PANDUAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI TERAPAN

OLEH:

Dr. NURHAYANI H. MUHIDDIN, M.Si.

LABORATORIUM PENDIDIKAN IPA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR
2021
 KATA PENGANTAR

Panduan praktikum ini dibuat untuk membantu mahasiswa dalam

melakukan proses pengenalan terhadap mikroorganisme yang terdapat di alam dan
peranannya terhadap kehidupan manusia. Panduan ini menjelaskan metode dasar
dalam mikrobiologi, penggunaan mikroskop untuk pengenalan mikroorganisme,
sterilisasi alat dan bahan, pembuatan media, dan metode isolasi mikroorganisme.
Penuntun ini juga berisi tahapan-tahapan dalam melakukan pengujian
mikrobiologis baik secara kuantitatif maupun secara kualitatif. Pengujian
mikrobiologis meliputi peranan mikroorganisme di bidang pangan,
mikroorganisme di bidang ndustri, mikroorganisme dan kesehatan manusia,
mikroorganisme dan lingkungan tanah, mikroorganisme dan lingkungan air,
mikroorganisme di bidang pertanian.
Praktikum di bidang pangan mencakup pengujian secara mikrobiologis
terhadap bahan pangan untuk dapat mendeteksi jumlah mikroba ataupun jenis
mikroba yang terdapat pada bahan pangan termasuk membuat produk makanan
fermentasi menggunakan mikroorganisme. Peranan mikroorganisme pada bidang
industri dikaji melalui pembuatan produk industri fermentasi menggunakan
mikroorganisme. Peranan mikroorganisme di bidang pertanian dan lingkungan
dikaji pada praktikum pengomposan dan isolasi dan kultivasi fungi termasuk
termasuk budidaya jamur.
Penulisan paduan praktikum ini masih banyak terdapat kekurangan-
kekurangan. Oleh karena itu kami berharap adanya koreksi, kritik dan saran untuk
menunjang perbaikan penulisan.

Makassar, Agustus 2021

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR........................................................................................................i
DAFTAR ISI.....................................................................................................................ii
PETUNJUK KEAMANAN LABORATORIUM...............................................................1
BAB I PENGENALAN DAN PENGGUNAAN MIKROSKOP.......................................3
BAB II PENYIAPAN, PENGENALAN DAN PEMAKAIAN ALAT............................10
BAB III PENGENALAN DAN PENGAMATAN MIKROORGANISME DENGAN
MIKROSKOP..................................................................................................................16
BAB IV BERBAGAI TEKNIK STERILISASI...............................................................21
BAB V MEDIUM DAN CARA PEMBUATAN MEDIUM...........................................25
BAB VI ENUMERASI MIKROORGANISME...............................................................32
BAB VII KULTIVASI DAN ISOLASI MIKROBA.......................................................50
BAB VIII PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROORGANISME.......................59
BAB IX PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN
BAKTERI........................................................................................................................74
BAB X UJI DAYA KERJA ANTI MIKROBIAL............................................................78
BAB XI ISOLASI DAN KULTIVASI FUNGI: BUDIDAYA JAMUR..........................83
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................89

ii
 PETUNJUK KEAMANAN LABORATORIUM
Laboratorium mikrobiologi dapat memberikan pengalaman menarik dan
menggairahkan, tetapi juga berpotensi terhadap bahaya. Tidak menyimpan dengan
benar bahan kimia, peralatan dan kultur mikroba yang ada akan berisiko bagi anda
dan yang lain. Ikuti petunjuk keamanan yang ditetapkan asisten.

A. TATA TERTIB
1. Jangan merokok, makan dan minum didalam ruangan laboratorium,
walaupun belum melakukan pekerjaan laboratorium. Sebaiknya tidak
membawa makanan dan minuman kedalam laboratorium.
2. Cucilah tangan anda sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium, gunakan
sabun antiseptik dan air. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan
laboratorium untuk pergi kekamar kecil.
3. Datanglah ke Labaratorium, kira-kira 10 menit sebelum praktikum
dimulai, mempersiapkan pekerjaan hari itu. Waktu laboratorium sangat
berharga. Disamping itu perhitungkan bahwa apa yang anda lakukan
adalah perlakuan yang dirancang untuk manghasilkan bahaya. Perlakuan
semua mikroorganisme yang anda tangani sebagai patogen.
4. Letakkan tas dan benda-benda lain milik anda yang tidak diperlukan pada
tempat yang telah disediakan.
5. Kenakan jas laboratorium dan masker selama anda bekerja. Jas
laboratorium dan masker tidak hanya melindungi diri anda dari
kontaminasi, tetapi juga akan melindungi anda dari zat warna atau zat
kimia lainnya.
6. Jangan memindahkan organisme atau bahan kimia apapun dari
laboratorium.

1
B. KEAMANAN LABORATORIUM
1. Gunakan antiseptik ( mis : betadin ) pada kulit anda yang terkena
tumpahan mikroorganisme.
2. Asisten akan memberitahu tempat mencuci peralatan dan mencuci tangan,
jangan sekali-kali membuang biakan ditempat cuci.
3. Gunakan pelindung mata apabila memanaskan bahan kimia.
4. Padamkan lampu bunsen bila tidak digunakan.
5. Sebaiknya rambut yang panjang dijepit dan kuku yang panjang dipotong.
Karena ini berpotensi sebagai sumber kontaminasi.
6. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung dan telinga selama anda bekerja
dilaboratorium.

2
 BAB I
PENGENALAN DAN PENGGUNAAN MIKROSKOP

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa dapat mengetahui bagian-bagian mikroskop dan fungsinya.
2. Mahasiswa dapat menggunakan mikroskop untuk mengamati
objek/preparat

B. DASAR TEORI

Mikroskop merupakan salah satu alat yang penting pada kegiatan

laboratorium sains, khususnya biologi. Mikroskop merupakan alat bantu yang
memungkinkan kita dapat mengamati objek yang berukuran sangat kecil
(mikroskopis). Hal ini membantu memecahkan persoalan manusia tentang
organisme yang berukuran kecil. Antony van Leewenhoek yang mengembangkan
kekuatan lensa tangan (mikroskop cahaya sederhana) dapat memperbesar
organisme 100 sampai 250 kali sehingga dapat melihat organisme satu sel.
Mikroskop Van leewenhoek merupakan mikroskop sederhana sebab hanya
menggunakan satu lensa antara objek dan mata. Pada waktu yang sama Robert
Hooke menggunakan mikroskop majemuk untuk menunjukkan bahwa satuan
struktur fungsi fisiologis yg terkecil dari semua mahluk hidup adalah sel. Pada
pertengahan tahun 1800 mulai dikembangkan teori sel dengan teliti.

Gambar 1. Mikroskop buatan Antony van Leewenhoek

Mikroskop cahaya menggunakan dua sistem lensa dalam rangkaiannya

untuk menggambarkan obyek disebut lensa majemuk. Lensa objektif menutup
objek dan menghasilkan perbesaran gambar, lensa okuler dekat dengan mata dan

3
memperbesar gambaran. Mikroskop binokuler mempunyai dua tempat untuk
melihat. Ada beberapa mikroskop cahaya yang berbeda, antara lain mikroskop
medan terang, mikroskop medan gelap, dan mikroskop fase kontras. Mikroskop
medan terang digunakan untuk memperbesar gambaran objek yang diuji, untuk
menentukan ukuran, bebtuk dan struktur sel mahluk hidup. Objek yang
mempunyai dimensi jauh lebih kecil dari batas pemisah yang umum tidak dapat
dilihat. Lensa objektif memperbesar gambaran objek biasanya 4-100 kali dan
lensa okuler umumnya memperbesar gambaran semu tidak lebih dari 10 - 15 kali.

Gambar 2. Mikroskop cahaya

A B
monokuler (A) dan binokuler (B)
1. Komponen mikroskop dan fungsinya :
a. Kaki
Kaki berfungsi menopang dan memperkokoh kedudukan mikroskop. Pada kaki
melekat lengan dengan semacam engsel, pada mikroskop sederhana (model
student).
b. Lengan
Dengan adanya engsel antara kaki dan lengan, maka lengan dapat ditegakkan
atau direbahkan. Lengan dipergunakan juga untuk memegang mikroskop pada
saat memindah mikroskop.
c. Cermin/ Reflektor

4
 Cermin mempunyai dua sisi, sisi cermin datar dan sisi cermin cekung,
berfungsi untuk memantulkan sinar dan sumber sinar. Cermin datar digunakan
bila sumber sinar cukup terang, dan cermin cekung digunakan bila sumber
sinar kurang. Cermin dapat lepas dan diganti dengan sumber sinar dari lampu.
Pada mikroskop model baru, sudah tidak lagi dipasang cermin, karena sudah
ada sumber cahaya yang terpasang pada bagian bawah (kaki).
d. Revolver
Revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara
memutarnya.
e. Kondensor
Kondensor tersusun dari lensa gabungan yang berfungsi mengumpulkan sinar.
f. Diafragma
Diafragma berfungsi mengatur banyaknya sinar yang masuk dengan mengatur
bukaan iris. Letak diafragma melekat pada diafragma di bagian bawah. Pada
mikroskop sederhana hanya ada diafragma tanpa kondensor.
g. Meja preparat
Meja preparat merupakan tempat meletakkan objek (preparat) yang akan
dilihat. Objek diletakkan di meja dengan dijepit dengan oleh penjepit. Dibagian
tengah meja terdapat lengan untuk dilewat sinar. Pada jenis mikroskop
tertentu,kedudukan meja tidak dapat dinaik atau diturunkan. Pada beberapa
mikroskop, terutama model terbaru, meja preparat dapat dinaik-turunkan.
h. Tabung (Tubus)
Tabung bagian atas tempat melekat lensa okuler, dengan perbesaran tertentu
(15X, 10X, dan 15 X). Bagian bawah tabung terdapat alat yang disebut
revolver. Pada revolver tersebut terdapat lensa objektif.
i. Lensa obyektif
Lensa objektif bekerja dalam pembentukan bayangan pertama. Lensa ini
menentukan struktur dan bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir.
Ciri penting lensa obyektif adalah memperbesar bayangan obyek dengan
perbesaran beraneka macam sesuai dengan model dan pabrik pembuatnya,
misalnya 10X, 40X, dan 100X dan mempunyai nilai apertura (NA). Nilai

5
 apertura adalah ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan
daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang
berdekatan sebagai dua benda yang terpisah.
j. Lensa Okuler
Lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung, berdekatan dengan
mata pengamat. Lensa ini berfungsi untuk memperbesar bayangan yang
dihasilkan oleh lensa objektif. Perbesaran bayangan yang terbentuk berkisar
antara 4 - 25 kali.
k. Pengatur Kasar dan Halus (makrometer dan mikrometer)
Komponen ini letaknya pada bagian lengan dan berfungsi untuk mengatur
kedudukan lensa objektif terhadap objek yang akan dilihat. Pada mikroskop
dengan tabung lurus/tegak, pengatur kasar dan halus untuk menaikturunkan
tabung sekaligus lensa onbjektif. Pada mikroskop dengan tabung miring,
pengatur kasar dan halus untuk menaikturunkan meja preparat.

2. Penggunaan Mikroskop
Hal-hal yang perlu diperhatikan bila menggunakan mikroskop
a. Selalu membawa mikroskop dengan dua tangan.
b. Bila menggunakan preparat basah, tabung mikroskop selalu dalam
keadaan tegak, berarti meja dalam keadaan datar. Ini berlaku bagi
mikroskop dengan tabung tegak, tidak berlaku untuk mikroskop dengan
tabung miring
c. Preparat basah harus selalu ditutup dengan gelas penutup saat dilihat di
bawah mikroskop
d. Selalu menjaga kebersihan lensa-lensa mikroskop termasuk cermin.
e. Bila ada bagian mikroskop yang kurang baik/hilang segera laporkan
kepada laboran.
f. Tidak dibenarkan melepas lensa-lensa mikroskop dari tempatnya.
g. Setelah selesai menggunakan mikroskop, pasang lensa objektif dengan
perbesaran paling rendah pada kedudukan lurus ke bawah.
Langkah-langkah menggunakan Mikroskop dengan benar adalah:
a. Membawa mikroskop secara hati-hati dengan cara memegang lengan

6
 mikroskop dengan satu tangan dan tangan lain digunakan untuk
menyangga dasar mikroskop. Kemudian rendahkan dan letakkan pada
meja yang datar.
b. Duduklah pada tempat yang nyaman. Bila menggunakan mikroskop
cahaya, maka carilah tempat yang cukup sinar.
c. Sebelum menempatkan slide preparat pada meja preparat, gunakan tombol
pengatur kasar (makrometer) untuk menurunkan meja preparat sampai
posisi paling bawah.
d. Perhatikan arah putaran. Aturlah cermin pada bagian bawah sampai ada
cahaya yang memantul, melewati diafragma sehingga terlihat dari lensa
okuler.
e. Perhatikan, titik fokus mata setiap orang berbeda-beda, sehingga setiap
orang harus mencari sendiri pencahayaan sesuai kondisi mata.
f. Letakkan slide preparat di atas meja preparat dengan baik. Pastikan slide
pada posisi yang telah disediakan (bagian berbentuk siku) dan tahan
dengan penjepit.
g. Pastikan bahwa perbesaran lensa objektif adalah perbesaran paling rendah
(biasanya 10 kali). Jika belum, maka putar knob lensa objektif itu untuk
mendapatkan perbesaran paling rendah.
h. Mulailah melakukan pengamatan dengan mengatur fokus amatan, yaitu
dengan memutar tombol pengatur kasar (makrometer) sampai mendapat
bayangan benda yang jelas sesuai mata.
i. Perhatian, biasakan membuka kedua mata saat mengamati, agar tidak
terjadi kerusakan/gangguan pada mata.
j. Geserlah siku penahan preparat untuk mengamati berbagai sisi preparat.
k. Pastikan bahwa kita mendapatkan bayangan dari bagian preparat yang
akan kita amati.
l. Untuk perbesaran yang lebih, putar kembali knob lensa objektif sampai
perbesaran lensa berikutnya (biasanya 40 kali). Untuk perbesaran
berikutnya, biasanya arah putar knob adalah berlawanan arah jarum jam.
m. Lakukan kembali pengamatan seperti pada tahap 7. Tetapi perhatikan,

7
 panjang tabung lensa objektif lebih panjang dari sebelumnya dan hampir
berimpit dengan preparat. Agar saat mencari fokus bayangan lensa tidak
menekan preparat, maka gunakan tombol pemutar halus (mikrometer).
Jika lensa menekan preparat, maka slide bisa pecah.
n. Jika telah mendapat bayangan gambar yang paling jelas, gambarlah
bayangan tersebut.
o. Jika telah selesai dan akan mengakhiri pengamatan, turunkan meja
preparat dengan memutar tombol pengatur kasar sampai posisi paling
bawah. Ingat dan perhatikan arah putaran, jangan sampai justru memutar
ke arah atas. Setelah itu putar knob lensa objektif sampai lensa perbesaran
paling rendah, lalu ambil slide preparat.
p. Simpan kembali mikroskop pada tempatnya.
3. Pemeliharaan Mikroskop
a. Mikroskop harus disimpan di tempat sejuk, kering, bebas debu, bebas dari
uap asam-basa.
b. Tempat penyimpanan yang sesuai adalah kotak mikroskop yang
dilengkapi silica gel, yang bersifat higroskopis sehingga lingkungan
mikroskop tidak lembab. Selain itu dapat pula dalam almari yang diberi
lampu
c. Bagian mikroskop non-optik dapat dibersihkan dengan kain flanel. Untuk
membersihkan debu yang terselip dapat dengan kuas kecil atau kuas lensa
kamera, serta alat semprot atau kuas lembut.
d. Bersihkan kotoran, bekas jari, minyak dan lain-lain pada lensa dengan
menggunakan kain lensa, tissue atau kain lembut yang dibasahi sedikit
alkoholeter atau isopropyl alkohol. Jangan sekali-kali membersihkan lensa
dengan saputangan atau kain
e. Bersihkan badan mikroskop dan lengan dengan kain lembut dengan sedikit
deterjen.
f. Sisa minyak imersi pada lensa objektif dapat dibersihkan dengan xilol
(xylene).
Hati-hati xilol dapat merusak bahan plastik.

8
C. KEGIATAN PRAKTIKUM

1. Alat :
a. Mikroskop
b. Kaca objek (Object glass)
c. Kaca tutup (cover glass)
d. Pinset
e. Kertas lensa
f. Lap kain/tissue
g. Kamera HP

2. Bahan :
- Biakan bakteri
- Biakan fungi
- Preparat awetan protozoa dan algae

3. Cara Kerja

a. Buatlah preparat biakan bakteri dan fungi pada kaca objek

b. Amatilah di bawah mikroskop.
c. Bandingkan hasil pengamatan bakteri dan fungi dari preparat yang dibuat
oleh setiap peserta dengan hasil pengamatan protozoa dari preparat awetan
d. Setelah diperoleh hasil yang bagus kemudian difoto.

D. HASIL PENGAMATAN
Preparat Baru Preparat Awetan
Mikroorganisme
Gambar Perbesaran Gambar Perbesaran
Bakteri
Khamir

9
 Kapang
Protozoa
BAB II
PENYIAPAN, PENGENALAN DAN PEMAKAIAN ALAT

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa dapat mengetahui beberapa alat yang digunakan di
Laboratorium Mikrobiologi beserta fungsinya.
2. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip dan cara penggunaan peralatan
mikrobiologi

B. DASAR TEORI
Dalam melaksanakan pekerjaan mikrobiologi diperlukan berbagai jenis
alat tergantung dari kebutuhan. Sebelum penggunaan alat-alat tersebut
diperhatikan lebih dahulu kondisi alat tersebut dan lain-lain.
Penggunaan alat dalam praktikum mikrobiologi umum dibagi atas :
 Penggunaan alat-alat gelas
 Penggunaan autoklaf (autoklave)
 Penggunaan oven
 Penggunaan alat lain ( enkas, spektrofotometer, Shaker )
1. Penggunaan Alat-Alat Gelas
Sebelumnya dibedakan cara membersihkan alat-alat gelas yang masih baru
(baru akan dipakai untuk pertama kali) dan alat yang sudah digunakan.
a. Alat-Alat gelas yang masih baru
1.) Godok alat-alat gelas ( tabung reaksi, petridist, dan labu) yang masih baru
dalam larutan Na3PO4(Trinatrium Pospat) 1% sampai mendidih beberapa
saat kemudian.
2.) Kemudian cuci dengan air, hingga bersih dan rendam dalam larutan HCl
1,0% selama 24 jam untuk melarutkan lapisan pospat pada gelas.
3.) Cuci kembali dengan air, bilas sebersih-bersihnya dengan aquadest.
4.) Keringkan dalam hot air stirilizer (oven) atau langsung dengan sinar
matahari.

10
 b. Alat-alat gelas yang sudah dipakai
1.) Sterilkan semua alat gelas yang telah dipakai dalam Otoklaf pada, tekanan
15 Ibs (2atm, temperatur121°C) selama 20 menit untuk menghindarkan
mikroba patogen.
2.) Setelah proses sterilisasi buang isinya kemudian rendamlah dalam larutan
NaPO4 1% didihkan selama beberapa menit.
3.) Setelah dingin atau hangat-hangat kaku, alat-alat gelas itu disikat sampai
bersih dandicuci (dibilas) dengan air.
4.) Kemudian rendam da lam Iarutan HC1 1,0%
5.) Keringkan dalam hot air sterilizer atau dengan sinar .mataha.ri

Untuk membersihkan alat-alat gelas yang berisi agar-agar (sisa medium agar)
adalah sebagai berikut :
1.) Buanglah dahulu agar-agar yang terdapat dalam gelas atau tabung
kedalam tempat yang telah disediakan. Jika agar-agar masih panas (baru
keluar dari otoklaf) jangan dibuang dalam bak pembuang air, sebab setelah
dingin akan menyumbat saluran pembuangan.
2.) Cara membersihkan selanjutnya seperti tersebut. dalam sub b2 dan
seterusnya.
c. Pipet yang masih baru
1.) Godog pipet yang masih baru dalam Iarutan Na3PO41,0 % selama
1menit.
2.) Cuci dengan air hingga bersih, kemudian keringkan.
3.) Rendam kembali dalam larutan HCl 1,0% untuk melarutkan lapisan
fosfat pada gelasnya (selama 24 jam) .
4.) Cuci dengan air hangat hingga bersih kemudian dibilas dengan aquadest
5.) Keringkan dalam hot air steriliser atau dengan sinar matahari.
d. Pipet yang sudah dipakai

11
1.) Pipet yang sudah dipakai, untuk mengambil mikroba harus didesinfeksi
dengan larutan fenol 5% atau desinfektan lain selama waktu tertentu.
2.) Keringkan seperlunya (tidak perlu dengan hot air sterizer)
3.) Godok dalam larutan Na3PO4 1% selama 10 menit.
4.) Cuci dengan air dan keringkan.
5.) Rendam dalam larutan HC1 I% untuk melarutkan fosfat pada gelas
selama 24 jam. Asam khloridanya harus betul—betul masuk kedalam
pipet.
6.) Cuci dengan air sampai bersih, kemudian dibilas dengan aquadest.
7.) Keringkan dalam hot air sterilizer atau dengan sinar matahari.
e. Gelas benda yang masih baru
1.) Rendamlah gelas benda (object glass) yang masih baru dalam larutan
alkohol dengan asam (Mengandung HCL 3%) selama beberapa jam
2.) Cucilah dengan air kemudian aquadest.
3.) Keringkan dengan menggosokkan dengant kain yang halus. waktu
menggosak Jangan sampai terjadi pengotoran lemak dari tangan ( jari )
karena itu peganglah pada tepinya saja.
4.) Simpan gelas benda itu dalam tempat tertutup yang bersih atau didalam
petridish
5.) Sebelum dipakai, gelas benda harus dipanggang diatas api lampu
spiritus atau lampu bunsen beberapa saat agar sisa-sisa lemak yang
mungkin, masih ada terbakar. Setelah dingin baru dapat dipakai.
f. Gelas penutup yang masih baru
1.) Masukkan gelas penutup (cover glass) yang baru satu persatu kedalam
larutan alkohol seperti dalam sub e.1 selama beberapa jam.
2.) Buanglah larutan alkohol asamnya, kemudian cuci gelas penutup satu per
satu dengan airkemudian dibilasdengan aquadest.
3.) Keringkan seperti tersebut sub e.3.
4.) Simpanlah di dalam tempat gelas yang tertutup atau didalam petridist
g. Gelas benda dan gelas penutup yang telah dipakai

12
 1.) Direndam dalam wadah yang terisi alkohal 7O% yang telah berisi yang
telah dialasi dengan kapas/kasa steril. Alat-alat gelas yang sudah dicuci
2.) kemudian dikeringkan pada waktu akan disterilkan untuk alat seperti
tabung reaksi, kapas demikian pula elenmeyer.

2. Penggunaan Otoklaf ("autoclave")

Otoklaf berfungsi untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan, Alat ini
terdiri dari bejana tekanan tinggi dilengkapi monometer, termometer, klep
bahaya. Otoklaf dipakai untuk sterilisasi larutan dan medium atau alat-alat, yang
tahan tekanan yang tinggi. Waktu steriliasi mulai dihitung pada saat suhu dan
tekanan yang diperlukan sudah tercapai. Isi tempat air dengan air sampai dekat
"angsang" (dasar yang berlubang-lubang tempat meletakkan alat-alat yang
disterilkan), kemudian tekan tombol on. Alat-alat atau bahan yang akan
disterilkan dimasukkan. Perhatikan bahwa media yang disterilkan dalam
erlenmeyer atau tabung reaksi perlu ditutup rapat dengan kapas kemudian dengan
kertas perkamen atau kertas sampul. Selanjutnya pasang tutup otoklaf dan sekrup-
sekrup dikeraskan. Kran pengatur tempat keluar uap air dibiarkan terbuka sampai
uap air dari semua udara telah terdesak keluar; dengan demikian di dalam bejana
hanya ada tekanan uap air murni saja.
Besarnya tekanan yang digunakan tergantung pula macamnya bahan atau
alat yang disterilkan. Lamanya sterilisasi dengan tekanan 2 atm (12I°C) berkisar
antara 15-30 menit. Apabila sterilisasi sudah selesai, tekan tombol off dan tunggu
sampai jarum penunjuk pada pengatur suhu kembali ke posisi 0 lebih dahulu
sebelum dibuka, dan katup pengatur tempat keluarnya uap air harus dibuka
perlahan-lahan. Keluarkan alat atau bahan yang telah disterilkan. Jangan
mempercepat pengeluaran untuk menurunkan tekanan, karena dapat
mengakibatkan terlepasnya sumbat kapas pada erlenmeyer atau tabung,atau
muncratnya larutan sehingga membasahi kapas.

13
Gambar 1. Autoklaf dan bagian bagiannya

3. Penggunaan oven ("Hot air sterilizer")

Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti erlenmeyer
petridish, tabung reaksi atau alat gelas lainnya yang sebelumnya sudah dibungkus
kertas. Pintu oven jangan dibuka sehelusnya suhunya turun mencapai suhu kamar.
Hal ini untuk menghindari retaknya gelas atau masuknya udara yang mengandung
partikel debu.Temperatur yang digunakan 170-180°C selama 2 Jam.
4. Penggunaan alat- alat lain

1. Enkas : Sebelum digunakan seluruh dinding dan dasar enkas dibersihkan

lalu diusap kali dengan alkohol 70%. Didiamkan sekitar 30 menit sebelum
digunakan.
2. Colony counters : alat ini digunakan untuk menghitung jumlah koloni
yang tumbuh dalam cawan petri.
3. Spektrofotometer : Alat ini digunakan dalam pendugaan pertumbuhan
mikroba secara turbidimetrik. gunanya untuk .mengukur kekeruhan
suspensi sel dengan cara menentukan jumlah cahaya dilakukan dari suatu
sumber cahaya monokhromatik, yang ditangkap oleh suatu sel
fotoelektrik, yang dihubungkan dengan suatu galvanometer, sehingga
jumlah cahaya yang dilakukan dapat diukur.

14
 4. Shaker : Alat ini digunakan untuk membantu pertumbuhan mikroba.
5. Timbangan : alat untuk menimbang larutan atau bahan yang akan dipakai

C. CARA KERIA :
1. Penggunaan alat-alat gelas
Siapkan alat gelas baru dan sudah terpakai Lakukan cara pencucian
seperti yang telah dijelaskan. Setelah itu sumbat kapas ( untuk pipet,
erlenmeyer atau tabung reaksi), sebelum dilakukan sterilisasi (sebelumya diisi
dengan medium).
2. Penggunaan Autoklaf
Perhatikan dengan baik otoklaf, amati prinsip kerja alat ini dan catat data ten
tang otoklaf yang anda gunakan.
3. Penggunaan Oven
Perhatikan prinsip kerja alat ini dan catat data tentang oven ini.
4. Penggunaan alat lain
Lihat masing-masing fungsi dari alat.

D. HASIL PENGAMATAN:
1. Catat dan gambar semua peralatan mikrobiologi yang ada di Laboratorium
2. Tuliskan spesifikasi, prinsip kerja alat dan cara penggunaannya

15
 BAB III
PENGENALAN DAN PENGAMATAN MIKROORGANISME
DENGAN MIKROSKOP

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa diharapkan:
1. Dapat menggunakan mikroskop dengan baik dan benar
2. Dapat mengenal beberapa contoh mikroorganisme
3. Dapat melakukan penyiapan preparasi pengamatan mikroskopik dengan
baik dan benar
4. Dapat memahami cara penanganan dan perawatan mikroskop setelah
selesai digunakan.

B. DASAR TEORI
Mikrobiologi adalah bidang ilmu yang mencakup berbagai kelompok
kehidupan mikroorganisme atau jasad renik (mikroba) yang tidak kasat mata
telanjang. Termasuk didalamnya bakteri, cendawan, mikroalga, protozoa, dan
virus. Mikroskop sangat erat kaitannya dalam pekerjaan secara mikrobiologi,
mengingat mikroba yang digunakan mempunyai ukuran yang sangat kecil.
Mikroskop dibedakan atas 2 yaitu
a) Mikroskop cahaya
b) Mikroskop elektron
Dalam praktikum ini digunakan mikroskop cahaya medan terang ( bright
field). Mikroskop medan terang ini adalah suatu bentuk mikroskop dengan medan
yang mengelilingi spesimen kelihatan terang ( berwarna cerah), sedangkan
spesimennya memperlihatkan warna gelap. Hal ini disebabkan karena cahaya dari
sumber lewat melalui sistem-sistem lensa keatas tanpa mengalami perubahan
sehingga terbentuk medan terang
Mikroskop pada dasarnya terbagi atas 2 bagian yaitu bagian mekanik dan
bagian optik„ Bagian mekanik terdiri dari Statif, kubus, revolver, meja objek,
sekrup penggerak, dan objek. Bagian optik terdiri dari lensa okuler, lensa objektif,
dan kondensor.

16
 Lensa objektif pada mikroskop dibagi atas tiga yaitu :
1. Lensa 16 mm, berkekuatan l0x.
2. Lensa 4 mm, berkekuatan 40x
3. Lensa 1,8 mm, berkekuatan 100x (bantuan minyak imersi untuk menghindari
hilangnya cahaya)
Angka 16, 4, 1,8 adalah jarak fokus setiap lensa terhadap titik fokus setiap
lensa objektif. Angka 10. 40, 100 adalah daya pembesaran. Jarak fokus adalah jarak
dari titik pusat lensa terhadap titik fokus. Makin pendek jarak lensa objektif,
makin pendek pula jarak antara lensa dan preparat. Perbesaran total diperoleh
dengan mengalikan pembesaran objektif dengan petnbesaran okuler (40 X1 0 =
400).
Perbesaran yang dicapai oleh suatu mikroskop majemuk adalah hasil kerja
dua sistem lensa. Lensa objektif dekat dengan mata.. Sistem lensa objektif
memberikan pembesaran mula-mula dan (menghasilkan bayangan nyata yartg kemudian
diproyeksikan ke atas lensa okluler. Bayangan nyata tadi, pada gilirannya,
diperbesar oleh okuler untuk menghasllan bayangan maya yang kita lihat, selain
perbesaran diperhatikan pula daya pisah yaitu kemampun suatu objektif untuk
memisahkan dua buah titik yang sangat berdekatan di dalam struktur pada suatu objek.
Jadi makin besar kemampuan suatu objektif makin kecil Jarak dua buah titik yang
berdekatan yang dapat dilihat secara terpisah dengan mikroskap itu.
Umumnya mikroskop sudah dilengkapi dengan lensa-lensa objektif
dengan kekuatan yang berbeda-beda dari mikroskop yang sama secara
bergantian diletakkan pada Posisi kerja, benda yang diamati tetap terfokus. Lensa-
lensa semacm Itu disebut "parfokal": yaitu objek yang diamati tetap terfokus tanpa anda
perlu menggerakkan tombol- tombol pengatur.
Kondensor adalah sistem lensa pengumpul cahaya yang memusatkan
cahaya yang tersedia pada preparat. Hal yang penting diperhatikan sebelum
menggunakan mikroskop:
a. Mikroskop yang akan digunakan diperiksa dahulu dan catat nomor rnikroskop
yang digunakan

17
b. Membawa mikroskop harus dalam posisi tegak dengan dua tangan untuk
diletakkan diatas meja.
c. Bersihkan mikroskop dengan lap halus, demiklan pula dengan lensa-lensanya.
d. Semua bagian mikroskop yang dilakukan penyetelan harus dengan hati-hati (misalnya
untuk memutar bagian kondensor)
e. Mulai dengan pembesaran kecil secara bertahap pindah ke perbesaran yang
lebih besar. Fokuskan preparat sebelum pindah ke perbesaran yang lebih
besar.
f. Pembesaran l00x harus di bantu dengan minyak imersi
g. Setelah digunakan semua bagian mikroskop dikembalikan pada posisi semula.

C. KEGIATAN PRATIKUM
a.) Alat dan Bahan
1. Alat-alat
a. Mikroskop cahaya
b. Kaca obyek dan kaca penutup
c. Pipet
d. Botol semprot
e. Jarum inokulasi
f. Lampu spiritus
g. Pinset
2. Bahan-bahan :
a. Roti dan tempe yang telah ditumbuhi jamur
b. Lactophenol cotton blue
c. Alkohol
d. Safranin
e. Kultur mikroba
b.) Cara Pemakaian Mikroskop
a. Letakkan mikroskop diatas meja (kira-kira seluas 4 jari dari tepi meja )
b. Nyalakan sumber cahaya pada mikroskop
c. Ambil preparat yang telah disediakan dan letakkan diatas meja preparat

18
d. Bukalah penuh diaf ragma iris dan naikkan kondensor sampai sama tinggi
dengan meja.
e. Aturlah lensa objektif berkekuatan rendah (10x) setelah objektif diletakkan
pada posisi kerja dan dengan tombol pengatur kasar, rendahkan lensa
tersebut atau menaikkan pengatur sampai lensa obyektif terletak 5-6 mm
dari preparat yang diamati
f. Atur letak lensa okuler dan putarlah pengatur sumber cahaya dengan memutar
filter kerapatan netral sehingga "frosted lense" terpasang pada tempatnya.
g. Fokuskan preparat di bawah kedua lensa supaya sel pada preparat terlihat
(putar tombol pengatur kasar). Lensa objektif tidak boleh menyentuh
permukaan kaca objek atau penutup untuk menghindari pecahnya kaca atau
tergoresnya lensa penutup.
h. Gerakkan pengatur pentas mekanis sampai preparat Anda terletak di tengah-
tengah. melalui pengalaman, Anda akan tahu bahwa akan membantu sekali
bila Anda menggerakkan pentas mekanis secara bersamaan dengan menyetel
jarak vertikal, karena kilasan bayangan yang melintasi medan akan
menujukkan bahwa lensa objektif ada dekat titik fokal. Pertajam fokus
dengan tombol pengatur halus. Mantapkan letak kepala Anda di atas
mikroskop sehingga Anda ada pada suatu ketinggian yang dapat menerima
jumlah berkas cahaya terbanyak dari okuler. Ini adalah titik tepat diatas okuler,
disebut titik-mata, yaitu tempat melintas berkas-berkas cahaya dalam batas terkecil
i. Setelah preparat terfokus dengan baik, pindahkan ke lensa pembesaran 40X.
Prinsip kerja sama dengan di atas hanya perlu diperhatikan bahwa
perbesaran 40X jarak kerja antara kaca objek dan lensa objektif sangat kecil,
jadi dalam memfokuskan tombol pengatur kasar diputar menjauhi preparat.
j. Pindahkan lagi ke lensa objek yang lebih besar yaitu perbesaran 100X Lensa ini
harus dibantu dengan minyak imersi. Ujung lensa ini sangat kecil dan hanya
sedikit cahaya yang dapat masuk, sebab itu diafragma iris kondensor harus
digunakan dalam kondisi terbuka penuh dan penghematan cahaya dilakukan
dengan bantuan minyak imersi. Prinsip kerja sama dengan di atas, gelas

19
 preparat ditetesi minyak imersi pada, bagian yang diamati sebelum itu tubus
dinaikkan terlebih dahulu.
k. Atur tubus dengan tombol pengatur fokus halus sehingga diperoleh bayangan
yang jelas. Lensa obyektif dibersihkan dengan kapas yang dibasahi xylol
setelah pemakaian minyak imersi.
l. Foto preparat yang terlihat dan catat perbesaran yang digunakan

D. HASIL PENGAMATAN :
1. Buatlah hasil pengamatan dari setiap kelompok mikroorganisme
(Bakteri, khamir, kapang, jamur, dan protozoa) yang anda temukan
2. Berikan keterangan setiap bagian dari tubuh mikroorganisme tersebut
pada gambar ddisertai fungsinya
3. Jelaskan peranan dari setiap mikroorganisme tersebut!
4. Buat kesimpulan sesuai tujuan penelitian

20
 BAB IV
BERBAGAI TEKNIK STERILISASI

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa dapat mengetahui macam-macam Teknik sterilisasi
2. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip sterilisasi alat dan bahan dengan
berbagai jenis metode sterilisasi

B. DASAR TEORI
Suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk
kehidupan terutama mikroba. Sterilisasi perlu dilakukan agar dalam praktikum
hanya biakan murni saja yang ada tanpa kantaminasi mikroba lain. Biakan murni
adalah biakan yang hanya terdapat satu spesies mikroba atau hasil perbanyakan
akan satu sel mikroba.

JENIS -JENIS STERILISASI

1. Sterilisasi dengan pemanasan

Ada empat cara yang sering digunakan
a. Sterilisasi dengan pemijaran
b. Sterilisasi dengan udara panas (kering)
c. Sterilisasi dengan uap panas
d. Steriliasi dengan air panas bertekanan

a. Sterilisasi dengan pemijaran

Dengan memijarkan pada api lampu spirtus (usahakan pada api bagian
tengah yang berwarna kebiruan). Dipakai untuk alat jarum inokulasi, ose atau alat
lain yang terbuat dari platina atau nikhrom.

b. Sterilisasi dengan udara panas (kering)

Sterilisasi dengan udara panas menggunakan alat yaitu oven (Hot Air
sterilizer). Sterilisasi untuk alat-alat gelas cawan petri dibungkus dengan kertas

21
(usahakan kerta tipis karena mempengaruhi waktu sterilisasi). Pipet yang akan
disterilkan pada ujung yang akan diisap disumbat kapas, selanjutnya pipet
dibungkus kertas. Volume pipet ditulis pada kertas pembungkus.

c. Sterilisasi dengan uap air panas

Bahan bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan
udara panas yang kering. Untuk sterilisasinya, yang paling baik ialah dengan
menggunakan uap air panas, Bahan-bahan yang disterilkan dengan cara ini pada
umumnya medium kultur yang tidak tahan terhadap panas yang tinggi.. Alat
yang digunakan untuk sterilisasinya ialah Arnold steam sterilizer.
Pada umumnya sel-sel vegetatif mikroba mati pada temperatur 100°C
dalam keadaan lembab Dalam praktek sterilisasi,dengan menggunakan Arnold
steam sterilizer, dilakukan sebagai berikut: mula-mula bahan-bahan disterilkan
dengan menggunakan temperatur l00°C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel
vegatatif mikroba. Kemudian yang telah disterilkan tingkat pertama itu pada
temperatur kamar selama 24 jam untuk memberikan kesempatan tumbuhnya
spora-spora. Selanjutnya dilakukan sterilisasi yang kedua pada temperatur 100°C
selama 30 menit, Untuk meyakinkan kesterilan bahan-bahan yang disterilkan
dengan Arnold steam sterilizer, maka bahan-bahan tersebut diinkubasikan pada
temperatur kamar selama 24 jam dan setelah Itu dilakukan sterilisasi lagi pada
temperatur 100 C selama 30 menit.

d. Sterilisasi dengan uap panas bertekanan

Alat yang digunakan adalah otoklaf (Autovlave). Prinsip kerja autoklav
adalah sama dengan “Pressure Cooker” ketika molekul air menjadi panas, maka
daya penetrasinya menjadi bertambah.

2. Pasteurisasi
Cara ini biasa digunakan untuk larutan-larutan yang mudah rusak apabila
terkena panas yang terlalu tinggi, misalnya susu. Pasteurisasi dilakukan dengan
cara memanaskan bahan pada suhu 63°C selama 30 menit dan selanjutnya cepat-

22
cepat didinginkan atau dipanaskan pada 71,6-80°C selama 15-30 detik kemudian
didinginkan.

3. Tyndalisasi
Sterilisasi ini dilakukan pada suhu 100°C dan harus diulangi 3 kali
berturut-turut dengan selang waktu satu hari. Cara Ini juga disebut sebagai
sterilisasi discontinu atau sterilisasi bertahap. Dandang dapat digunakan sebagai
pengganti otok1af.

4. Penyaringan
Cara ini diperlukan jika bahan yang akan disterilkan berupa larutan yang
bersifat termolabil, yang akan rusak atau terurai pada suhu tinggi, contoh:
antibiotik, asam amino, vitamin, senyawa gula, dan lain-lain. Untuk sterilisasi
larutan-larutan tersebut dilakukan penyaringan dengan nnenggunakan filter yang
mempunyai pori-pori sangat halus, Pompa vakum digunakan untuk menyedot
sehingga larutan akan melewati filter dengan lancar.
5. Sterilisasi dengan disinfektan
Desinfektan adalah suatu bahan kimia, biasanya berbentuk larutan, yang
mempunyai sifat mampu membunuh sel vegetatif mikroorganisme, tetapi tidak
membunuh endospora. Contoh disinfektan misalnya, H 2O2, O3, HgCl, formalin
4%. Penggunaan desinfektan Semuanya digunakan pada permukaan meja kerja.

C. PROSEDUR KERJA :

1. Alat-alat yang sudah disiapkan pada praktikum dilakukan sterilisasi sesuai

dengan jenis alat tersebut. Mulai dari ose, jarum preparat, tabung reaksi,
cawan petri, pipet isap, dan lain-lain. Sebelum itu alat-alat tersebut dibungkus
dengan kertas atau aluminium foil.
2. Meja dibersihkan dengan desinfektan sebelum melakukan pekerjaan
mikrobioiogi.
3. Catat semua data sterilisasi misalnya waktu sterilisasi, suhu, alat untuk
sterilisasi.

23
D. HASIL PRAKTIKUM

1. Jelaskan mengapa proses sterilisasi pada bidang mikrobiologi sangat

penting?
2. Gambarkan semua peralatan sterilisasi yang tersedia di laboratorium
disertai bagian-bagian, prinsip kerja dan penggunaannya
3. Tulislan semua bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi,
kelompokkan bahan yang termasuk antiseptic dan desinfektan

24
 BAB V
MEDIUM DAN CARA PEMBUATAN MEDIUM

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mempelajari cara pembuatan medium untuk pertumbuhan
mikroorganisme
2. Mengetahui jenis-jenis medium untuk pertumbuhan mikroorganisme.

B. DASAR TEORI
Medium ialah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai
untuk menumbuhkan Mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, medium
dapat digunakan pula untuk Isolasi, memperbanyak pengujian sifat-sifat fisiologi
dan perhitungan jumlah mikroba.
KLASIFIKASI MEDIUM
Medium dapat dlklasifikasikan berdasarkan atas susunan kimia,
konsistensi dan fungsinya.
1. Klasifikasi medium berdasarkan susunan kimianya.
a. Medium anorganik, yaitu medium yang tersusun dari bahan-bahan
anorganik.
b. Medium organik, yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik.
c. Medium sintetik, yaitu medium yang susunan kimianya dapat diketahui
dengan pasti medium ini biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan
makanan mikroba.
d. Medium non sintetik, yaitu medium yang susunan kimianya tidak dapat
ditentukan dengan pasti medium ini banyak digunakan untuk menumbuhkan
dan mempelajari taksonomi mikroba
2. Klasifikasi medium berdasar konsistensinya
a. Medium cair (liquid medium), yaitu medium yang berbentuk cair.
b. Medium padat (solid medium), yaitu medium yang berbentuk padat.
Medium ini dapat berupa medium organik (alamiah) misalnya. medium

25
 wortel, medium kentang dan lain-lain, atau medium ini dapat dibuat tegak
atau miring (misalnya medium-agar tegak, medium agar miring).
3. Klasifikasi medium berdasarkan fungsinya
a. Medium diperkaya (enriched medium), yaitu medium yang ditambah zat-zat;
tertentu (ralsainya serum, darah, ekstrak tumbuh-tumbuhan dan lain-lain),
sehingga. dapat digunakan untuk mermmbuhkanmikroba heterotrop tertentu.
b. Medium selektif (selective medium), yaitu medium yang ditarobah zat kimia
tertentu yang bersifat 5(efektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba
lain,biasanya medium yang mengandung crystal violet pada kadar tertentu
dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi
pertumbuhan bakteri gram negatif.
c. Medium difrensiasi (differesential medium), yaitu medium yang ditambah zat
kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan
atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat membedakan tipe-
tipenya misalnya medium darah agar dapat dipakai untuk mecnbedakan
bakteri hemolitik dan non- hemolitik
d. Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susunan tertentu
yang digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam-asam amino,
antibiotik, dan lain lain
e. Medium untuk perhitungan jumlah mikroba, yaitu medium spesifik yang
digunakan untuk menghitung jumlah bakteri , Aktinomicetes dan lain-lain.
f. Medium khusus, yaitu medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba
dan kemampuannya untuk mengailakan perubahan-perubahan kiroiai
tertentu. Medium dibedakan juga atas medium alamiah, semi alamiah.
Medium alamiah terdiri bahan alam, sedangkan medium semi alamiah
merupakan paduan antara bahan alamiah dengan senyawa kimia (contoh:
PDA).

CARA MEMBUAT MEDIUM

26
 Untuk membuat medium yang tersusun atas beberapa bahan adalah
sebagai berikut:
1. Mencampur bahan-bahan, garam-garam dan bahan-bahan lain dilarutkan
dalam aquadest kemudian dipanaskan dalam penagas air supaya homogen.
2. Menyaring medium beberapa jenis medium kadang-kadang perlu disaring,
sebagai penyaring dapat digunakan kertas filter, kapas atau kain. Untuk
medium agar atau gelatin penyaringan harus dilakukan sewaktu medium masih
panas.
3. Menentukan dan mengatur pH, penentuan pH suatu medium cair dapat
dilakukan secara kalorimetri menggunakan kertas indikator universal dan
komparator blak atau potensiometri menggunakan pH meter.
4. Sterilisasi medium ke dalam tempat tertentu, sebelum disterilkan medium
dimasukkan ke dalam tabung steril atau tempat-tempat lain yang steril
kemudian ditutup kapas dan bagian kapasnya dibungkus kertas sampul (kertas
perkamen) supaya jangan basah sewaktu disterilkan. Medium dimasukkan ke
dalam tabung reaksi sebanyak h ml untuk medium agar miring, 10 ml untuk 2
medium agar tsnjak, atau volume untuk erlenmeyer. Pada tabung atau
erlenmyer disumbat. dengan kapas kuat tapi mudah dibuka dengan jari
kelingking.
5. Sterilisasi medium, cara sterilisasinya tergantung pada medium. Dalam
medium pertumbuhan mikroba perlu memperhatikan nutrien utama yang
dibutuhkan mikroorganisme tersebut. Sama halnya makhluk hidup lain
memerlukan air, karbon, sumber energi, mineral, dan faktor tumbuh.
Sumber air :
Digunakan aquadest, bukan air sadah kran mengandung kadar Ca dan Mg
yang tinggi.
Sumber Karbon
Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi
menjadi dua kelompok, Organisme yang cepat mensintesis semua komponen
selnya dari karbon dioksida disebut Autototrof, Sedangkan organisme yang
memerlukan satu atau lebih senyawa organik sumber karbonnya disebut

27
heterotrof. Namum disamping sumber karbon organik heterotrof juga
memerlukan karbon dioksida, Macam karbon organik yang diperlukan satu
macam senyawa sederhana seperti asam asetat, ada pula yang memerlukan
sepuluh macam atau lebihb senyawa organik dari yang sederhana sampai
kepada yang kompleks.
Autototrof dan heterotrof dikelompokkan lebih jauh pada sumber energi
Autotrof yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari dengan bantuan
pigmen fotosintetik disebut Fotoautrof (autotrof fotosintetik), sedangkan yang
memperoleh energi dari oksida, senyawa-senyawa anorganik sederhana
(seperti nitrit, nitrat, atau sulfida) disebut Kemoautofof (autotrof kemosintetik)
yaitu memerlukan sumber energi organik seperti glukosa atau asam-asam
amino, agar kedua tipe kemosintetik tersebut di atas, jumlah komponen
penghasil energi dalam medium biasanya sekitar O,5. Hanya sedikit saja
bakteri yang tergolong kedalam kelompok fotoheterotrof (heterotrof
fotosintetik). Organisme dari kelompok ini mempunyai pigmen fotosintetik
sehingga dapat menianfaatkan energi cahaya matahari namum memerlukan
number organik seperti alkohol.
Sumber nitrogen
Bagi organisme autotrof ialah senyawa anorganik dapat juga berupa
senyawa organik, sedangkan bagi heterotrof dapat berupa asans amino atau
senyawa-senyawa protein intermediat seperti peptida, proteosa, dan pepton.
misalnya, pada kaldu nutrien (Nurtrien Broth) yang banyak diperlukan untuk
menurabuhkan hetertrof, nitrogen diperoleh dari ekstrak daging dan pep ton .
Sumber energi
Sumber energi lain misalnya, beberapa unsur logam seperti natrium,
kalium, kalsium, magnesium, mangan, seng, tembaga, fosfor, dan kobalt untuk
pertumbuhannya yang normal. Demikian, pula bakteri jumlah yang diperlukan
amat sedikit.

Faktor tumbuh

28
 Faktor tumbuh ialah komponen selular esensial yang tidak dapat
disentesis sendiri oleh suatu organisme dari sumber dasar karbon dan
nitrogennya. Komponen sel yang dimaksud dapat berupa asam-asam amino
atau vitamin. Bagi banyak heterotrof, kebutuhan akan faktor tumbuh sudah
dapat dipenuhi oleh ekstrak daging atau kaldu nutrien, Namun bagi patogen-
patogen yang rewel (fastidious) diperlukan medium yang rumit seperti agar
darah untuk penyediaan faktor turnbuh yang diperlukan.

pH (kadar keasaman)
Bakteri tumbuh baik pada pH sekitar 7, berbeda dengan fungi yang
lebih menyukai suasana asam. Medium atau reagen yang digunakan harus
diukur kadar pH-nya.

C. KEGIATAN PRAKTIKUM
a.) Alat
- Erlemmeyer - autoklaf
- Gelas ukur - magnet stirer
- Pipet volum - Timbangan
- Tabung reaksi + rak tabung
b.) Bahan
- Aquadest - Pepton
- Agar - Kentang
- ekstrak daging - Asam Tartrat
- dekstrosa - Kapas dan Aluminium Foil
- Medium instan NB, NA, PDA dan PCA
c.) Cara Kerja :
Percobaan 1. Penyiapan Medium Kaldu Nutrisi ( Nutrient Broth)
1. Dengan menggunakan timbangan analitik, kertas timbang atau alumunim foil
serta gelas ukur, siapkan 0,5 g pepton, 0,3 g ekstrak daging dan 100 mL
akuadest.
2. Larutkan semua zat bahan medium satu-persatu kedalam 50 mL aquadest
pada erlemmeyer 250 mL, aduk sambil dipanaskan hingga semua larut.

29
3. Tambahkan dengan sisa akuades hingga volume medium 100 mL.
4. Setelah semua bahan larut, dinginkan, tutup dengan kapas dan aluminium
foil, ikat dengan karet
5. Bandingkan dengan medium NB instan, bandingkan komposisinya

Percobaan 2. Penyiapan Medium Agar Nutrisi ( Nutrient Agar)

1. Ulangi langkah-langkah pembuatan kaldu nutrisi cair.
2. Medium kaldu nutrisi cair tersebut ditambahkan 1,5 g agar. Aduk-aduk
sambil dipanaskan hingga agar benar-benar larut (warna medium menjadi
jernih).
3. Tuangkan masing-masing 10 ml medium ke dalam 6 tabung reaksi bersih
untuk agar cawan, dan 5 ml ke dalam 8 tabung reaksi untuk agar miring dan
agar diri, tutup dengan kapas dan aluminium foil, ikat dengan karet.
4. Medium agar nutrisi siap untuk disterilkan menggunakan autoklaf sesuai
petunjuk asisten.
5. Bandingkan dengan medium NA instan, bandingkan komposisinya

Percobaan 3. Penyiapan medium agar kentang (Potato Dextrose Agar)

1. Siapkan 25 g kentang yang telah bersih dan dipotong-potong dadu, 2 g
dektrosa, 1,5 g agar, 1,4 ml asam tartarat dan 100 ml aquades.
2. Rebuslah kentang dalam 100 ml aquades selama 2 jam sejak mendidih,
volume aquades dijaga supaya tetap.
3. Ambil air rebusan kentang dengan menyaring potongan-potongan
kentangnya menggunakan kain kasa.
4. Tambahkan air rebusan kentang dengan dextrosa dan asam tartat aduk hingga
merata.Tambahkan 1,5 g agar, sambil diaduk dan dipanaskan hingga agar
melarut sempurna dan medium berwarna bening.
5. Masukan masing-masing 10 ml medium ke dalam 6 tabung reaksi bersih
untuk agar cawan dan 5 ml ke dalam 8 tabung reaksi untuk agar miring.

30
 Sumbat mulut tabung dengan kapas dan lapisi aluminium foil, ikat tabung
dengan karet.
6. Medium agar kentang siap untuk disterilkan menggunakan autoklaf sesuai
petunjuk asisten.
7. Bandingkan dengan medium PDA instan, bandingkan komposisinya

D. HASIL PRAKTIKUM
1. Jelaskan fungsi medium NB,NA dan PDA
2. Tuliskan komposisi masing-masing medium tersebut dan jelaskan
fungsinya
3. a).Jika Agung akan membuat media NA instan sebanyak 120 mL,
hitunglah berapa gram media NA yang harus dibutuhkan Agung!
b). Arisa memiliki media PDA instan sebanyak 39 gram dan dilarutkan
dalam 1000 ml aquades, jika Arisa hanya memiliki media PDA instan
sebanyak 5,46 gram. Berapa mL aquades yang dibutuhkan Arisa untuk
melarutkan media PDA tersebut ? Hitunglah!

31
 BAB VI
ENUMERASI MIKROORGANISME

A. TUJUAN PRAKTIKUM

1. Mengetahui cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis

2. Mengetahui teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba
3. Mengetahui metode penghitungan jumlah mikroba Total Plate Count
4. Mengamati morfologi koloni mikroba pada media

B. DASAR TEORI

1. TEKNIK PENGAMBILAN SAMPEL DAN PENGENCERAN

Sampel yang akan dilakukan harus dapat dianalisa lebih dahulu misalnya
sampel tersebut berbentuk cair atau padat, sampel tersebut masih segar atau sudah
merupakan produk olahan, kemudian faktor pengemasan perlu pula diperhatikan
apakah jenis kemasan dari plastik, kaleng atau dibungkus kertas atau kotak.
Sampel yang diambil haruslah diperhatikan faktor lot dan berapa banyak
unit sampel. Hal yang penting adalah bahwa sampel tersebut dapat mewakili
jumlah sampel yang akan diperiksa, sebenarnya semakin banyak jumlah sampel
maka diharapkan jumlah yang diambil sudah cukup besar untuk mewakili jumlah
sampel.
Kriteria sampel ini sangat perlu diperhatikan karena pengujian yang akan
dilakukan tidak dapat mendeteksi semua jenis mikroba yang tumbuh. Uji
mikrobiologi yang dilakukan terhadap suatu sampel sangat dipengaruhi oleh
tingkat bahaya mikroorganisme yang terdapat di dalamnya dan cara

32
penanganannya. Pemilihan mikroba uji sangat perlu untuk mempertimbangkan
perlakuan pengolahan dan penyimpanan, kebusukan yang mungkin terjadi, umur
sampel, jenis kandungan nutrisi sampel, serta catatan mengenai kasus keracunan
yang pernah terjadi pada sampel.
Sampel yang diambil diperkirahkan mengandung lebih dari 300 sel
mikroba per ml, per gram atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan
pengenceran sebelum ditambahkan pada medium agar di dalam cawan petri
tersebut di dalam jumah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik diantara
30 – 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1: 10, 1: 100, 1:

1000 dan seterusnya.

2.

Pengambilan contoh dilakukan secara aseptik dan pada setiap

pengenceran dilakukan pengocokan kira-kira sebanyak 25 kali untuk
memisahkan sel-sel mikroba yang bergabung menjadi satu.
Dalam melakukan pengenceran maka digunakan pengencer aquades steril,
NaCl fisiologis, air pepton 0,1 %, 1 % atau larutan ringer. Sampel cair

33
 biasanya langsung dapat dilakukan pengenceran sedangkan untuk sampel
padat masih perlu dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan mortal
atau blender. Untuk sampel telur biasanya proses pengocokan dibantu
dengan butir butir gelas steril.

3. ENUMERASI MIKROBA
a. Perhitungan Mikroskop Secara Langsung
Dalam hal ini dapat dilakukan perhitungan untuk mengetahui jumlah sel
(bakteri) dan massa sel (golongan) berfilamen misalnya kapang.dengan
perhitungan langsung ; jumlah sel dapat ditentukan langsung dengan bantuan
mikroskop

Alat yang sering digunakan adalah dengan “colony counter” dalam cawan
atau dengan hemasitometer. Ada beberapa keuntungan dan kelemahan
menggunakan hemasitometer.
Keuntungan : Pelaksanaan cepat, tidak memerlukan banyak alat
Kelemahan :
1. Tidak membedakan sel hidup dan sel mati
2. Sulit menghitung sel bakteri ukuran kecil karena tidak dapat dibantu
dengan minyak imersi ( lensa obyektif 100x)
3. Sel berkumpul (tidak terlihat sel-sel individu). Untuk itu dibantu dengan
Tween 80 1% (bahan anti gumpal)

b. Jumlah Total Mikroba (Standar Plate Count=SPC)

Salah satu metode hitungan total mikroba adalah dengan menggunakan
metode hitungan cawan. Dalam metode hitungan cawan yang diamati adalah
mikroba yang tumbuh pada medium dan membentuk koloni yang dapat
diamati langsung.
Dalam metode ini dapat digunakan dua teknik yaitu metode tuang dan
metode sebar. Pada metode tuang dari pengenceran dimasukkan 1 ml ke

34
dalam cawan petri dan selanjutnya dituang 15 – 20 ml medium, jika
menggunakan metode sebar maka medium pertumbuhan dituang ke dalam
cawan dan setelah medium memadat lalu sampel yang telah diencerkan
sebanyak 0,1 ml dituang dan diratakan dengan batang gelas/drigalsky
pastulat.
Cara menghitung koloni:

Jumlah koloni per mL/g = jumlah koloni per cawan x 1/ faktor pengenceran

Faktor pengenceran = pengenceran x jumlah yang ditumbuhkan

Catatan : 1 mL larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1 gram
Standar perhitungan:
Standar yang digunakan adalah Standart Plate Count
Cara menghitung koloni:
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah
koloni antara 30 -300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan,
dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan rantai koloni yang Nampak sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
Peraturan dalam melaporkan data:
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka
pertama (satuan) dan angka kedua (decimal). Jika angka yang
ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu
angka lebih tinggi pada bagian kedua.

Jumlah koloni per pengenceran SPC

Keterangan
10 -2
10-2 10-3

234 28 1 2,3.104 28 dan

1<30

35
 700 125 10 1,3.105
700>300; 10<30
TBUD TBUD 197 2,0.106
TBUD>300

2. Jika pada semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan

menghasilkan koloni 30 koloni pada cawan petri, berarti
pengenceran yang dibuat terlalu tinggi. Oleh karena itu jumlah
koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitunga. Hasil
dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di
dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran SPC

Keterangan
10-2 10-2 10-3

16 1 0 3,0.103 hitung
pengenceran 10-2
(1,4.103)

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan

menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti
pengenceran yang dibuat terlalu rendah. Oleh karena jumlah koloni
pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya
dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di
dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran SPC

Keterangan
10-2 10-2 10-3
TBUD TBUD 355 >3,0.106 (3,6.106) Hitung
pengenceran 10-4
TBUD 325 20 >3,0.105 (3,3.105) Hitung
pengenceran 10-3

36
4. Jika pada cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni
dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil
tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil
atau sama dengan dua, dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut
dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dua,
yang dilaporkan hanya hasil terkecil.

Jumlah koloni per pengenceran SPC Keterangan

10-2 10-3 10-4

293 41 4 3,5.104 Hitung rata2 karena

41000/29300 = 1,4 (<2)
140 32 2 1,4.104 Hitung pengenceran 10-2
karena
3200/14000=2,3 (>2)

5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah
satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat pengenceran yang
menghasilkan kedua cawan (duplo) dengan koloni antara 30 -300.
Jumlah koloni per pengenceran SPC Keterangan
10-2 10-2 10-3

175 16 1 1,9.104 Rata-rata dari pengenceran 10-2

208 17 0
138 42 2 1,5. 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2
karena
162 43 4 Perbandingan antara
pengenceran 10-3 dan
10-4 adalah 2
290 36 4 3,1.10 4
Rata-rata dari pengenceran 10 -2
dan 10 -3

280 32 1 karena perbandingan antara

kedua pengenceran
adalah 1,2
291 25 3 3,0.10 4
Rata-rata dari pengenceran 10-2
meskipun 305>
305 27 0 300 (angka yang lain <30)

37
 Ket : TBUD = terlalu banyak untuk dihitung.

c. Perhitungan Jumlah Total Koliform Metode Most Probable Number

(MPN)
Perhitungan jumlah total koliform sama halnya dengan perhitungan jumlah
total koloni cawan, hanya menggunakan media cair serta diperuntukkan bagi
kelompok mikroba koliform yaitu bakteri Enterobacteriacae dimana kehadiran
bakteri ini merupakan indicator pencemaran.
Bakteri koliform dibedakan atas fekal (E.coli) dan non fekal (E.aerogenes).
Metode MPN ini adalah metode fermentasi pada tabung ganda. Pengamatan
dilakukan pada perubahan warna medium pada tabung (hijau menjadi kuning),
pembentukan gas, atau kekeruhan. Setiap pengenceran dapat dilakukan dengan 3
atau 5 seri tabung.
Cara perhitungan MPN adalah :

1
MPN Count = Nilai MPN dari Tabel x
pengencerantabung tengah

Contoh:
Menghitung bakteri yang dapat memfermentasi laktosa menggunakan
Lactose Broth ditandai dengan timbulnya kekeruhan setelah inkubasi
Catatan : untuk media lainnya dapat digunakan tabung MPN tanpa

tabung Durham, dimana tabung positif

38
Gambar. Contoh cara melakukan metode MPN menggunakan tabung
Durham

39
Tabel Nilai MPN
Tabel MPN seri 9 Tabung
Jumlah tabung positif Jumlah tabung positif
Seri A Seri B Seri C MPN˟ Seri A Seri B Seri C MPN˟
0 0 0 <0.03 2 0 0 0.091
0 0 1 0.03 2 0 1 0.14
0 0 2 0.06 2 0 2 0.20
0 0 3 0.09 2 0 3 0,26
0 1 0 0.03 2 1 0 0.15
0 1 1 0.061 2 1 1 0.20
0 1 2 0.092 2 1 2 0.27
0 1 3 0.12 2 1 3 0. 34
0 2 0 0.062 2 2 0 0.21
0 2 1 0.093 2 2 1 0.28
0 2 2 0.12 2 2 2 0.35
0 2 3 0.16 2 2 3 0.42
0 3 0 0.094 2 3 0 0.29
0 3 1 0.13 2 3 1 0.36
0 3 2 0.16 2 3 2 0.44
0 3 3 0.19 2 3 3 0.53
1 0 0 0.036 3 0 0 0.23
1 0 1 0.072 3 0 1 0.39
1 0 2 0.11 3 0 2 0.64
1 0 3 0.15 3 0 3 0.95
1 1 0 0.073 3 1 0 0.43
1 1 1 0.11 3 1 1 0.75
1 1 2 0.15 3 1 2 1.20
1 1 3 0.19 3 1 3 1.60
1 2 0 0.11 3 2 0 0.93
1 2 1 0.15 3 2 1 1.50
1 2 2 0.20 3 2 2 2.10
1 2 3 0.24 3 2 3 2.90
1 3 0 0.16 3 3 0 2.40
1 3 1 0.20 3 3 1 4.60
1 3 2 0.24 3 3 2 11.00
1 3 3 0.29 3 3 3 >24.00

˟ = nilai MPN dikalikan dengan 1/pengenceran dari nilai yang ditengah

40
I. ISOLASI BAKTERI PADA BAHAN PANGAN
1. Isolasi dan identifikasi Salmonella
Preenrichment
Laktosa Broth (pengenceran 1:10), 35oC, 24 jam

Enrichment

Tetrahionat Broth
Selenit Cystein Broth Atau 35oC, 24 jam
35oC, 24 jam

Seleksi

Briliant Green Agar Bismuth Sulfit Agar SS Agar

35oC, 24 jam 35oC, 24 jam 35oC, 24 jam

Merah muda,
Konveks, gelap Tidak warna, coklat,
transparan
merah muda,
kekuningan

Identifikasi

Uji penduga (TSIA dan LIM)

35oC, 24 jam

Uji Urease (penguat) 35oC, 15, 30, 60 jam

Urea menjadi ammonia, indikator fenol merah
ungu tua

Uji Lengkap
(Uji Biokimia dan Serologi

41
Tabel. Reaksi Enterobacteriaceae pada TSIA dan LIM
Agar TSIA Medium LIM
Nama bakteri
Atas bawah Gas H2S Lysine Indol Motil
Salmonella typhi K A - +L + - +
S. paratyphi A K A + (-) - - +
Salmonella -
Lainnya
K A + + (-) - +(-)
S. paratyphi B
+
S. paratyphi C
(-)
Dan sebainya K A -˟˟˟ - v -
˟˟
A(K) A + +(-) + +(-)
Shigella A A (-) - v -
Escherichia K A - - + + +
Yersinia K(A) A + - - v +
enterocolitica A A + - + - -
Edwardsiella A A + + v - +
Citrobacter K A + v + - +
Klebsiella K/A A + - + - +
Enterobacter K/A A v - - v +
Hafnia K A v - - + +
Serratia v -
Protcus +(-)
Erwina -
Vibrio cholera A A - - + + +
V. K A - - + + +
natahaemolyticus
Keterangan:
Pada agar TSIA: K= alkali (merah); A = asam (kuning); H 2S + = hitam; + L= positif
lemah;
V= reaksi bervariasi.
Pada medium LIM : lysine dekarboksilase – (kuning); lysine dekarboksilase +
(ungu)
˟, Zen-Yoji, et all (1976).
˟˟ S.sendal, S.abortus-aqui, S. gallinarum dan beberapa strain S.cholerae-suis
biasanya tidak
Memproduksi H2S.
˟˟˟ beberapa biotipe S. flexneri memproduksi gas dari glukosa.
˟˟˟˟ Reaksi di dalam media yang disuplementasi dengan 3% NaCl

42
 2. Isolasi dan identifikasi Staphylococcus

Contoh makanan
(Pengenceran 1:10)

Voges-Johnson Agar Pemupukan Baird-Parker Medium

Kecil, Hitam areal kuning Staphylococcus Agar 110 kuning Bulat, konveks, halus abu
kehitaman

Inkubasi 37oC,
48 jam

Koloni spesifik dihitung

Diinokulasikan pada
Brain Heart Infusion Broth
Atau Tryptose Phospate Broth

Inkubasi pada 37oC

24 jam

0,1 – 0,2 ml kultur

+ 0,3 – 0,5 ml plasma kelinci

Inkubasi pada 37oC

1 – 2 jam

Koagulasi
Koagulasi +

43
3. Isolasi dan identifikasi E.coli
Contoh makanan, pengenceran 1:10

Enrichment (35oC, 24 jam)

(pepton water, laktosa broth)

Pemupukan
35oC, 24 jam
EMBA Blood agar

Mac-Conkey Agar

TSIA, LIM, IMVIC

4. Isolasi dan identifikasi Vibrio

Contoh makanan, pengenceran 1:10 (3% NaCl)

Inokulasi ke dalam Glukosa Salt Teepol (GST) broth

Dalam 3 seri tabung MPN, 35oC, 18 jam

Inokulasi pada TCBSA 35oC, 18 jam

Koloni tipikal ditransfer ke

Medium Wagatsuma
Tryticase Soy Broth
TSIA

Uji motilitas inkubasi 24 jam. 37oC

Diamati terhadap:
- Reaksi kanagawa
- Motilitas
- Reaksi gram
-44 Reaksi biokimia
- Reaksi serologi
-
 5. Isolasi dan identifikasi Clostridium

Contoh Makanan

Diencerkan Spora tahan panas

1:5 s/d 1;10

E
n Tanpa Dipanaskan 80o C,
c dipanaskan 10 Menit
r 1-2 ml suspense
I pada medium
c “enrichment”
m
e
n
t

Dipanaskan
100oC, 60 menit

Uji Semi Kuantitatif pada 1 % Inokulasi pada

Neomicyn blood Agar atau media medium selektif
Uji selektif lainnya
Kuantitatif
dan seleksi
Inkubasi 37oC, 18-48 jam
(anaerobik)

Medium
sporulasi Identifikasi (Lihat Tabel 13)

identifikasi
Uji serologi

45
Tabel. Media yang digunakan untuk uji Clostridium

Pertumbuhan
Tahap Media
C. perfrigens
MPN/ Fuid thioglycollate cooked meat Kekeruhan menunjukan
“Enrichment” medium Diferential Reinforced pertumbuhan
clostridal medium

Seleksi/ Plate Count 1 % Neomycin Blood Agar Koloni bewarna hitam (2-3 mm)
dikelilingi oleh areal yang
Sulfite-polymyxin-sulfadiazine opaque
(SPS) Agar

Tryptose-sulfite-cycloserine (TSC)
Agar

Tryptose-Sulfite-Neomycin (TSN)
Agara

LAS medium (TSN + Laktosa + Na-

askorbat

Shahidi-fergusson perfringens
(SFP) Agar (Sulfite medium +
Kanamycin + polymyxin + Kuning
telur)

Identifikasi Iron Milk Fermentasi “stormy”

(penggumpalan + gas)

SPS-Egg Yolk Agar Reaksi negler (koloni hitam

dengan areal yang opaque)

Nitrate-motility Medium Non motil, mereduksi nitrat

(warna merah jika + naftilamin
dan asam sulfinat)

Media sporulasi Ellner’s medium Duncan & strong (DS) Medium

Pembentukan spora
Inkubasi dilakukan secara anaaerobik pada suhu 37 oC selama 18-48 jam

46
Percobaan I. Perhitungan Mikroorganisme Secara Langsung

a.) Alat dan Bahan :

1. Mikroskop
2. Hemasitometer
3. Pipet pasteur
4. Suspensi Saccharomyces cereviceae
b.) Cara Kerja :
a. Bersihkan permukaan lensa-lensa hemasitometer.
b. Tutup dengan kaca tutup hemasitometer
c. Ambil suspensi khamir dengan pipet pasteur sebanyak 0,1-0,5 mL.
Letakkan pada lekukan V pada tepi kaca tutup. Usahakan setiap ruang
dipenuhi suspensi.
d. Taruh hemasitometer pada mikroskop dan mulailah dengan obyektif
perbesaran 4 atau 10 kali. Hitung jumlah sel yang terdapat pada 80 buah
kotak kecil yang terletak di dalam kotak bagian tengah berukuran 1 mm itu
Hemositometer terdapat 9 ruang (masing-masing berukuran 1mm2).
Kotak tengah dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap kotak dibagi menjadi 16 kotak
kecil, Jadi jumlah total kotak kecil dalam kotak. di tengah adalah 400 (25x16).

penyangga kaca tutup Tempat menaruh sampel

Kedalaman sampel 0,61 mm

Gambar 4. Hemasitometer

Percobaan II. Perhitungan Mikroba Secara Tidak Langsung Dengan Metode SPC

Sebelum diilakukan perhitungan dibuat pengenceran bertingkat untuk

memperkecil jumlah suspensl mlkroba. Dalam metode ini dilakukan pengenceran

47
bertingkat dan untuk menentukan konsentrasi suspensi bakteri, Sampel yang telah
diencerkan dituang ke cawan (metode tuang) diatas media yang cocok. Inkubasi
24- 48 jam, amati koloni yang tumbuh dan yang diamati hanya koloni yang
berjumlah 30-300 koloni, Jumlah mik roorgainisme per ml sampel (TPC)
a.) Alat dan Bahan :
-Suspen si m ikr ob a
- 5 tabung pengenceran berisi 9 ml aquades steril
- 3 cawan peter i steril
- Medium nutrien agar,
- Pipet steril
b.) Cara Kerja :
1. Buat pengenceran suapensi bakteri sampai 10-5

2. Tanam dengan metoda tuang ke-3 cawan petri steril mulai dari pengenceran
10-3, 10-4, 10-5.
3. Inkubasi pada suhu 300 selama 24-48 jam.
4. Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh dari setiap pengenceran dan
hitung TPCnya (jumlah mikroorganisme per mL sampel)

Percobaan III. Metode Hitungan Bakteri Koliform Dengan Metode MPN

Metode MPN menggunakan medium cair dalam tabung reaksi ,

perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang
ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu..
Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan,
atau terbentuknya gas di dalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas,
Digunakan bentuk 3 seri pengenceran untuk pengenceran 10 sehingga ada 9 tabung
pengenceran.

48
Cara Perhitungan MPN.

Setelah inkubasi 24-48 jam dilihat pertumbuhan. Untuk setiap

pengenceran digunakan 3 seri tabung. Tabung yang positif dihitung misalnya dari
3 tabung pada 10 ada 2 yang positif. pada 10 ada 1 dan 10 ada 2 berarti
kombinasi nilai adalah 2, 1, 2,, kemudian dicocokkan dengan tabel yang
menunjukkan nilai MPN,

a) Alat dan bahan :

1. 9 tabung reaksi berisi Lactose Broth

2. Sampel air
3. Mikro pipet
4. Botol ampul
5. Tabung durham
6. Kapas dan alumunium foil
7. Auadest steril
b) Cara Kerja :
1. Buat seri pengenceran dari 10-1, 10-2, dan 10-3, masing-masing pengenceran
dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi tabung durham
Inkubasi pada suhu 300C selama 24-48 jam.
2. Amati perubahan yang terjadi yaitu timbulnya kekeruhan, terjadinya
perubahan warna, dan terbentuknya gas.

E. HASIL PRAKTIKUM
1. Mengapa pada proses isolasi perlu dilakukan proses pengenceran dari
sampel padat/cair?
2. Hitunglah jumlah koloni bakteri, khamir dan kapang pada cawan petri
dengan metode TPC
3. Hitungkah jumlah bakteri coliform menggunakan metode MPN
4. Jelaskan komposisi media yang digunakan pada tiap uji kualitas air
dengan metode MPN coliform!

49
5. Sebutkan perbedaan hasil uji yang positif dan negatif dari tiap-tiap uji
yang dilakukan!
6. Mengapa terbentuk gas dan terjadi perubahan warna pada proses
fermentasi media?
7. Berapakah standar baku mutu air (toleransi coliform) pada air minum
sesuai SNI? jika melebihi ambang batas apa yang terjadi pada orang
yang mengkonsumsi air tersebut?
8. Soal
Jika hasil pengujian pada air sumur dengan volume sampel sebanyak
1ml adalah 3 tabung yang positif, kemudian volume 0,1ml sampel 2
tabung yang positif, dan 0,01ml hanya 1 tabung yang positif.
Berapakah nilai indeks MPN/ml yang didapat?
Bandingkan dengan standart mutu air apakah air tersebut layak
dikonsumsi atau tidak. Jelaskan!

50
 BAB VII
KULTIVASI DAN ISOLASI MIKROBA

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mengetahui metode-metode untuk memisahkan mikroba tertentu dari
populasi campurannya untuk mendapatkan kultur murni
2. Mengetahui karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni.

B. DASAR TEORI
Populasi mikroorganisme dialam tidak terpisah menjadi spesies-spesies
tersendiri, melainkan merupakan populasi campuran dari berbagai
mikroorganisme atau disebut juga biakan campuran. Populasi campuran tersebut
dapat dipisahkan menjadi kultur murni yang mengandung hanya satu
mikroorganisme saja dalam laboratorium. Teknik pemisahan tersebut dikenal
sebagai teknik isolasi, gunanya untuk mempermudah pengamatan tehadap sifat-
sifat setiap jenis mikroorganisme yang diinginkan.
Isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba lain
yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Mengisolasi mikroba dengan cara
menumbuhkan (menanam) dalam medium padat. Hal ini karena dalam medium
padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya. Bila
kita mengisolasi dengan menggunakan medium cair, maka dilakukan dengan cara
pengenceran. Kemudian kita tumbuhkan dalam medium padat dan dibiarkan
membentuk koloni.
Dalam praktiukum akan dipelajari tiga cara untuk mendapatkan biakan murni
yaitu :
- Teknik cawan gores (Streak Plate)
- Teknik cawan sebar (Spread Plate)
- Teknik cawan tuang (Pour Plate)
Prinsip ketiga cara ini adalah pengenceran, sehingga akan diperoleh koloni
terpisah yang mengandung satu macam bakteri. Teknik cawan gores lebih
menguntungkan bila ditinaju dari segi ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan

51
keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Ada beberapa cara untuk
menggoreskan kultur pada agar cawan, yaitu :
- Goresan langsung
- Goresan kuadran
- Goresan radian

C. KEGIATAN PRAKTIKUM
a.) Alat
- Lampu spirtus
- Jarum inokulasi
- Cawan petri
- Tabung reaksi
- Inkubator dan refrigator
- Mikro pipet dan pipet volume
- Botol ampul
b.) Bahan
- Media steril (PCA, PDA, NA, NB)
- Aquadest

52
 - Alkohol 70%
- Sampel ( bakso, kecap, air sumur, es buah )
- Alumunium foil dan kapas

V.1. Isolasi mikroorganisme

Cara kerja

a. Sampel dihancurkan di dalam plastik dan dibuat pengenceran.

b. Pengenceran dibuat dengan cara menimbang sebanyak 10 g sampel yang
telah dihancurkan lalu diencerkan dengan NaCl 0,85% atau aquadest steril
sebanyak 90 mL sehingga diperoleh pengenceran 10-1.
c. Selanjutnya dari pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1mL dan
dimasukkan dalam tabung reaksi berisi 9 mL NaCl 0,85% steril untuk
memperoleh pengenceran 10 -2, dan seterusnya sampai pengenceran 10-6.
d. Isolasi mikroorganisme menggunakan PCA (plate Count Agar), bakteri
menggunakan medium NA (nutrient Agar), jamur menggunakan medium
PDA(Potato Dekstrosa Agar). Metode isolasi yang digunakan adalah
metode sebar (Surface Spread Plate).
e. Hitung jumlah koloni yang tumbuh didalam cawan petri dengan
menggunakan Standar Plate Count (SPC)

Biasanya setelah tahapan isolasi dilanjutkan dengan pengamatan pertumbuhan

koloni mikroba.Pengamatan pertumbuhan koloni mikroba terdiri dari 4 yaitu :

- Cawan petri
- Agar tegak
- Agar miring
- Nutrient cair

V.2. Teknik Pemurnian Kultur

a. Metode Gores ( Streak Plate)
1. Siapkan medium NA atau PDA pada cawan, beri label
2. Panaskan jarum inokulasi hingga pijar

53
 3. Buka tutup tabung kultur mikroba, dinginkan jarum inokulasi yang telah
dipanaskan dengan menempelkannya sejenak kedinding dalam tabung.
Ambillah mikroba kultur menggunakan ose bulat
4. Teteskan kultur mikroba dari jarum inokulasi tersebut kesalah satu tepi
permukaan agar nutrisi pada cawan petri secara aseptis
5. Gesek tetesan kultur bakteri menggunakan jarum inokulasi yang telah
dijarkan membentuk 4 garis inokulasi disalah satu tepi medium. Piojarkan
kembali jarum inokulsi
6. Sentuhkan ujung jarum inokulasi ke satu sudut hasil inokulasi pertama,
putar cawan 900, buat 4 garis inokulasi pada tepi sebelahnya. Ujung jarum
tidak lagi menyentuh daerah inokulasi pertama
7. Dengan cara yang sama, buat 4 garis ketiga dan keempat sehingga
terbentuk 16 garis inokulasi yang semakin sedikit jumlah bakterinya,
mengelilingi cawan petri
8. Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam
9. Amati pertumbuhan koloni bakteri yang terjadi pada masing-masing
daerah inokulasi
b. Metode Pengenceran Suspensi
b.1. Metode Tuang
1. Cairkan 10 ml medium agar nutrisi
2. Encerkan sampel yang akan diisolasi, dengan cara melarutkannya hingga
beberapa kali lipat (pengenceran berseri secara desimal) yaitu 1:10, 1:100,
1: 1000, dst
3. Dari pengenceran yang dikehendaki sebanyak 1 mL larutan tersebut
dipipet kedalam cawan petri steril
4. Tuangkan agar nutrisi yang telah dicairkan kedalam cawan petri tersebut,
putar cawan petri diatas meja dengan gerakkan seperti angka delapan
untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata.
5. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut diinkubasi dengan posisi
terbalik
6. Amati koloni mikroba yang terbentuk, bandingkan satu sama lain

54
 7. Masukkan kedalam tabel pengamatan
b.2. Metode sebar
1. Tuang kaldu cair kedalam cawan petri steril dan biarkan memadat
2. Teteskan suspensi sampel kedalam cawan petri yang telah berisi media
padat
3. Celupkan batang L kedalam alkohol 95% dan bakar sebentar dengan
lampu spirtus
4. Dinginkan batang L dengan menempelkannya sebentar kebagian dalam
cawan petri, lalu gesek tetesan suspensi mikroba pada permukaan medium
keatas dan kebawah sambil memutar petri. Lakukan hingga diperoleh
sebaran suspensi yang merata dan kering diseluruh permukaan petri
5. Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam
6. Amati koloni mikroba yang terbentuk, bandingkan satu sama lain dengan
membandingkannya pada buku acuan
7. Masukkan kedalam tabel pengamatan
V.3. Teknik Pemindahan Biakan
Tujuan praktikum ini adalah untuk menguasai teknik pemindahan biakan
bakteri dari satu wadah ke wadah lain, secara aseptik sehingga hanya biakan
murni yang diharapkan. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan seperti
diilustrasikan pada gambar dibawah ini :

Gambar 5.1. cara memegang tabung,

peganglah tabung yang berisi biakan
mikroorganisme; a) dan tabung yang berisi
biakan b) ditangan kiri. Peganglah jarum
inokulasi dengan tangan kanan

55
 Gambar 5.2. membuka kapas: buka kedua
tabung biakan dengan melepaskan sumbat
kapas menggunakan tangan kanan (lihat
demonstrasi asisten). Panaskan mulut tabung
dengan cara melewatkan diatas nyala api
sebanyak 2 kali. Hendaknya mulut tabung
berisi medium baru dipegang dengan posisi
agak condong terhadap meja kerja untuk
mengurangi kemungkinan kontaminasi dari
udara.
Gambar 5.3. memanaskan jarum inokulasi
sampai pijar. Dinginkan dalam larutan
alkohol 70% kemudian lewatkan kembali
diatas nyala api, atau sentuhkan pada
permukaan agar

Gambar 5.4. mengambil biakan;

pindahkan sedikit dari permukaan medium
tabung a) dan langsung sentuhkan
keprmukaan medium tabung b) jangan
menekan terlalu keras, karena berat jarum
inokulasi sudah cukup untuk
menempelkan mikroba

Gambar 5.5. Memanaskan kembali dan

menutup tabung biakan. Panaskan mulut
tabung seperti pada waktu membukanya.
Tutup kembali dengan sumbat kapas.
Bakar jarum inokulasi sampai pijar dan
letakkan ditempatnya

V . 4 . Pengamatan Mikroorganisme dan Berbagai Macam Medium

1. Medium agar tegak
Gambar dan beri keterangan tentang:
Pertumbuhan :
- Merata atau tidak merata; pertumbuhan, baik pada bagian permukaan atau
bagian dasar.
- Bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan:

56
 - Filiform,, echinulate, bead, villous, rhizoid, arbrescent.
2. Medium nutrien- agar miring
Gambar dan beri keterangan-keterangan tentang::
Pertumbuhan:
- Tipis, sedang, lebat, tidak ada bentuk pertumbuhan pada bekas goresan
Filiform, echinulate, beaded, spreading, arborescent, rhizoid, plumose.
- Elevasi
Flat, efuse, raised, convex.
- Kilat (luster):
Mengkilat, tidak mengkilat, cretaceous
- Tofografi:
Licin, tidak teratur, perrnukaannya bergelombang, contoured, wrinkled,
verrucose.
- Warna (Chromogenesis)
Merah, kuning, coklat, hijau, fluorescent,
- Bau
Tidak berbau, berbau
- Konsistensi
Slimy, butyrous, viscid, membranuos, brittle
- Warna medium :
Menjadi abu-abu, coklat, merah, biru, hijau tak terjadi perubahan warna
3. Medium nutrient-gelatin tegak
Gambar dan beri keterangan keterangan tentang:
- Pertumbuhan
Merata atau tidakmerata pertumbuhannya baik pada bagian permukaan,
atau bagian dasar.
- Bentuk Pertumbuhan Pada Bekas Tusukan
Filiform, beaded, papillate, villous, plumose, arborescent.
- Bentuk Pencairan Gelatin:
Crateriforrn, napiform, infudibuliform, saccate, stratiform, tak terjadi
pencairan lambat, pencairan lambat, atau pencairan cepat.

57
 - Warna medium:
Flourescent, menjadi cok1at, tak terjadi perubahan

4. Meum nutrient-cair
Gambar dan beri keterangan-keterangan tentang:
- Pertumbuhan dan Permukaan:
Ring, pellicle, flocullent, membranous , tak membentuk selaput.
- Kekeruhan:
Sedikit, sedang, hebat.
- Bau:
Tak berbau, berbau
- Endapan:
Kompak, bentuk dan ukurannya tidak tertentu, granuler (butir-butir),
berlapis-lapis (flaky), kental, banyak sekali, sedikit, tidak ada endapan .
6. Medium nutrien-agar taburan
Gambar dan beri keterangan-keterangan tentang:
- Pertumbuhan
Pertumbuhan koloni dipermukaan atau di bawah permukaan medium.
- Bentuk Koloni:
Punctiform, circular, f ilamenteus, irregular, curled, amoeboid, myceloid,
rhizoid.
- Permukaannya:
Licin, kasar, membentuk lingkaran- ingkaran yang konsenritrik, seperti
sisir yang radier (radiate),
- Elevasi:
Flat, effuse, raised, convex, umbonate.
- Bentuk tepi:
Entire, undulate, lobate, erose, filamentous, cu r1ed .
- Bentuk struktur dalam:
Amorf, butir-butir halus atau kasar, seperti fi1ament, curled, konsentrik .
7. Medium nutrien-gelatin secara taburan

58
 Pengamatannya seperti pada medium nutrient-agar secara taburan di
atas, dengan tambahan pencairan gelatin:
- Pencairan gelatin: Cup, saucer, merata.

D. HASIL PRAKTIKUM
1. Mengapa pada proses isolasi perlu dilakukan proses pengenceran dari
sampel padat/cair?
2. Apakah perbedaan prinsip dan cara kerja metode spread plate dan pour
plate?
3. Gambarkan dalam tabel morfologi koloni yang berhasil diisolasi!

59
 BAB VIII
PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROORGANISME

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mempelajari dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan bakteri
2. Mempelajari teknik pembuatan apusandalam pewarnaan bakteri
3. Mempelajari tata cara pewanaan sederhana, pewarnaan negatif dan
pewarnaan Gram

B. DASAR TEORI
1. Teknik Pengecatan Morfologi Bakteri
Secara aseptik, cat bakteri dapat dibedakan dari bahan organik yang
mengandung cincin benzena. Benzena ditambah gugus khromofor dan gugus
Auksokhrom.
Benzena : Senyawa tidak berwarna dan tidak berwarna
Khromofor : Terbentuk senyawa trinitrobenzena yang memberi warna pada
benzena
Auksokrom : Terbentuk senyawa asam pikrat dengan bakteri adanya auksokhrom
OH-
Cat bakteri adalah senyawa garam, cat ini dapat dibagi menjadi dua macam
yaitu cat basis dan cat asam tergantung pada muatan listrik cat.
1. Cat asam

60
 Cat yang ion catnya (khromofornya) adalah anion-anion dan kation-kationnya
Na+,K+,Ca++, NH4+. Asam pikrat adalah salah satu zat asam yang
menghasilkan khromogen anionik.
2. Cat basis
Yaitu garam-garam cat yang ion-ion cat (khoromofornya) adalah kation
(bermuatan +) misalnya methylene blue, safranin dan lain-lain. Sedang anion
pada umumnya ialah Cl-, SO4, asetat, oksalat.

Hal-hal yang penting dalam pengecatan :

1. Fiksasi
Fungsi fiksasi ialah :
a. Mencegah berkerutnya globula protein sel.
b. Mempertinggi sifat reaktif gugusan ( gugus karboksil, amino primer)
c. Merubah afinitas cat
d. Mencegah terjadinya autolisis cat.
e. Membunuh bakteri dengan cepat tanpa merubah bentuk dan struktur,
f. Melekatkan bakteri di atas gelas benda
g. Membuat sel lebih kuat.
Cara Fikasasi : Buat lapisan suspensi bakteri di atas gelas benda kemudian di
keringkan dan dilakukan beberapa kali di atas nyala lampu spirtus.
2. Substrat
Atas dasar macamnya cat yang diserap oleh sel dibedakan atas :
a. Sel yang basofi yaitu se1 yang dapat mengikat cat basa,
b. Sel yanq asidofil yaitu sel yang dapat mengikat cat asam.
c. Sel yang Sudanofil yaitu sel yang dapat mengikat cat yang dapat larut dalam
minyak .
3. Peluntur Cat.
Untuk mendapatkan kontras yang baik pada baik pada bayangan
mikrosikop.
Jenis peluntur cat :

61
 a. Peluntur cat yang lemah :alkohol, air, aseton, gliserin
b. Peluntur cat yang asam : HCl , H2SO4, HNO3
c. Peluntur cat yang basa: KOH, NaOH, sabun.
d. Garam logam berat : AgNO3, CuSO4
e. Garam logam ringan: Na2SO4 , MgSO4
4. Zat Mordan (Pengintensif Pengecatan)
Zat kimia menyebabkan sel bakteri dapat dicat lebih intensif atau
menyebabkan cat terikat lebih kuat pada jaringan sel

Jenis mordan
a. Mordan basa : FeSO4, kalium antimonium tartarat
b. Mordan Asam : asam tanin, asam pikrat, JKJ.
5. Cat Penutup
Untuk memberi kontras pada.sel yang tidak mengisap cat utama pada
akhir pengecatan dilakukan pengecatan lagi. Cat penutup : methylene blue,
Safranin, Erytrosin.
1.1 Pengecatan negatif
Pengecatan negatif menggunakan adalah cat asam seperti eosin atau
nigrosin. Pengecatan negatif dilakukan untuik mewarnai latar belakang preparat
dan bakteri Itu tidak berwarna.

C. KEGIATAN PRAKTIKUM
a.) ALAT DAN BAHAN
1. Biakan murni bakteri pada NAberumur 24 jam.
2. Larutan nigrosin
3. Gelas Objek
4. Jarum Ose
5. Alkohol 70% dan pembakar spirtus
6. Biakan murni bakteri pada NA berumur 24 jam.
7. Aquades steril
8. Larutan Kristal Violet

62
 9. Gelas objek
10. Jarum ose
11. Alkohol 70% dan pembakar spirtus.

b.) Cara Kerja :

1. Bersihkan gelas objek dengan alkohol 70%. agar bebas lemak.
2. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran kecil-besar.
3. Gambar dan catat apa yang diamati Pengecatan sederhana.

1. 2. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana adalah Pengecatan dilakukan dengan memakai satu
macam larutan cat. Sel bakteri akan berwarna sesuai dengan jenis cat yang
dipakai.
a.) Alat dan Bahan
1. Biakan murni bakteri pada NA berumur 24 jam.
2. Aquades steril
3. Larutan Kristal Violet
4. Gelas objek
5. Jarum ose
6. Alkohol 70% dan pembakar spirtus.
b.) Cara Kerja :
1. Buat preparat olesan bakteri lalu fikasasi dengan spirtus
2. Teteskan laruta kristal violet diatas preparat olesan tersebut sebanyak 1-2
tetes, biarkan 1-2 menit.
3. Cuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis, kemudian
keringkan dengan hati-hati memakai kertas isap.
4. Amati dibawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 970x atau
l000x, menggunakan minyak imersi.
5. Gambar dan catat apa yang diamati

1.3. Pengecatan tahan asam ( Ziehl -Neelsen Method)

63
 Pengecatan diferensial karena dapat membedakan bakteri "acid fast"
(tahan terhadap pencucian asam) dan yang non acid fast (tidak tahan terhadap
pencucian asam). Cat bahan asam dibedakan atas 3 reagents :xcat utama, karbol ,
fuchsin.
Karbol fuchsin berwarna merah lebih mudah larut dalam fenol dari pada
dalamair atau alkohol asam dan fenol lebih mudah larut: dalam lemak dari pada
dalam air. Bakteri tahan asam banyak mengandung lemak dan mudah menyerap
carbol fuchsin yang larut dalamfenol. Pada pencucian, karbol tuchsin dan fenol
sangat tahan karena sifatnya : sangat tahan terhadap zat pencuci.
Zat pencucian, Alkohol asam (37% HCl + 95% ethanol)

Cat penutup : Methylene Blue

a.) Alat dan Bahan:

1. Biakan muni bakteri dalam medium Nutrient-Agar miring umur 48 jam.
2. Larutan eat Ziehl-neelsen karbol fuchsin (ZN A), larutan peluntur alkohol
Asam (ZN B), larutan Loeffler methylene blue (ZN C).
3. Gelas Obyek
4. Aquadest steril
b.) Cara kerja :
1. Bersihkan gelas objek dengan alkohol hingga bas lemak kemudian
panaskan di atas nyala pembakar spirtus
2. Ambil secara aseptis aquades steril dan letakkan di atas gelas benda yang
telah bersih.
3. Ambil secara aseptis 1 ose biakan murni bakteri dan suspensikan kedalam
aquades steril yang telah di letakkan pada gelas objek, Ratakan suspensi
tersebut seluas ± 1 cm2.
4. Kering anginkan dan setelah kering dilakukan fiksasi di atas nyala
pembakar spirtus.
5. Letakkan preparat di atas suatu rak kemudian bubuhkan larutan cat warna
(ZN A) yang berlebihan dan panasi dengan nyala kecil pembakar spirtus

64
 selama 5-10 menit. Pada pemanasan ini dijaga jangan sampai cat menjadi
kering atau mendidih.
6. Preparat selanjutnya didinginkan, setelah dingin kemudian cuci denqan air
mengalir dan kering-anginkan.
7. Cuci dengan larutan peluntur (ZN B) sampai zat peluntur yang mengalir
tampak berwarna agak kemerah-merahan.
8. Cuci kernbali dengan air mengalir dan kering-anginkan.
9. Setelah kering bubuhkan larutan cat penutup (ZN C) selama 30 detik,
kemudian segera cuci dengan air menga1ir.
10. Kering-anginkan dan amati dengan mikroskop perbesaran kuat dengan
minyak imersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah,
sedangkan yang non acid fast berwarna biru.
11. Gambar hasi-hasil pengaaiatan, Beri keterangan mengenai bentuk sel,
warna dan reaksi pengecatan.
12. Ulangi pekerjaan 1—11 untuk biakan murni E. coli

1.4 Different “Gram”

Pengecatan ini mula-mula dikembangkan oleh Christian Gram (1884) dan
kemudian disemparnaka oleh ahli-ahli lain
Pengecetan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :
1. Pemberian cat utama (larutan cat crystal violet warna ungu).
2. Pengintensifan cat utama dengan menambahkan larutan mordan (JKJ)
3. Pencucian (deklorisasi )dengan larutan alkohol.
4. Pemberian cat penutup (cat lawan, counterstain) larutan cat safranin yang
berwarna merah.
Pengecatan Gram termasuk pengecatan diferensial (untuk membedakan)
karena dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram pasitif dan gram
negatif.
a. Bakteri gram positif, adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat,
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat

65
 lawan. Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini tampak berwarna biru
( Violet)
b. Bakteri gram negatif, ialah bakteri yang dayanya mengikat cat utama tidak kuat,
sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat 1awan,
Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini tampak berwarna merah.
Selain itu ada pula bakteri-bakteri yang bersifat gram variabel, Bakteri-
bakteri mempunyai sifat intermedier antara gram positif dan gram negatif, Bakteri
ini kadang-kadang bersifat gram positif, kadang-kadang bersifat gram negatif atau
pada suatu ketika ada yang bersifat gram positif dan ada pula yang bersifat gram
negatif.
Perbedaan sifat bakteri gram positif dan - gram neqgtif tidak mutlak tegas
dan spesifik. Tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat
menyebabkan variasi dalam pengecatan gram,Faktor-faktor tersebut antara lain
ialah :
1. Perubahan Keasaman. Apabila pH turun kemungkinan bakteri gram
positif dapat berubah menjadi gram negatif Sebaliknya apabila pH naik
ada kemungkinan bakteri-bakteri gram negatif dapat berubah menjadi
gram positif.
2. Penyimpangan cara pengecatan, misalnya pencucian yang terlalu lama
dengan alkohol dapat menyebabkan bakter-bakteri gram positif
memberikan hasil seperti gram negatif.
3. Faktor medium juga mempengaruhi misalnya bakteri-bakteri gram positif
yang lemah apabila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang
mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram
negatif.
4. Umur bakteri, bakteri-bakteri gram positif yang telah tua atau kekerangan
makan dapat berubah menjadi gram n egatif.
5. Perlakuan khusus, bak teri-bakteri gram positif yang bagian-bagian selnya (
macam-macam lemak, karbohidrat, protein) dihilangkan dengan
rnelarutkan dalam air panas, eter atau larutan ribonuklas dapat berubah

66
 menjadi gram negatif. Bakteri gram negatif apabila ditambah dengan
larutan pekat DNA dapat berubah menjadi gram positif misalnya E. Coli.

Mekanisme Pengecatan Gram

Sifat gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel
dan membran sitoplasmanya. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri-bakteri
gram positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks cat krlstal violet
dan yodium, sedang pada bakteri gram negatif afinitasnya sangat kecil. Perbedaan
sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma ini memegang peranan
penting dalam menentukan sifat gram, tetapi sampai berapa jauh pengaruh
tersebut belum diketahui dengan jelas. Lalu fikasasi dengan spirtus Pada waktu
pengecatan, larutan kristal violet dan yodium menembus sel-sel bakteri gram
positif maupun sel bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif zat-zat ini
membentuk saatu senyawa yang sukar larut, juga tidak larut dalam peluntur
(alkohol). Hal ini tidak terjadi pada sel bakteri gram negatif, akibatnya cat dapat
dilunturkan. Pada pemberian cat penutup (cat lawan) sel bakteri gram positif tidak
diwarnai,sedang sel bakteri gram negatif sehingga warnanya kontras terhadap cat
utama
a) Bahan dan Alat
1. Biakan murni pada medium NA yang berumur 24 jam.
2. Gelas objek.
3. Aquades steril
4. Larutan Hacker's krystal Violet (Gram A).
5. Larutan Mordan Lugol Iodine (Garam B)
6. Larutan alkohol aseton (Gram C).
7. Larutan Safranin (Gram D)
8. Jarum ose.
9. Alkohol 70% dan pembakar spirtus
b) Cara Kerja :
1. Siapkan preparat olesan bakteri, lalu fiksasi pada pembakar spirtus.

67
2. Teteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri biarkan
selama 1 menit
3. Cuci dengan air mengalir, keringkan dengan kertas isap secara hati--hati.
4. Teteskan larutan Gram B, biarkan selama 1 menit.
5. Cuci dengan air dan keringkan.
6. Tetesi dengan larutan Gram C biarkan selama 30 detik .
7. Cuci dengan air dan keringkan.
8. Tetesi dengart larutan Gram D biarkan selama 30 detik, cuci dengan air
dan keringkan dengan kertas isap.
9. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x atau l00x
menggunakan minyak imersi.

68
 Gambar 2. Prosedur pengecatan Gram
1.5. Pengecatan Spora
a) Bahan-bahan yang diperlukan:
1. Biakan murni bakteri dalam medium Nutrient-Agar miring umur
72 jam.
2. Larutan cat safranin 0,5 %, larutan cat malachite green 5%,
aquades steril

69
 b) Cara Kerja:
A. Pengecatan Schafler fulton
1. Bersihkan gelas dengan alkohol, kemudian panaskan di atas nyala
pembakar spirtus
2. Ambil 1 ose aquadest steril secara aseptik, letakkan di atas gelas
objek. Kemudian ambil secara aseptik 1 ose biakan bakteri dan
campur sehingga menjadi suspensi yang homogen dan ratakan ± 1
cm
3. Kemudian kering-anginkan setelah itu fiksasi di atas
nyala pembakar spirtus.
4. Tetesi demgan larutan cat malachite green berlebihan dan biarkan
½- 1 menit
5. Cat yang berlebihan dicuci dengan air mengalir selama 30 detik
dart kering- anginkan.
6. Bubuhkan larutan cat safranin dan biarkan selama 30 detik.
7. Cuci dengan air mengalir dan kering-anginkan.
8. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi.
Spora yang terlepas tampak hijau, spora yang masih terdapat di
dalam sel tampak transparan, sedangkan sel vegetatif berwarna
merah.
9. Foto hasil-hasil pengamatan dan tentukan letak spora (sentral,,
terminal, atau sab terminal).
B. Pengecatan Bartholomeus dan Mittwer
1. Kerjakan pekerjaan no.l. dan 2 seperti cara di atas.
2. Kering-anginkan, kemudian fiksasi dengan pembakar spirtus
dengan cara melakukan preparat di atas nyala pembakar spirtus;
sebanyak 20 kali.
3. Tetesi dengan larutan cat malachite green jenuh selama 10 menit
(jangan dipanasi).
4. Cuci dengan air mengalir dan selanjutnya kering-anginkan.

70
 5. Lakukan pengecatan dengan larutan cat safranin dan biarkan
selama 5 detik
6. Cuci dengan air mengalir dan selanjutnya kering-anginkan.
7. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi.
8. Gambar hasil-hasil pengamatan dan tentukan letak spora (sentral,
terminal, atau sub terminal).
I. 6. Pengecatan Kapsul
a) Bahan dan Alat :
1. Biakan murni bakteri d alam Skim Malt Agar.
2. Larutan CuSO4 20%
3. Larutan Kristal Violet 1%
4. Gel as objek
5. Kertas isap
6. Jarum ose
7. Alkohol 70% dan pembakar spiritus,
b) Cara Kerja
1. Siapkan preparat olesan bakteri
2. Tetesi dengan larutan kristal violet dan panaskan diatas penangas air
selama 1 menit.
3. Bilas dengan larutan CuSO4
4. Keringkan dengan kertas isap
5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x atau l000x
menggunakan: minyak imersi. Catat, foto dan ukur tebal kapsul.
2. Pemeriksaan Kapang Dan Khamir
2.1. Pemeriksaan kapang pada "slide culture "
a.) Alat dan Bahan :
1. Batang U/V
2. Gelas obyek/ kaca penutup
3. Medium PDA/MEA
4. Ose lurus
5. Kertas saring
6. Isolat jamur

71
 b.) Cara Kerja
1. Bagian bawah cawan petri diberi alas kertas saring sehingga menutup
alas bagian bawah cawan Letakkan batang gelas U/V, kemudian
diletakkan gelas penutup berdampingan gelas objek, sterilkan dalam
autoklaf.
2. Setelah dingin, diatas gelas obyek diberi setetes medium. Ratakan
dengan ose steril sehingga membentuk lapisan tipis, seluas gelas
penutup, biarkan membeku da lamcawan petri tertutup.
3. Inokulasi sedlkit spora kapang pada permukaan agar dengan ose jarum
dan tutup gelas penutup.
4. Teteskan 5-7 ml aquadest steril ke atas filter untuk memberikan
kelembaban yang optimum selama pertumbuhan batang
5. Inkubasi pada suhu kamar 3-5 hari, amati di bawah mikroskop.
2. 2 Pengamatan morfologi jamur dari biakan murni
Da1am melakukan praktikum jamur, pengamatan dilakukan secara
makroskopis dan mikroskopis.
a.) Alat dan Bahan :
1. Biakan Rhizopus atau Mucor.
2. Biakan Aspergillus.
3. Cawan petri steril berisi medium PDA,.
4. Ose, jarum preparat , objek gelas,
5. Laktopenol
b.) Cara Kerja :
Secara Makroskopis
1. Pindahkan sedikit biakan kapang murni dengan jarum tajam kedalam
cawan petri yang berisi PDA.
2. Inkubasi selama 4-5 hari pada suhu kamar

72
 V / .. geift* \ \ I

Gambar 3. Cara pembuatan "slide culture" (a) Siap untuk disterilisasi, (b)Setelah
inokulasi, siap untuk diinkubasi.

* Untuk Aspergillus
1. Amati perubahan warna pada koloni
2. Keadaan permukaan koloni (rata , menggunung, seperti, tepung, berbutir,
beludru atau seperti kapas)
3. Ada bau yang khas.
4. Amati pula warna koloni
"Radial furrow" : titik pusat
"Growing zone" : lapisan bening pada bagian terluar Zonation”
"Exudate drupe." : titik cair pada permukaan koloni
"Reverse of coloni" :latar belakang koloni
5. Catat semua yang diamati

* Untuk Rhizopus
Amati setiap hari keadaan koloni secara umum (tinggi atau rendah pada
permukaan medium, serta warnanya), keadaan permukaan koloni (seperti kapas,
tepung, butir-butir kasar ),ada tidaknya exudate drops, keadaan bagian belakang
koloni. Amati juga dengan menggunakan kaca pembesar (loupe) bagian miselium
yang menempel pada dinding cawan petri dan hitunglah jumlah fasikelnya.
a. Secara Mikroskopis
a.) Alat dan Bahan :

73
 1. Biakan Rhizopus oryzae, Aspergillus oryzae, Penicillium
2. Gelas objek dan kaca penutup.
3. Larutan laktofenol
4. Jarurn preparat.
5. Alkohol 70% dan pembakar spiritus.
b.) Cara Kerja :
1. Bersikan gelas objek dan kaca penutup dengan alkohol 70% sampai bebas
lemak, kemudian teteskan beberapa.Tetes larutan laktofenol atau
laktofenol cotton blue di atas permukaan gelas objek tersebut.
2. Ambil sedikit koloni biakan dengan jarum Inokulasl., letakkan dalam
tetesan laktofenol, dan uraikan dengan jarum preparat: secara hati-hati,
usahakan seluruh miselium basah terkena laktofenol
3. Tutuplah dengan kaca penutup sedemuikian rupa sehingga tidak terdapat
gelembung udara dalam preparat. Bersihkan kelebihan laktofenol dengan
kertas isap
4. Amati dengan mikroskop memakai lensa objektif perbesaran .10x,
kemudian dengan perbesaran 40x . Untuk melihat morfologi konidia atau
spora gunakan lensa objektif perbesaran 100x
5. Catat dan foto semua yang diamat seperti :miselium (bercabang atau
tidak , berseptum atau tidak, halus atau kasar); sterigma; konidia; spora
konidiofor; kolumela; -vesikula zigospora• klamidospora, metulae
3. Morfologi khamir
Khamir atau yeast adalah fungi yang bersel tunggal dan tidak membentuk
miselium, meskipun begitu beberapa spesies diantaranya dapat membentuk
miselium semu (pseudomycelium). Morfolagi khamir lebih sederhana dari
kapang, dan ukurannya lebih besar dari bakteri .
a.) Bahan dan Alat
1. Biakan murni khamir Saccharomyces cereviceae dalam medium YMA
atau CMA umur 24 jam
2. Larutan methylene blue.
3. Gelas objek dan kaca penutup.

74
 4. Jarum ose
5. Alkohol 70% dan pembakar spirtus
b.)Cara Kerja :
1. Bersihkan kaca obyek dengan memakai alkohol 70% sampai bebas lemak
2. Teteskan sedikit larutan meyhylene blue ditas obyek tersebut
3. Ambil sedikit biakan khamir dengan memakal jarum ose, letakkan dalam
tetesan methylene blue dan tutuplah dengan kaca penutup.
4. Amati dibawah mikroskop dengan memaka perbesaran 100x dan 400x
5. Foto dan catatlah bentuk sel, ada tidaknya pertunasan (budding),
banyaknya tunas (budding) pada tiap sel, askospora, miselium semu
(pseudomycelium).

C. HASIL PENGAMATAN
Jelaskan perbedaan antara morfologi koloni bakteri dengan fungi (kapang
dan khamir) pada media agar? Tunjukkan dengan gambar

Tabel. Karakteristik Morfologi

Karakteristik morfologi koloni

Mikroorganisme Pigmentas Margin Elevasi Bentuk koloni Keterangan
i

75
 BAB IX
PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN TERHADAP
PERTUMBUHAN BAKTERI

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat mengetahui faktor-faktor lingkungan yang
mempengaruhi pertumbuhan bakteri.

B. DASAR TEORI
1. Pengaruh Suhu
Mikroorganisme dapat dipilahkan berdasarkan suhu optimum
pertumbuhan. Kimroorganisme yang mempunyai suhu optimum diantara 0o-20o C
disebut Psikrofil. Mikroorganisme yang tumbuh cepat pada kisaran suhu 20o-
50oC disebut mesofil, sedangkan mikroorganisme yang tumbuh pada kisaran suhu
50o-100oC disebut thermofil.
Beberapa mikroorganisme dapat bertahan pada suhu tinggi meskipun pada
suhu tersebut tidak dapat tumbuh; kelompok ini disebut thermodurik.
Mikroorganisme pembentuk spora dapat bertahan pada suhu didih selama 5-15
menit karena spora bersifat tahan panas.
Untuk melihat pengaruh suhu pada pertumbuhan bakteri, dilakukan
pembiakan bakteri pada berbagai suhu. Setiap bakteri mempunyai suhu optimum.
Pada suhu optimum ini pertumbuhan bakteri berlangsung dengan cepat. Diluar
kisaran suhu optimum, pertumbuhan bakteri menjadi lambat atau tidak ada
pertumbuhan. Selain laju pertumbuhan, suhu dapat mempengaruhi pembentukan
pigmen. Ini berarti bahwa pigmen hanya dihasilkan bila diinkubasikan pada suhu
tertentu.
2.Pengaruh pH
Sewaktu pertumbuhan mikroorganisme seringkali terjadi perubahan pH
media. Mikroorganisme yang melaksanakan proses fermentasi menghasilkan
asam sehingga pH dapat turun menjadi 3.5. sebaliknya sewaktu metabolisme
protein dan asam amino dilepaskan ion ammonium sehingga pH media menjadi
basa.

76
Perubahan pH terjadi dengan cepat dalam lingkungan tertutup seperti misalnya
kaldu nutrient dalam tabung, sehingga menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Untuk mencegah perubahan pH seringkali ditambahkan larutan
penyangga dalam media
Pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH sekitar 7.0 meskipun dapat
tumbuh pada kisaran pH 5.0-8.0. Untuk melihat pengaruh pH, bakteri
ditumbuhkan pada berbagai pH.
1. Pengaruh Oksigen
Mikroorganisme seringkali dipilah mejadi 5 kelompok berdasarkan
kebutuhan akan oksigen (O2) yaitu: aerob obligat,anaerob obligat,anaerob
fakultatif, anaerob aerotoleran, dan mikroaerofil.
Mikroorganisme yang memerlukan oksigen untuk hidupnya disebut aero
obligat atau aerob. Contoh mikroorganisme aerob obligat atau anaerob adalah
Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens dan Mycobacterium Phlei.
Kelompok mikroorganisme yang tidak dapat hidup bila ada oksigen
disebut anaerob obligat atau anaerob. Kematian ini disebabkan beberapa faktor,
kelompok mikroorganisme ini tidak memiliki atau hanya mempunyai sedikit
superoksida dismutase yang mengubah superoksida (O2) yang bersifat racun
menjadi hydrogen peroksida (H2O2). Superoksida (O2-) terbentuk bila
mikroorganisme berada dalam lingkungan aerob. Selain superoksida dismutase
kelompok ni, tidak mempunyai peroksidase dan katalase yang mengubah hidrogen
peroksida menjadi bentuk tidak toxic. Alasan lain mengapa kelompok ini tidak
dapat hidup dalam lingkungan aerob adalah sistem enzim yang sensitif terhadap
oksigen. Contoh anaerob obligat adalah Clostridoium tetani dan Bacteriocides
fragilis

Percobaan I. Pengaruh Suhu

a.) Bahan dan alat
1. 6 tabung medium cair Nutrien Broth
2. Suspensi biakan Bakteri gram negatif dan gram positif
3. Pipet volume

77
b.) Cara Kerja :
1. Inokulasikan biakan bakteri gram negatif dengan mikropipet kedalam tabung
medium Nutrient Broth masing-masing sebanyak 0,5 mL.
2. Lakukan hal yang sama dengan pipet steril lainnya untuk biakan bakteri gram
positif.
3. Biarkan 2 buah tabung tidak diinokulasi dan digunakan sebagai kontrol.
4. Inkubasikan satu seri tabung masing-masing pada suhu 50C,300C dan 500C
5. Amati perubahan yang terjadi

Percobaan II. Pengaruh pH

a.) Alat dan Bahan:
1. Biakan Saccharomyces cerevisiae
2. Biakan Escherchia coli
3. Biakan Staphylococcus aureus
4. Nutrient broth
b.) Cara Kerja:
1. Tandai tabung kaldu nutrient dengan pH yang digunakan yaitu:
a. 3 tabung dengan pH 3.0
b. 3 tabung dengan pH 7.0
c. 3 tabung dengan pH 9.0
2. Inokulasi 3 tabung (pH 3.0) masing-masing dengan biakan yang disediakan.
Lakukan hal yang sama untuk ketiga tabung dengan pH dan pH 9.0
3. Eramkan tabung yang mengandung S.cereviciae dalam suhu kamar selama 48
jam. Tabung lainnya dieramkan dalam lemari pengeram 37 C selama 48 jam.
4. Laporkan derajat kekeruhan pertumbuhan bakteri.
Percobaan III. Pengaruh Oksigen
a.) Alat dan bahan:
- Ose
- Lampu spiritus
- Tabung reaksi berisi medium cair

78
 - Cawan petri Anaerobic jar Anaerobic strip
- Biakan murni bakteri
b.) Cara Kerja:
1. Siapkan kultur bakteri yang akan kita gunakan
2. Ambil 1 ose kultur bakteri goreskan ke dalam media agar yang telah ada
3. Inkubasikan dalam incubator biasa dan inkubasikan dalam anaerobic jar
yang telat dimasukan anaerobic kit nya (berupa anaerobic cult dan strip)
4. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam
5. Lihat hasil dari masing-masing bakteri tersebut, catat hasilnya dan bahas

D. HASIL PENGAMATAN
1. Gambarkan pertumbuhan bentuk pertumbuhan mikroorganisme pada
setiap variasi perlakuan suhu, pH dan Oksigen
2. Jelaskan pengaruh setiap faktor lingkungan tersebut terhadap pertumbuhan
bakteri !

79
 BAB X
UJI DAYA KERJA ANTI MIKROBIAL

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa dapat mengetahui daya kerja Desinfektan
2. Mahasiswa dapat mengetahui daya kerja beberapa bahan kimia terhadap
pertumbuhan bakteri (Baktiriostatik dan Bakteriosida)
3. Mahasiswa dapat mengetahui cara pengujian bahan anti mikrobia dalam
menghambat pertumbuhan mikroba menggunakan metode Kirby-Bauer
(Paper Disk)

B. DASAR TEORI
Banyak zat kimia dapat manghambat atau mematikan mikroorganisme,
seperti unsur logam berat dan molekul organik kompleks. Substansi tersebut
menunjukkan efek anti mikrobialnya dalm berbagai cara dan terhadap berbagai
macam mikroorganisme. Oleh karena itu perlu diketahui terlebih dahulu perilaku
suatu bahan kimia sebelum digunakan untuk penerapan taktis.
Desinfektan yang digunakan oleh Joseph Lister (1817) mengandung
persenyawaan fenol untuk mendisinfeksi peralatan bedahnya. Senyawa ini berupa
asam karbol. Sampai sekarang senyawa fenol masih digunakan sebagai larutan
baku penentu keampuhan desinfektan. Untuk menguji kekuatan desinfektan dalam
menghambat pertumbuhan mikroba dapat digunakan cakram kertas (paper disk).
Pada kertas ini dibasahi dengan desinfektan kemudian diletakkan pada lempengan
agar yang telah diinokulasi mikroba. Cara pengerjaan ini sama dengan teknik
pengujian antibiotik. Lempengan agar kemudian diinkubasi selama 24 jam. Bila
desinfektan menghambat pertumbuhan mikroba, maka akan terlihat zona (daerah)
jernih disekeliling cakram kertas; atau juga dinamakan zona hambat. Luas daerah
terang ini menjadi ukuran kekuatan daya kerja desinfektan.
Daya kerja anti mikrobial sering disetarakan dengan fenol. Kemampuan
bahan kimia dibandingkan dengan fenol dinamakan koefisien fenol. Nilai ini

80
didapat dengan membagi pengenceran tertinggi pada bahan kimia yang
mematikan mikroba dalam waktu 10 menit, namun tidak mematikan dalam waktu
5 menit. Bahan kimia yang mempunyai nilai koefisien fenol lebih dari 1
mempunyai daya kerja antimikrobial yang lebih baik dari fenol.
Bahan kimia yang digunakan dalam pengobatan menjadi pilihan bila
mematikan dan bukan hanya menghambat pertumbuhan. Bahan kimia yang
mematikan banteri dinamakan bakterisidal, sedangkan bahan kimia yang
menghambat pertumbuhan dinamakan bakteriostatik,
Antibiotik adalah suatu substansi (zat-zat) kimia yang diperoleh dari atau
dibentuk dan dihasilkan oleh mikroorganisme, dan zat-zat dalam jumkah sedikit
pun mempunyai daya hambat kegiatan mikroorganisme. Antibiotik yang kini
bamyak digunakan, kebanyakan dari genus Bacillus, Penicillium dan
Streptomyces. Antibiotik haruslah mempunyai sifat sebagai berikut :
1. Menghambat atau membunuh patogen tanpa merusak inang (host)
2. Bersifat bakterisida dan bukan bakteriostatik
3. Tidak menyebabkan resistensi pada kuman
4. Berspektrum luas
5. Tidak bersifat alergenik atau menimbulkan efek samping bila dipergunakan
dalama jangka waktu lama
6. Tetap aktif dalam plasma, cairan badan
7. Larut didalam air serta stabil
C. KEGIATAN PRAKTIKUM
1. Percobaan Daya Kerja Desinfektan
c.) Bahan :
- Biakan gram negatif dan gram positif
- Medium NA dalam tabung
- Desinfektan
- Cakram kertas (Paper Disk)
d.)Cara Kerja :
1. Ambil 2 tabung agar yang telah dicairkan
2. Inokulasi masing-masing tabung dengan biakan yang telah disediakan

81
 3. Tulis nama desinfektan dan nama bakteri pada cawan petri
4. Kocok tabung diantara dua telapak tangan, kemudian tuangkan ke cawan
petri. Biarkan agar membeku
5. Ambil kertas cakram dengan pinset, kemudian celupkan didalam larutan
desinfektan yang telah disediakan. Letakkan cakram kertas pada
permukaan lempengan agar. Perhatikan bahwa jarak antara cakram kertas
harus cukup jauh.
6. Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam
7. Ukur luas daerah jernih
8. Bandingkan daya kerja berbagai desinfektan terhadap kedua bakteri
tersebut

Tabel 1. Contoh Hasil Pengamatan

No Desinfektan Gram negatif Gram positif
1 Desinfektan I
2 Desinfektan II
3 Desinfektan III
4 DesinfektanIV

2. Percobaan Pengujian Daya Baktiriostatik Selektif Larutan Kristal Violet

Terhadap Bakteri
a.) Bahan Dan Alat :
1. Biakan murni bakteri gram negatif dan gram positif
2. NA 9 mL
3. Aquadest steril
4. Larutan kristal violet 0,1%
5. Cawan petri
6. Pipet volume
b.) Cara Kerja :
1. Mencairkan medium NA dalam penangas air dan ditambah
mendinginkannya sampai 500 C.

82
 2. Memasukkn 1mL larutan kristal violet 0,1% kedalam 9 mL aquadest steril
(pengenceran 1 :10.000)
3. Memasukkan 1mL larutan kristal violet : 10.000 masing-masing kedalam
cawan petri (2 buah) dan 1mL kedalam 9mL aquadest steril (pengenceran
1:1.000.000)
4. Memasukkan 1mL larutan kristal violet 1:100.000 masing-masing
kedalam cawan petri (2 buah)
5. Menuangkan 1 tabung medium NA, masing-masing kedalam cawan petri
yang telah berisi larutan kristal violet dan 1 cawan petri sebagai kontrol
6. Setelah medium NA padat, baliklah cawan petri dan beri tanda dengan
pensil gelas sehingga cawan petri terbagi menjadi 2 vektor
7. Menginokulasi masing-masing sektor secara goresan dengan 1ose biakan
murni bakteri Gram negatif dan Gram positif
8. Menginkubasi pada suhu 370C selama 48 jam
9. Mengamati pertumbuhan dan mencatat hasil pengamatan, dengan diberi
keterangan : + = ada pertumbuhan, - = tidak ada pertumbuhan
3. Praktikum Pengujian Daya Kerja Antibiotik Dengan Paper Disk
a.) Bahan Dan Alat :
1. Biakam murni bakteri umur 24 jam
2. Medium NA dan NB
3. Zat antibiotik
4. Cawan petri
5. Pipet mikro
6. Paper disk
b.) Cara Keja :
1. Menuangkan medium NA (untuk lapisan dasar) kedalam cawan petri
secara aseptik
2. Menuangkan 4ml medium NA yang telah diinokulasi bakteri penguji
(seeded agar) diatas lapisan dasar. Cara menyiapkannnya adalah sebagai
berikut :

83
 a. Bakteri penguji ditumbuhkan kedalam medium NA miring dengan
tiap minggu sekali dipindahkan kedalam medium baru
b. Biakan murni bakteri dalam medium NA miring umur 24 jam untuk
inokulasi medium NB dan menginkubasikan pada temperatur 37 0C
selama 24 jam
c. Mengambil 2mL biakan cair untuk inokulasi 100mL medium NA
3. Meletakkan secara aseptik Paper Disk diatas lapisan NA, jika digunakan
4-6 paper disk maka cara meletakkannya harus secara simetrik dengan
jarak paling kecil 20 mm dari tepi cawan petri
4. Meneteskan 0,08mL larutan antibiotik pada paper disk pada medium NA
5. Menginkubasikan pada temperatur 370C selama 24 jam
6. Mengamati dan mengukur diameter zona hambat

D. HASIL PRAKTIKUM
1. Gambarkan hasil pengamatan zona penghambatan dari beberapa jenis
antibiotik terhadap pertumbuhan bakteri uji
2. Ukur diameter zona penghambatan masing-masing antibiotik tersebut
3. Jelaskan mekanisme kerja antibiotik tesebut terhadap penghambatan
pertumbuhan mikroorganisme

84
 BAB XI
ISOLASI DAN KULTIVASI FUNGI: BUDIDAYA JAMUR

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat mengetahui cara budidaya jamur mulai dari isolasi fungi
hingga inokulasi pada media pertumbuhan jamur.

B. DASAR TEORI
Fungi merupakan kelompok mikrobia eukariotiik heterotofik yang tersebar
luas di alam, bersifat saprofit, yaitu mendapatkan nutrient dari penguraian bahan
organik sisa jasad hidup. Fungi berbeda dengan tumbuhan karena selnya tidak
mempunyai klorofil. Ciri khas fungi adalah membentuk filament yang disebut hifa
yang terdiri dari sel tunggal panjang atau rantai sitoplasma tanpa klorofil. Hifa
mengabsorbsi nutrient dari lingkungannya dan hifa yang berperan dalam
reproduksi dengan membentuk hifa reproduktif yang mengandung spora. Hifa
mempunyai dinding sel yang terdiri dari khitin atau selulosa dan sedikit
polisakarida. Koloni fungi (talus) tersusun dari massa hifa yang disebut miselium.
Fungi dibagi atas empat kelompok utama berdasarkan sifat khas struktur dan cara
reproduksinya, yaitu Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes dan
Deuteromycetes. Ada fungi yang tidak membentuk hifa, yaitu khamir (yeast),
bersel tunggal (uniseluler) membentuk koloni. Khamir umumnya dari kelompok
Ascomycetes contoh: Neurospora, Morchella,dan Saccharomyces. Fungi yang
multiseluler dengan tubuh tersusun oleh miselium (kumpulan hifa) adalah kapang
(Mould). Kapang umumnya dari kelompok Zygomycetes, contoh : Rhizopus dan
Mucor. Beberapa fungi multiseluler dan makroskopis memiliki tubuh buah yang
merupakan massa hifa. Kelompok ini disebut jamur (Mushroom).
Jamur dapat dibudidayakan. Tubuh buah jamur yang baik digunakan
sebagai sumber bibit harus memiliki sifat produktivitas tinggi, sehat, dan masih
segar. Setelah tubuh buah jamur tersedia, maka persiapan selanjutnya adalah
menyiapkan media tumbuh.
Media tumbuh yang digunakan adalah agar kentang dextrosa (Potato
Dextrose Agar = PDA) dan modifikasinya. Pertama-tama tubuh buah jamur

85
dibersihkan dari kotoran, kemudian diiris dan diinokulasikan kedalam media
tumbuh. Media tumbuh yang telah diinokulasi selanjutnya diinkubasikan diruang
aseptik pada suhu 30 – 34 oC. Umumnya, seminggu kemudian miselia jamur
mulai tumbuh dan menutupi setengah dari bagian media tumbuh dan saat ini
merupakan seleksi awal dari yang terkontaminasi dan yang tidak terkontaminasi.
Yang terkontaminasi diseleksi dan bila memungkinkan dimurnikan lagi ke media
tumbuh yang baru dan seterusnya sampai didapat biakan murni dan tidak
terkontaminasi. Sedangkan biakan murni yang tidak terkontaminasi dapat
langsung diperbanyak atau disimpan di lemari es.
Perbanyakan bibit secara laboratoris bertujuan untuk mendapatkan bibit
jamur yang murni dan selektif dalam arti luas. Bahan yang dipakai umumnya
limbah pertanian, baik secara manunggal atau kombinasi dari dua atau lebih
macam bahan dapat digunakan sebagai media tumbuh bibit jamur atau jamur itu
sendiri. Bahan yang digunakan oleh petani jamur kita sebagai media perbanyakan
bibit jamur adalah merang padi, pupuk kandang, kapur tembok, bekatul padi, dan
glukosa. Wadah media tumbuh bibit dapat digunakan segala macam wadah. Yang
penting wadah tersebut tidak rusak pada waktu disterilisasi dan dilengkapi dengan
tutup.
Penyusunan bag log tanam berpengaruh terhadap laju pertumbuhan
miselium, tingkat kontaminasi dan pembentukan tubuh buah jamur. Inkubasi
bertujuan untuk menumbuhkan miselium jamur. Agar pertumbuhan miselium
lebih optimal maka keadaan lingkungan seperti temperatur, kelembaban ruangan,
cahaya, dan sirkulasi udara harus diatur sesuai dengan kebutuhan petumbuhan
vegetatif jamur. Pengaturan lingkungan yang baik selain dapat mempercepat
pertumbuhan miselium juga dapat menekan tingkat kontaminasi substrate tanam.
Masing-masing jamur membutuhkan lama inkubasi yang berbeda. Selama
dalam masa inkubasi jangan sekali-kali dilakukan penyiraman atau terkena sinar
matahari langsung sebab dapat meningkatkan terjadinya kontaminasi pada
subtrate tanam
C. KEGIATAN PRAKTIKUM
1. Alat dan Bahan

86
a.) Alat
- Gelas ukur kapasitas 1 liter
- Timbangan
- Pisau anti karat
- Pisau scapel steril
- Alumunium foil
- Tabung reaksi
- Cawan petri
- Lampu Spiritus
- Hand sprayer, 1 buah
- Laminar Air Flow/Enkas
- Plastik PP (0,05 x 17 x 35 cm)
- Sekop, timbangan, plastik lembaran
b.) Bahan :
- Jamur segar : jamur tiram (Pleurotus ostreatus) dan jamur merang
(Volvariella volvacea)                                            
- Dextrosa
- Alkohol 96 %
- Kertas lakmus
- Glukosa
- Bacto agar
- Kentang
- Aquadest
- Formalin taolet
- Kapas kesehatan
- Media tumbuh PDA. Serbuk gergaji
- Bekatul/dedak
- Gips
- Kapur
- Menir jagung
- Pupuk

87
 - Air

1. Isolasi dan Kultivasi Jamur

- Medium untuk mengisolasi Fungi merupakan medium selektif yaitu
Modified Melin-Norkrans Nutrient Agar (MMN) dengan komposisi
sebagai berikut :
o Malt Extract 3 g
o D-glukosa 10 g
o (NH4)2HPO4 0,25 g
o KH2PO4 0,5 g
o MgSO4.7H2O 0,15 g
o CaCl2 0,05 g
o FeCl3 1,2 mL (larutan 1 %)
o Thiamine HCl 100 μg
o Akuades 1000 mL
o Agar 20 g
o pH setelah sterilisasi 5,5 - 5,7

- Pilih tubuh buah muda yang masih segar dan tidak busuk
- Bersihkan bagian yang kotor, terutama tangkai bagian bawah
- Seka permukaan tubuh buah yang akan dipotong dengan disinfektan
- Potong tubuh buah sedalam 1 – 2 mm memanjang pada bagian tengah
tubuh buah (kelompok Gasteromycetes). Jangan membelah seluruh
specimen karena jaringan bagian dalam akan terkontaminasi melalui
potongan tersebut oleh kontaminan dari permukaan tubuh buah
- Bagian yang telah dipotong ditekan dengan jari secara perlahan-lahan
sambil dibelah sehingga jaringan bagian dalam terbuha namun tetap dalam
keadaan steril
- Jaringan bagian dalam tubuh buah yang tidak terkena sumber kontaminan
apapun dipotong kecil-kecil (2 – 5 mm2) dengan ujung scalpel steril.

88
 - Pindahkan potongan jaringan tersebut ke medium agar dalam tabung reaksi
atau cawan petri
- Inkubasikan tabung atau cawan tersebut pada suhu 20 0 C atau suhu kamar
- Pengamatan dilakukan setelah 3 – 4 hari. Jamur yang mudah diisolasi dan
tumbuh dengan baik pada medium agar akan menghasilkan miselium
setelah 4 – 7 hari, jamur lainnya perlu waktu 2 – 6 minggu untuk
menunjukkan adanya pertumbuhan
- Miselium yang terletak pada tepi luar koloni diambil secara aseptik dan
dipindahkan ke medium agar yang baru untuk pembuatan biakan induk.
2. Perbanyakan Bibit Jamur
- Tahapan perbanyakan bibit, pertama-tama merang padi dipotong-potong
sepanjang 2 cm, lalu direndam dalam air bersih selama 48 jam, dan
ditiriskan.
- Selanjutnya dicampur dengan pupuk kandang, bekatul padi, dan kapur
tembok, serta glukosa, lalu diaduk hingga merata.
- Setelah merata berikan air sedikit demi sedikit hingga media campuran bila
digenggam, airnya tidak menetes tetapi tidak pula kering pada tangan.
- Inkubasi media campuran selama 48 jam. Setelah itu media campuran dapat
dimasukkan kedalam wadah dan disterilkan.
- Inokulasi media campuran dengan biakan murni diruang aseptik dan
inkubasikan pada suhu 32 – 34 oC. Miselia jamur akan tampak tumbuh dan
menutup seluruh media berkisar antara 7 – 14 hari, yang berarti bibit sudah
siap dipakai sebagai bibit dipertanaman

3. Inokulasi dan Inkubasi Bag Log

- Ayak serbuk gergaji agar terpisah dari potongan – potongan kayu.
- Timbang serbuk gergaji sebanyak 84 %, Bekatul 12 %, Menir jagung 3,2 %,
Kapur 0,3 %, dan Gips 0,5 % serta Air sekitar 60 %. 
- Campur semua bahan secara merata.
- Tambahkan air sedikit demi sedikit hingga kandungan airnya sekitar 60
%.  Untuk mengetahui kadar air seperti yang dimaksud, genggam campuran

89
 media tanam dengan tangan, bila tangan merasa basah tapi air tidak
menetes, kemudian bila dilepas media tanam tersebut masih tetap
menggumpal.
- Masukan media tanam ke kantong plastik PP sambil dipadatkan, berat
baglog sekitar 1 kg.
- Setelah selesai mengisi media, ikat tutup plastik dengan tali rafia secara
simpul lepas, sehingga mudah untuk dibuka.
- Susun bag log dengan rapi, siap untuk di sterilisasi.
- Periksa autoklaf/drum, isi air sesuai kebutuhan
- Masukkan bag log, susun dengan rapi
- Nyalakan autoklaf atau nyalakan sumber api untuk drum, setelah suhu
mencapai 121oC untuk autoklaf pertahankan selama 2 jam, sedangkan untuk
drum setelah mencapai 100oC Pertahankan selama 6 jam
- Matikan nyala api dan diamkan selama 24 jam
-  Angkat bag log dan susun di ruang inokulasi
- Masukkan semua bahan dan peralatan ke ruang inokulasi
- Semprot ruangan inokulasi dengan alkohol 90% dan diamkan selama 10
menit
- Cuci tangan dan keringkan, lalu semprot dengan alkohol, kenakan baju
laboratorium
- Hancurkan bibit jamur
- Buka pengikat tali bag log dan masukkan bibit jamur hingga menutupi
semua permukaan atas bag log
- Masukkan cincin leher, rapikan, dan tutup dengan kertas serta ikat dengan
karet
- Kerjakan point 6 hingga semua bag log terinokulasi
- Simpan bag log terinokulasi ke ruang inkubasi.

D. HASIL PENGAMATAN

90
 1. Sebutkan komposisi medium pada substrat untuk pertumbuhan
inoculum, bbit jamur dan pertumbuhan pada bag loq, jelaskan fungsi
setia komponen
2. Jelaskan perbedaan pertumbuhan pada jamur dan pada kapang
3. Jelaskan faktor -faktor yang mempengaruhi pertumbuhan jamur !

DAFTAR PUSTAKA

Boyd, R.F, 1995. Medical Mikrobiology, Fifth Edition, Little Brow and Company,
Boston New York-Toronto London.

Cappucino, J., dan Sherman, N. 1987, Microbiology a Manual, The

benyamin/cumming. Publishing Company, Inc, California.

Dwijoseputro, D., 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan, Jakarta.

Faddin, J.F 1989, Biochemichal test for identification of medical bacteria,

Williams and wilkins London.

Fardiaz, S, 1983, Keamanan Pangan, Fakultas teknologi Pertanian IPB. Bogor

Fardiaz, S., 1987. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. LSI, IPB. Bogor.

Fardiaz, S. 1989, Analisis Mikribiologi Pangan, Pau pangan dan Gizi, IPB Bogor

Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT Gramedia, Jakarta.

Gandar,I., 1992. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Dasar, Jurusan Biologi

F.MIPA-UI.

Hadioetomo, R.S.,1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek : Teknik Dan

Prosedur Laboratorium, Gramedia, Jakarta.

Jutono, 1980, Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum.Departemen

Mikrobiologi, Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada,
Yokyakarta.

Lay, B.W.,1994. Analisis Mikroba Di Laboratorium, PT Radja Grafindo Persada.

Jakarta.

Syamsuriputra, A. 1993.Pertumbuhan Sel,Jurusan Teknik Kimia, ITB. Bandung.

91
Wibowo, D dan Ristanto, 1987/1988, Petunjuk khusus deteksi mikroba pangan,
PAU pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

Yusanto. 2008. Buku Panduan Praktikum Budidaya Jamur. Politeknik Negeri

Lampung Bandar Lampung

92