquades, fenol, sampel desinfektan, suspensi
bakteri
IV. Prosedur kerja
1. Siapkan peralatan yang sudah disterilkan dan bahan yang akan
digunakan
2. Siapkan tabung reaksi steril sebanyak 5 buah,tandai dengan label sesuai
dengan tingkat pengenceran (1/40 – 1/80)
3. Ambil larutan desinfektan, lakukan pengenceran, masukkan sebanyak 5
ml ke dalam tabung reaksi yang sudah diberi label sesuai dengan tingkat
pengenceran, dimulai dari tingkat pengenceran terendah.
4. Siapkan suspense bakteri, panaskan kawat ose lalu dinginkan.
5. Masukkan 0,5 ml suspense bakteri ke dalam tabung reaksi berisi cairan
desinfektan yang telah diberi label (1/40 – 1/80) dengan rentang waktu
30 detik setiap memasukkan suspense ke dalam tabung desinfektan.

62
 6. Hitung waktu dengan stopwatch, setelah stopwatch menunjukkan angka
4 menit 30 detik, bersiap untuk memasukkan suspense bakteri yang telah
dimasukkan dalam cairan desinfektan dengan menggunakan kawat ose
yang telah dipanaskan, sebanyak 1 ose, tepat saat stopwatch
menunjukkan angka 5 menit masukkan 1 ose tersebut ke dalam media
agar broth, kemudian di tutup. Lakukan prosedur tersebut untuk
pengenceran selanjutnya dengan rentang waktu 30 detik sampai tingkat
pengenceran 1/40 – 1/80 untuk waktu 5 menit selesai.
7. Ulangi langkah 6 untuk waktu 10 menit dan 15 menit
8. Inkubasikan pada incubator selama 24 jam pada suhu 37C
9. Amati dan catat perubahan yang terjadi.
V. Hasil
Konsentrasi Waktu
5 menit 10 menit 15 menit

PRAKTIKUM XIII
UJI BIOKIMIA
I. Tujuan

63
 Mahasiswa mampu menguji aktivitas enzimatik untuk identifikasi bakteri.
II. Dasar Teori
Untuk dapat mengidentifikasi suatu bakteri dapat dilakukan dengan
pengamatan morfologi, yaitu bentuk koloni dan pengecatan pada bakteri
bersangkutan lalu dilakukan pengujian sifat fisiologisnya berdasarkan
reaksi biokimiawi yang terjadi pada suatu media uji. Media-media yang
dapat digunakan antara lain :
Media Bentuk Keadaan Warna Cara inokulasi
SIM Semi Tegak Kuning muda Tusukan
solid
MR-VP Cair - Kuning muda Sentuhan
Citrat Padat Miring Hijau Tusuk & gores
KIA Padat Miring Merah Tusuk & gores
LIA Padat Miring Ungu Tusuk & gores
Urea Padat Tegak Kuning Tusukan
MPB/PAD Cair - Hijau Sentuhan
LDS Padat Tegak Coklat Tusukan
Gula-gula Cair - Merah Sentuhan

III. Alat dan Bahan

A. Alat
Laminar Air Flow (LAF), inkubator, mikropipet, pipet ukur, gelas
erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, bunsen, jarum inokulum, rak
tabung reaksi, botol, masker, hand scoon, dan spidol.
B. Bahan
Biakan bakteri Escherichia coli, medium SIM (sulfit indol motility),
reagen kovac’s, medium MR-VP ( Methyl Red-Vogest Proskauer),
media TSIA, reagen α naftol 50% dan KOH 40%, H2O2 3%dan medium
SCA (Simon Citrate Agar), aquadest.
IV. Prosedur Kerja
A. Uji Katalase
1. Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis
dan diinokulasikan pada object glass.
2. Dengan menggunakan pipet tetes, teteskan
H2O2 3% secukupnya.
3. Amati adanya gelembung untuk hasil positif
(hati-hati membedakan antara gelembung yang muncul dari sel
dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambah reagen)
B. Uji dengan Medium SIM
Tujuan : untuk mengetahui pembentukan sulfide, indol dan motilitas

64
 1. Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
medium SIM secara duplo.
2. Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
• Uji Sulfida : uji positif jika media terbentuk warna hitam
• Uji motilitas : jika pertumbuhan menyebar ke seluruh medium
• Uji indol : tambahkan 5 tetes reagen kovac’s ke dalam 2 tabung.
Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi
tegak. Mengamati permukaan medium. Terbentuknya cincin
merah tua pada permuakaan medium menunjukkan indol positif
C. Uji Methyl Red
1. Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
medium MR-VP secara duplo.
2. Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
3. Menambahkan 3 tetes reagen methyl-red ke dalam 2 tabung.
4. Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi tegak
5. Mengamati permukaan medium. Terbentuknya warna merah
menunjukkan uji Methyl-Red positif.
D. Uji Voges Proskauer
1. Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
medium MR-VP secara duplo.
2. Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
3. Menambahkan 0,6 mL reagen α naftol 5% dan 0,5 mL KOH 40%
kedalam 2 tabung.
4. Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi
tegak.
5. Mengamati permukaan medium. Terbentuknya warna merah tua
pada permuakaan medium menunjukkan uji positif
E. Uji Citrate
Tujuan : untuk mengetahui apakah bakteri dapat menggunakan citrate
sebagai sumber karbon tunggal.
1. Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
medium SCA secara duplo.
2. Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
3. Mengamati pertumbuhan mikroba. Perubahan medium dari hijau
menjadi biru menunjukkan uji citrate positif

F. Uji Fermentasi Karbohidrat

65
 Tujuan : untuk mengetahui apakah bakteri dapat melakukan fermentasi
karbohidrat terutama dalam bentuk gula (glukosa, laktosa, maltose,
sukrosa)
Gula jika diurai : menghasilkam asam atau asam dan basa
1. Menginokulasi biakan bakteri E.coli pada medium TSIA secara
duplo.
2. Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
3. Tambahkan indicator fenol merah/phenol ptalein. Amati hasilnya
Jika lereng / slant berwarna merah ditulis K, kuning A
Jika dasar berwarna merah ditulis K, kuning A
Jika ada gas : media pecah/terangkat keatas, tulis G+, tetap G-
Jika media berwarna hitam tulis S+, jika tidak S-
G. Uji Decarboxylasi Lysin (LDC) dan Deaminasi Lysin (LDA)
Tujuan : untuk mengetahui proses Decarboxylasi Lysin dan Deaminasi
Lysin
1. Menginokulasi biakan bakteri Ypada medium LDS secara duplo.
Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
2. Menginokulasi biakan bakteri pada medium LIA secara duplo.
Menginkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.

Pengamatan :
Jenis medium
Warna
LDS LIA
Ungu LDC : positif LDC : +/-
LDA : negatif LDA : negatif
H2S : negatif H2S : negatif
Merah coklat LDC : negatif LDC : negatif
LDA : +/- LDA : positif
H2S : negatif H2S : negatif
Hitam H2S : positif H2S : negatif

66
 FORMAT LAPORAN

LAPORAN MIKROBIOLOGI I PRAKTIKUM II

PRAKTIKUM II STERILISASI
STERILISASI
I. TUJUAN
II. DASAR TEORI
III. ALAT DAN BAHAN
IV. PROSEDUR KERJA
V. HASIL (DAN PERHITUNGAN)
VI. PEMBAHASAN
VII. KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
OLEH :
NAMA NIM Klaten, ………………2019
Dosen Pengampu Praktikan,

PRODI DIII ANAFARMA

JURUSAN ANAFARMA
POLTEKKES KEMENKES SURAKARTA
2019 (……………………..) (……………………..)

53