PENUNTUN PRAKTIKUM

MATA KULIAH
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI TERAPAN

Oleh :

Dr. Drs. Maria Erna K., M.Sc.

Dr. Ir. Suharyono, M.Si.
Pramita Sari Anungputri, S.TP., M.Si.
Diki Danar Tri Winanti, S.T.P., M.Si.

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERRTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
2021
 LEMBAR PENGESAHAN

BUKU PENUNTUN PRAKTIKUM

1. Judul Buku : Penuntun Praktikum Mikrobiologi Terapan

a. Mata Kuliah : Mikrobiologi Umum
b. Kode Mata Kuliah : THP616101
c. SKS : 1 (0-1)
d. Semester : I (ganjil)
e. Status Mata Kuliah : Wajib
f. Status Revisi : Revisi I

2. Penyusun
Penanggung Jawan MK : Dr. Drs. Maria Erna K., M.Sc
Anggota : 1. Pramita Sari Anungputri, S.TP., M.Si.
2. Dr. Ir. Suharyono A.S., M.T.
3. Diki Danar Tri Winanti, S.T.P., M.Si.

Bandar Lampung, Agustus 2021

Mengetahui,
Wakil Dekan Bidang Akademik Penyusun,
dan Kerjasama

Prof. Dr. Ir. Purnomo, M.S. Dr. Drs. Maria Erna K., M.Sc
NIP. 196406131987031002 NIP. 196211291987032002

Menyetujui,
Ketua LP3M Universitas Lampung

Prof. Dr. Ir. Wan Abbas Zakaria, M.S.

NIP. 196108261987021001
 DAFTAR ISI

LEMBARPENGESAHAN ............................................................................................
DAFTAR ISI ..................................................................................................................
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................
Tata Tertib dan Good Laboratory Practise (GLP) Praktikum Mikrobiologi Terapan ...
Materi Praktikum Mikrobiologi Terapan:
Bab 1. PENGENALAN ALAT LABORATORIUM
Bab 2. METODE ASEPTIS DAN STERILISASI
Bab 3. TEKNIK KULTIVASI DAN PRESERVASI KULTUR
Bab 4. TEKNIK PRESERVASI KULTUR
Bab 5. ISOLASI MIKROORGANISME
Bab 6. OBSERVASI MIKROBA DENGAN MIKROSKOP
Bab 7. PEWARNAAN GRAM
Bab 8. KUANTIFIKASI MIKROBA
Bab 9. PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN
MIKROBA
 TATA TERTIB DI LABORATORIUM
1. Setiap peserta wajib menghadiri praktikum 100% dengan toleransi
keterlambatan maksimal 10 menit.
2. Semua tas dan benda lain yang tidak ada hubungannya dengan
praktikum diletakkan pada tempat yang telah disediakan.
3. Selama mengikut praktikum praktikan di wajibkan mengenakan jas
laboratorium penggunaan jas laboratorium tidak saja dapat
melindungi diri para praktikan dari kontaminasi akan tetapi juga agar
saudara dapat terhindar dari kotoran ataupun zat warna yang mungkin
dipakai.
4. Setiap praktikan diwajibkan menjaga kebersihan meja dan alat-alat
laboratorium yang digunakan.
5. Setiap praktikan harus mencuci tangan sebelum ataupun sesudah
praktikum di laksanakan.
6. Selama praktikum berlangsung dilarang makan, minum, merokok dan
menggunakan handphone.
7. Setiap kelompok mahasiswa praktikum bertanggung jawab atas
kebersihan alat-alat yang digunakan masing-masing kelompok.
8. Setelah praktikum selesai, setiap peserta praktiukum wajib
membersihkan meja ataupun alat-alat yang telah digunakan serta
membuang sampah atau kotoran sisa praktikum,
9. Biakan mikrobia yang tidak terpakai lagi, harus dibuang/diletakkan di
tempat khususyang telah disediakan atau disterilkan dengan
autoklaf kemudian segera dicuci.
10. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa
disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang
telah disediakan.
11. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan kepada asisten.
12. Praktikan meninggalkan laboratorium dalam keadaan bersih

GOOD LABORATORY PRACTICE

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

1. Pada laboratorium mikrobiologi, setiap mikroba harus diperlakukan

sebagai mikroba yang pathogen
2. Setiap orang yang bekerja di laboratorium mikrobiologi diwajibkan:
1) mengetahui fasilitas laboratorium, penanggung jawab, teknisi,
dan teman beerjanya,
2) memeperhatikan keamanan diri sendiri dan orang lain,
3) ikut menjaga dan merawat fasilitas laboratorium,
4) melaporkan setiap kecelakaan, luka, kondisi tidak aman pada
penanggung jawan lab.
5) Tidak bekerja sendirian jika mengerjakan pekerjaan bahaya,
6) Selalu mengenakan jas laboratorium bersih pada saat mulai
bekerja dan tidak mengenakannya ketika keluar laboratorium,
7) Berpakaian rapi, mengikat rambut, dan memasukan kerudung
kedalam jas laboratorium,

1
 8) Memcuci jas lab sesegera mungkin setealh menggunakannya di
lab mikrobiologi.
9) Menggunakan alas kaki yang tertutup
10) Selalu mencuci tangan dengan air dan sabun sebelum dan setelah
bekerja.
11) Menggunakan sarung tangan apabila diperlukan dan
membuangnya pada tempat sampah khusus yang terkontaminasi.
12) Menggunakan alat pelindung yang tepat
13) Selalu mengelap tempat kerja dengan desinfektan ssebelum dan
setelah bekerja.
14) Tidak makan, minum, merokok, menyimpan atau meyiapkan
makanan , dan mengenakan kosmetik di dalam laboratorium.
15) Menyimpan barang pribadi diluar laboratorium
3. Dalam penyimpanan kultur, setiap kultur harus diberi label kultur,
tanggal dibuat, dan nama pembuat.
4. Alat gelas/kultur/media yang terkontaminasi harus diterilisasi terlebih
dahulu sebelum dicuci.
5. Alat atau bahan yang sudah dipakai dibersihkan dan dibuang sesuai
dengan prosedur yang telah ditetapkan.
6. Memipet bahan atau kultur tidak boleh dilakukan dengan
menggunakan mulut. Hindari adanya tumpahan saat memipet.
7. Apabila kultur tumpah atau terkontaminasi, segera didekontaminasi
(10 x volume tumpah) 3% iodofor atau 1:100 khlorox
8. Apabila kultur mikroorganisme tercecer, tuang desinfektan, seka
dengan kertas merang, dan buang ditempat sampah khusus.
9. Apabila tabung mikroorganisme pecah, tuang desinfektan, sapukan,
dan buang pada tempat khusus.
10. Minimalkan pembentukan aerosol saat membuka vial kultur,
sentrifugasi, pencampuran, atau pemecahan sel.
11. Secara periodic lakukan pembersihan pada refrigerator, incubator,
clean bench, freezer, dan waterbath.
12. Lup inokulasi dan jarum inokulasi harus disterilkan dengan
memijarkan seluruh Panjang kawat sebelum dan sesudah setiap
penggunaan.
13. Api bunsen harus dimatikan apabila tidak digunakan
14. Pipet yang akan digunakan lebih dari satu kali harus diletakan pada
penyangga ppet
15. Pipet, tip pipet, kaca objek, kaca cover yang telah digunakan
disimpan pada wadah yang berisi desinfektan
16. Pekerjaan mikrobiologis harus dilakukan pada ruang khusus
17. Pada saat pemindahan media dan biakan, aliran udara dari luar
seminimal mungkin.
18. Idealnya, ruang tempat pemindahan media dan kultur tidak dimasuki
orang yang menggunakan alas kaki atau dilakukan di dalam clean
bench.

2
 PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI TERAPAN
A. Deskripsi
Mata kuliah ini mencakup prinsip analisis dasar mikrobiologi
seperti metode aseptis dan sterilisasi, teknik isolasi, kultivasi, dan
preservasi kultur mikroba, teknik enumerasi mikroba, teknik identifikasi
mikroba, dan faktor intrinsic dan ekstrinsik yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroba. Praktikum ini juga mencakup prinsip penggunaan
alat instrumen diantaranya mikroskop dan spektrofotometer.

B. Tujuan Instruksional Umum

Setelah menyelesaikan Praktikum Mikrobiologi Terapan,
mahasiswa mampu mengetahui dan melakukan masing-masing prinsip
dasar dan teknik dasar analisis mikrobiologi yang meliputi metode
aseptis dan sterilisasi, teknik isolasi, kultivasi, dan preservasi kultur
mikroba, teknik enumerasi mikroba, teknik identifikasi mikroba, serta
kurva pertumbuhan mikroba.

C. Materi Praktikum
1. Pengenalan alat
2. Metode Aseptis dan sterilisasi
3. Teknik enumerasi mikroba
4. Teknik isolasi dan karakterisasi mikroba termasuk pewarnaan Gram
5. Kurva pertumbuhan mikroba

D. Penilaian Hasil Belajar

1. Pre –lab dan Kebersihan
2. Aktivitas Praktikum
3. Laporan
4. Pre test/Post Test
5. Ujian akhir praktikum
E. Media Pembelajaran Praktikum
1. Papan tulis
2. Penuntun Praktikum

3
 BAB 1
PENGENALAN ALAT LABORATORIUM

I. PENDAHULUAN
Peralatan laboratorium yang sangat erat kaitannya dengan
dunia mikrobiologi yaitu mikroskop. Mikroskop dapat digunakan
untuk melihat mikroba yang memiliki ukuran sangat kecil. Mikroskop
dibedakan menjadi mikroskop cahaya dan mikroskop electron.
Mikroskop cahaya denan sumber penerangan lampu pijar ataupun
cahaya matahari langsung dapat digunakan untuk melihat
mikroorganisme hingga perbesaran lensa objektif 100x dan lensa
okuler 10x. Bagian-bagian mikroskop ditunjukan pada gambar berikut

Lensa objektif berfungsi untuk pembentukan bayangan

pertama dan menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat.
Pada mikroskop terdapat empat lensa objektif yang dapat diputar
dengan kemampuan perbesaran yang berbeda, yaitu mulai dari
pembesaran 4x, 10x, 40x, dan 100x (minyak imersi. Lensa okuler
adalah lensa yang terdapat dibagian ujung atas tabung berdekatan
dengn mata pengamat dan berfungsi untuk memperbesar bayangan
yang dihasilkan oleh lensa objektif dengan perbesaran 10x. Lensa
kondensor merupakan lensa yang berfungsi mendukung terciptanya
pencahayaan pada objek yang akan dilihat sehingga dengan
pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal.
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat
dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air
panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 1 atm dan

4
dengan suhu selama 15 menit 15. Bentuk dan bagian-bagian autoclave
ditunjukan pada gambar dibawah.

Inkubator merupakan alat yang digunakan untuk menginkubasi

atau memeram biakan pada suhu terkontrol. Alat ini dilengkapi
dengan pengaturan suhu dan waktu sehingga dapat dioperasikan
sesuai dengan kebutuhan tumbuh mikroorganisme. Selain itu, terdapat
juga incubator dengan control oksigen didalamnya.

Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna sebagai

tempat bekerja secara aseptis karena LAF mempunyai pola pengaturan
dan penyaring aliran udara sehingga udara di dalam ruangan menjadi
steril. Selain itu, alat ini dilengkapi dengan aplikasi sinar UV yang
dapat mensterilkan ruangan yang dapat diaplikasikan sebelum dan
sesudah digunakan.

5
 Colony counter berguna untuk mempermudah perhitungan
koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya
kaca pembesar pada alat tersebut. Selain itu alat tersebut dilengkapi
dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan
pertumbuhan koloni yang sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan
petri dapat ditandai dan dihitung secara otomatis oleh alat berdasarkan
tekanan yang diberikan.

Peralatan lainnya yang biasa digunakan pada laboratorium

diantaranya yaitu cawan petri, tabung reaksi, tabung durhan, gelas
piala, erlenmeyer, pipet, mikropipet, kaca preparat, hemasitometer,
jarum ose, pembakar bunsen, rak tabung reaksi dan lain sebagainya.

II. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui berbagai peralatan
yang digunakan pada pratikum mikrobiologi beserta cara
penggunaannya.

6
III. ALAT DAN BAHAN
Peralatan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu
mikroskop, autoklaf, incubator, laminar air flow, colony counter,
cawan petri, tabung reaksi, tabung durhan, gelas piala, erlenmeyer,
pipet, mikropipet, kaca preparat, hemasitometer, jarum ose, pembakar
bunsen, dan rak tabung reaksi.

IV. PROSEDUR KERJA

a. Penggunaan Mikroskop
1. Sambungkan kabel mikroskop terhadap sumber listrik.
2. Nyalakan tombol on/off pada bagian samping mikroskop.
3. Letakan kaca preparat pada meja mikroskop dan apit dengan
penjepit atau pengaman pada meja mikroskop.
4. Atur pembesaran lensa objektif sesuai dengan pembesaran
yang diperlukan.
5. Geser kaca preparat dengan menggunakan pengatur kanan/kiri
atau depan/belakang hingga objek dapat terlihat.
6. Atur focus lensa dengan menggunakan pengaturan kasar dan
halus yang terdapat pada mikroskop hingga didapat focus
maksimal.

b. Penggunaan portable autoklaf

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya aquades
dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan,
maka dapatditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air
hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan
karat.
2. Masukkan peralatan yang tidak terbuat dari plastic, dan bahan.
Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus
dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman
dengan mengencangkan baut bersebrangan, agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan ditutup
terlebih dahulu supaya udara dalam autoklaf keluar, karena
yang digunakan adalah uap air.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15
menit pada suhu 121oC
5. Tunggu sampai air mendidih shingga uapnya memenuhi
kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman.
6. Matikan jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu
tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan
tekanan udara di lingkungan (jarum pada presure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman
dibuka agar sisa uap air keluar. Setelah itu sekrup dibuka

7
 dengan bersebrangan, lalu tutup dibuka perlahan dari belakang.
Dan keluarkan alatnya.

c. Pengamatan Peralatan Laboratorium

Amati peralatan labortorium yang ada dan telah dijelaskan oleh
asisten praktikum, gambarkan alat tersebut beserta bagian-bagian
dan fungsinya.

8
 BAB 2
METODE ASEPTIS DAN STERILISASI

2.1. Metode Aseptis

LANDASAN TEORI
Kultur disebut murni apabila kultur ini hanya terdiri dari satu
spesies mikroba saja (Cappuccino dan Sherman, 1983). Pekerjaan di
laboratorium mikrobiologi pada umumnya melibatkan berbagai kultur
murni. Jika spesies mikroba yang lain masuk secara tidak sengaja ke
dalam kultur murni, kultur tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan
tidak lagi dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur campuran.
Kemungkinan terjadinya kontaminasi ini merupakan hal yang harus
diperhatikan karena kontaminan ini akan mempengaruhi hasil pengujian
yang sedang dilakukan, atau akan terjadi kesalahan hasil. Oleh karena itu,
untuk mempertahankan kultur tetap murni, medium pertumbuhan yang
digunakan harus steril dan kontaminasi harus dicegah.
Pada saat telah diperoleh kultur yang murni, maka hal-hal yang harus
diperhatikan (Sumbali dan Mehrotra, 2009):
1. Seluruh material yang akan berhubungan langsung dengan mikroba
harus steril.
2. Seluruh media yang digunakan untuk menumbuhkan sel juga harus
steril.
Metode yang digunakan untuk memelihara kultur murni atau
bekerja dengan kultur murni disebut metode aseptis (Gunasekaran, 2005).
Prosedur umum yang harus diikuti setiap bekerja dengan kultur murni
adalah:
1. Medium pertumbuhan dan tempatnya harus steril
2. Tempat pertumbuhan harus selalu ditutup untuk mencegah masuknya
debu yang membawa mikroba dan aerosol. Apabila penutup harus
dibuka, harus dalam waktu yang sesingkat mungkin, dilarang
meletakkan penutup pada sembarang tempat.
3. Peralatan (ose dan pipet) dan larutan yang digunakan untuk pekerjaan
harus steril. Apabila tidak steril, ose atau pipet ini akan mentransfer
kontaminan pada kultur murni.
4. Ose yang telah selesai digunakan harus disterilkan dan pipet yang telah
digunakan untuk memindahkan kultur harus ditempatkan pada larutan
disinfektan sesegera mungkin.
5. Area tempat bekerja juga harus dijaga agar tidak terkontaminasi
dengan kultur yang digunakan.
Sebelum memulai acara-acara praktikum mikrobiologi terlebih dahulu
harus diketahui cara memindahkan sel secara aseptis. Beberapa hal yang
perlu diperhatikan adalah:
1. Jangan digunakan ose yang belum steril untuk menyentuh kultur. Hal
ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi.
2. Mulut tabung harus dipanasi baik pada saat ose dimasukkan atau saat
dikeluarkan dari tabung. Pemanasan pertama ditujukan untuk mencegah
masuknya udara luar yang membawa partikel debu masuk ke dalam

9
tabung, sedang pemanasan kedua ditujukan untuk membakar sel-sel yang
jatuh atau menempel pada mulut tabung saat ose dimasukkan atau ditarik.
3. Diusahakan tabung dalam kondisi terbuka dalam waktu yang
sesingkat-singkatnya. Dihindari menempatkan tutup tabung pada
permukaan area pekerjaan atau menyentuhnya. Diusahakan agar tutup
tabung tidak bersinggungan dengan sumber kontaminan.
4. Ose yang telah digunakan harus disterilkan untuk mencegah
kontaminasi.

2.2. STERILISASI

LANDASAN TEORI
Dalam mikrobiologi sterilisasi merupakaan suatu proses untuk
mematikan semua mikroorginisme hidup beserta sporanya yang ada pada
bahan atau benda. Obyek yang terbebas dari kehidupan mikroba disebut
steril. Sterilisasi merupakan salah satu cara untuk mengontrol mikroba,
sedang cara yang lain adalah dengan menghambat pertumbuhan mikroba.
Namun sterilisasi berbeda dengan cara yang kedua, dalam hal, bahwa
pada sterilisasi seluruh mikroba yang ada beserta sporanya dimatikan
atau dihilangkan dan obyek menjadi steril (Jay, 2005). Proses sterilisasi
yang paling sederhana dilakukan yaitu dengan memanaskan jarus ose
pada api bunsen ketika akan memindahkan biakan atau mikroorganisme.
Sterilisasi adalah hal yang penting dalam melakukan aktivitas
laboratorium terutama yang melibatkan mikroba. Karena pada umumnya
percobaan dilakukan menggunakan kultur murni. Bekerja dengan kultur
murni memerlukan beberapa persyaratan, yaitu media nutrien serta
tempat untuk pertumbuhan harus steril, demikian pula segala peralatan
yang terkait. Seandainya sterilisasi tidak dikerjakan, mikroba kontaminan
akan tumbuh dan hasil yang seharusnya diperoleh dari percobaan
menggunakan kultur murni akan menyimpang. Secara umum terdapat
tiga cara sterilisasi yang dapat dilakukan yaitu dengan mengunakan agen
fisik (panas), agen kimia, dan penyaringan (filtrasi). Kedua agen fisik dan
kimia mempengaruhi struktur dan fungsi mikroba. Bagian sel dari
mikroba yang dapat rusak dan mengakibatkan malfungsi diantaranya
adalah dinding sel, membrane sel, sitoplasma, enzim, dan asam nukleat.
Kondisi dimana mikroba dapat mati secara langsung akibat perlakuan
tersebut disebut efek mikrobisidal, sedangkan efek mikrobisatik adalah
kondisi dimana kapasitas reproduktif sel dihambat dan jumlah populasi
mikroba diijaga konstan (Jay, 2005).
Pemilihan metode sterilisasi disesuaikan dengan kondisi bahan yang akan
disterilkan, jenis mikroba yang terlibat, dan tujuan dari syterilisasi itu
sendiri (Jay, 2005). Berikut ini adalah beberapa jenis metode sterilisasi
yang biasa digunakan untuk megontrol pertumbuhan mikroba yang tidak
diinginkan:

Sterilisasi dengan panas.

a. Api langsung (direct flame). Cara yang paling sederhana untuk
sterilisasi panas adalah dengan api langsung, yaitu dengan membakar

10
 obyek yang akan disterilkan pada nyala api. Cara ini dapat mencegah
adanya kontaminasi mikroba dari udara pada saat pemindahan kultur
karena panas dan gas yang ditimbulkan oleh api Bunsen dapat
membunuh mikroba pada permukaan alat sehingga tidak bisa masuk
ke dalam alat dan mencegah kontaminasi. Nyala api dengan suhu
tinggi ini akan membunuh seluruh mikroba yang ada pada obyek.
Metode api langsung ini biasanya digunakan untuk sterilisasi ose,
forceps, mulut tabung reaksi saat memindahkan kultur secara aseptis
(Wheelis, 2008). Metode api langsung biasanya dikombinasikan
dengan penggunaan cairan alkohol 70% sebagai larutan pembilas.
b. Panas kering (oven udara kering). Sterlisisai kering dilakukan dengan
menggunakan udara panas pada suhu yang tinggi tanpa adanya uap air.
Hal ini menyebabkan diperlukannya suhu yang lebih tinggi
dibandingkan dengan sterilisasi basah. Pada proses sterilisasi ini,
endospore bakteri akan mati pada suhu 160-175oC. Suhu yang
digunakan untuk sterilisasi panas kering adalah 160oC selama 90
menit sampai 3 jam (Gunasekaran, 2005). Pada table 1 disajikan
hubungan antara suhu dan waktu yang dapat digunakan untuk
sterilasasi kering. Sterilisasi kering digunakan untuk bahan-bahan
yang tidak mudah rusak, menyala, hangus, dan menuguap pada suhu
tinggi seperti pada tabung reaksi, cawan petri, botol sample, bahan-
bahan yang tidak tembus uap (gliserin, minyak, vaselin), dan dan
bahan-bahan serbuk. Obyek yang akan disterilkan ditempatkan pada
oven udara panas dan dibakar sampai seluruh mikroba terbunuh.
Panas kering dapat membunuh mikroba karena terjadi oksidasi
struktur sel dan makromolekul. Panas kering tidak dapat digunakan
untuk sterilisasi cairan (seperti media cair) karena kebanyakan cairan
akan mendidih pada suhu 100oC, dan selama mendidih temperaturnya
tidak akan naik. Pendidihan belum tentu dapat mensterilkan obyek,
karena bebrapa spora bakteri tetap bertahan dengan pendidihan selama
berjam-jam pada suhu 100oC.

Table 1. Waktu dan suhu sterilisasi kering

Suhu (oC) Waktu (jam)
170 1
160 2
150 2,5
140 3

c. Autoklav (uap panas). Penggunaan panas dalam sterilasasi dapat

dilakukan bersama dengan uap air (sterilisasi basah) atau tanpa uap air
(sterilisasi kering). Sterilisasi basah dapat dilakukan dengan
menggunakan autoklaf dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan
pada suhu 121oC selama 15 menit dan tekanan 1 atm. Panas lembab
akan sangat efektif untuk digunakan dalam sterilisasi, ketika uap air
berkondensasi pada bahan yang disterilkan maka akan dilepaskan
panass sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas

11
 ini akan mendenaturasi atau mengkoagulasi protein pada organisme
hidup sehingga akan mematikannya. Sterilisasi basah dapat digunakan
untuk mensterilkan bahan yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak
bila dipanaskan pada suhu 110-121oC. Bahan-bahan yang biasa
disterilkan dengan cara basah yaitu medium biakan yang umum, air
suling, peralatan laboratorium, biakan yang akan dibuang, medium
tercemar dan bahan-bahan dari karet. Medium seperti kaldu
fermentasi, gelatin nutrient dan susu litmus akan rusak bila dipanaskan
pada suhu 121oC.
Sterilisasi tanpa panas
a. Filtrasi. Sterilisasi dengan menggunakan penyaringan atau filtrasi
dilakukan dengan menggunakan filter yang memiliki ukuran pori 0,4
µm sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan dalam filter
dan dihasilkan filtrat yang bebas bakteri, ukuran pori 0,22 µm untuk
membebaskan bahan dari virus (Wheelis,2008). Filtrasi ini dilakukan
untuk mensterilisasi bahan-bahan yang peka terhadap panas seperti
serum, enzin, toksin bakteri, vitamin dan antibiotic. Pada cara ini
mikroba tidak dimatikan tetapi dihilangkan. Liquid yang akan
disterilkan dilewatkan pada filter yang pori-porinya sangat kecil
sehingga tidak bisa lewat. Filter yang digunakan untuk sterilisasi ada
beberapa macam, tetapi yang paling sering digunakan adalah filter
membran. Filter membran adalah material yang sangat tipis terbuat
dari selulosa asetat atau polikarbonat dengan ukuran pori-pori yang
bervariasi. Sebelum sterilisasi, filter membran dan peralatannya
disterilkan terlebih dahulu (biasanya menggunakan autoklaf).
b. Sterilisasi Kimia. Sterilisasi kimiawi dilakukan pada suhu ruang
sebagai metode yang digunakan untuk sterilisasi objek padat yang
sensitif terhadap panas. Strilisasi ini menggunakan bahan-bahan kimia
toksik, baik yang bersifat bakteriostatik (menghambat pertumbuhan
bakteri) dan bahkan bersifat bakterisida (membunuh bakteri). Bahan
kimia yang sering digunakan adalah etilen oksida (EtO). Etilen oksida
biasanya digunakan untuk sterilisasi berbagai material yang sensitif
terhadap panas, misalnya cawan Petri, pipet, alat suntik yang terbiuat
dari plastik. Alkohol biasa diguakan untuk sterilisasi tangan, alat
ataupu meja sebelum bekerja. Sedang mekanisme kematiannya sangat
tergantung dari bahan kimia yang digunakan. Bahan kimia yang
digunakan untuk sterilisasi harus dapat membunuh seluruh mikroba,
oleh karena itu harus dibedakan dengan disinfektan ataupun antiseptik,
yang biasanya digunakan untuk mengontrol mikroba tetapi tidak
mensterilkan. Bahan kimia lain yang umum digunakan adalah
senyawa fenolik, cresol, heksakloropen, rekorsinol, senyawa klorin,
senyawa iodin, dan sebagainya. Efisiensi dari bahan kimia ini
didasarkan pada konsentrasi bahan, lama paparan, tipe mikroba yang
akan dimatikan, dan kondisi lingkungan dari bahan kimia tersebut
(Cappuccino dan Sherman, 1983).
c. Sterilisasi dengan sinar radiasi. Radiasi pengion merupakan alternatif
lain untuk sterilisasi, khususnya untuk bahan yang peka terhadap
panas. Hal ini disebabkan karena kenaikan suhu yang terjadi akibat

12
 perlakuan iradiasi hanya 4oC. Selain itu radiasi pengion memiliki
daya tembus yang besar. Radiasi pengion ini mampu mengionkan
molekul yang diterpanya. Molekul air bila kena radiasi pengion ini
akan mengalami radiolisis, dan dihasilkan radikal-radikal bebas,
diantaranya radikal bebas hidrogen dan radikal bebas hidroksil.
Senyawa radikal bebas ini sifatnya sangat reaktif dan sangat mudah
bereaksi satu sama lainnya dan juga dapat mempengaruhi dan
merusak molekul di dalam sel, termasuk enzim dan asam nukleat.
Yang perlu diperhatikan dalam menggunakan sinar radiasi untuk
tujuan sterilisasi ini adalah dosis yang digunakan harus tepat. Jika
tidak, akibatnya sangat berbahaya, karena akan menyebabkan
terjadinya mutasi atau resistensi terhadap radiasi. Kelemahan
sterilisasi dengan radiasi ini adalah biaya mahal, dan butuh kehati-
hatian untuk mengoperasikannya. Yang termasuk radiasi pengion
adalah sinar gamma, sinar elektron, dan x-ray. Sinar ultraviolet (uv)
merupakan radiasi non-pengion dan hanya efektif untuk sterilisasi
permukaan untuk menghilangkan mikroorganisme yang ada pada
udara atau ruang seperti yang digunakan pada clean banch dan objek
transparan, seperti gelas (Boundless, 2013).Sterilasasi dengan
menggunakan infrared biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-
alat gelas dan metal.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa memahami prinsip sterilisasi.
2. Mahasiswa mampu mempersiapkan alat dan bahan yang akan
disterilisasi dengan autokaf.
3. Mahasiswa mampu melakukan sterilisasi alat, media
mikroorganisme, dan bahan yang digunakan dalam uji
mikrobiologi dengan menggunakan autokaf.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu autoklav
dan listrik, glassware. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu aquades,
kapas, kertas paying, karet, plastic PE, spirtus, media PCA dan susu.

PROSEDUR KERJA
a. Persiapan glass ware yang akan disterilisasi.
1. Siapkan alat gelas (tabung reaksi, pipet, erlenmeyer, cawan petri) yang
sudah dicuci bersih dan dikeringkan.
2. Buatlah penutup dari kapas steril untuk tabung reaksi dan erlenmeyer.
Pastikan kapas penutup tergulung sempurna dan tidak mudah rusak
saat penutup dibuka. Kapas penutup harus bisa menutup alat gelas
hingga tidak ada udara yang bisa masuk. Bungkus kapas penutup
dengan kertas kedap air.
3. Bungkus pipet volume dengan plastik PE dan ikat kedua ujungnya
dengan karet.
4. Bungkus cawan petri dengan kertas kedap air dan pastikan posisinya
dibalik agar tidak ada uap air yang masuk selama sterilisasi.

13
5. Bungkus semua alat dengan plastik PE dan pastikan tidak ada udara
yang ada dalam platik kemudian ikatlah platik dengan karet dan
masukkan ke dalam keranjang autokalf.

Sterilisasi Sebelum Bekerja / Desinfeksi

1. Bersihkan tangan dengan alkohol sebelum mulai bekerja.
2. Bersihkan meja dan sekelilingnya dengan menyemprotkan alkohol
dan melapnya dengan menggunakan tisu atau lap bersih.
3. Nyalakan bunsen dan tempatkan ditempat bekerja.
4. Jarum ose disterilkan diatas api bunsen dengan memulainya dari
kerucut api sebelah dalam berwarna biru sebelum dan sesudah setiap
penggunaannya.
5. Peralatan gelas (cawan petri, tabung reaksi, atau erlenmeyer)
dipanaskan mulutnya diatas api sebelum dan sesudah penggunaannya.

Cara menggunakan Autoklav Listrik (Tabo, 2004).

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya aquades dalam
autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka
dapatditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi,
untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan yang tidak terbuat dari plastic, dan bahan. Jika
mensterilisasi botol beretutupulir, maka tutup harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman dengan
mengencangkan baut bersebrangan, agar tidak ada uap yang keluar
dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan ditutup terlebih dahulu
supaya udara dalam autoklaf keluar, karena yang digunakan adalah
uap air.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit
padasuhu 121oC.
5. Tunggu sampai air mendidih shingga uapnya memenuhi kompartemen
autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman.Kemudian klep
pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai.
Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapau 2atm.
6. Matikan jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam
kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di
lingkungan(jarum pada presure gauge menunjuk ke angka nol).
Kemudian klep-klep pengaman dibuka agar sisa uap air keluar.
Setelah itu sekrup dibuka dengan bersebrangan, lalu tutup dibuka
perlahan dari
a. Sterilisasi Kering
1. Siapkan peralatan gelas yang akan disterilisasi.
2. Kemas peralatan tersebut dengan kertas ataupun plastik
3. Sterilkan peralatan tersebung dengan menggunakan IR
4. Keluarkan peralatan tersebut setelah proses sterilasasi selesai
5. Kemasan tidak dibuka sebelum peralatan tersebut akan
digunakan.
b. Pengaruh Lama Sterilisasi
1. Siapkan medium dan susu untuk disterilisasi.

14
 2. Pipet 10 ml susu atau medium kedalam tabung reaksi, tutup
dengan tabung ulir atau sumbat kapas.
3. Lakukan sterilisasi terhadap medium dengan waktu sterilisasi
15, suhu 121oC, dan tekanan 1 atm.
4. Lakukan sterilisasi terhadap susu dengan waktu sterilisasi 15,
suhu 121oC, dan tekanan 1 atm.

PENGAMATAN
Lakukan pengamatan terhadap susu dan medium yang telah
disterilisasi dan bandingkan perbedaan yang terjadi terhadap setiap
perlakuaan.

DAFTAR PUSTAKA
Boundless.2013. Microbiology. http://boundless.com/microbiology.
Diakses 10 Februari 2014.
Cappuccino, J.G. dan Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory
Manual. Addison Wesley Publishing Company: Calofornia.
Gunasekaran,P. 2005. Laboratory Manual in Microbiology. New Age
International (P) Limited, Publishers: New Delhi.
Sumbali, G. dan Mehrotra, R.S. 2009. Principles of Microbiology, 1 Ed.
Tata McGrow Hill Education Private Limited: New Delhi.
Tabo, N.A. 2004. Laboratory Manual in Microbiology. Rex Book Store,
Inc.:Manila Wheelis, Mark. 2008. Principles of Modern
Microbiology. Jones and Bartlett Publishers,LLC: Canada.

15
 BAB 3
TEKNIK KULTIVASI DAN PRESERVASI KULTUR

3.1. TEKNIK KULTIVASI

Landasan Teori
Berbagai jenis mikroba terdapat dalam makanan, tanah, air, udara,
sampah, limbah dan sebagainya. Untuk mempelajari sifat pertumbuhan,
morfologi dan sifat fisiologinya,masing-masing mikroba tersebut harus
dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga terbentuk suatu kultur
murni yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies atau
satu galur mikroba (Cappuccino dan Sherman, 1983). Proses pemisahan
mikroba dari kultur mikroba campuran sehingga diperoleh kultur murni
disebut isolasi.Untuk mengisolasi mikroba menjadi kultur murni
diperlukan medium pertumbuhan mikroba dan peralatan dasar
laboratorium, yaitu alat transfer (jarum ose dan pipet) serta ruang
penumbuhan (inkubator). Salah satu faktor yang perlu diperhatikan
dalam kultivasi mikroorganisme adalah faktor kebutuhan nutrien,
disamping faktor-faktor lain yang diperlukan untuk kehidupannya. Hal-
hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi dan kultivasi yaitu sebagai
berikut (Sumbali dan Mehrotra, 2008):
1. Semua peralatan dan sarana dalam keadaan steril (bebas
mikroorganisme hidup) atau bebas kontaminan (mikrooganisme yang
tidak dikehendaki).
2. Media pertumbuhan yang steril.
3. Dilakukan secara aseptik (tidak memberi kesempatan untuk terjadinya
kontaminasi)
Media untuk kultivasi mikroba dapat berbentuk cair (broth)
maupun padat (agar).Kultur cair sangat bermanfaat untuk menumbuhkan
mikroba dalam jumlah besar di lingkungan homogen. Media padat sangat
bermanfaat untuk isolasi kultur murni, perhitungan mikroba, dan seleksi
galur yang diinginkan. Setelah semua bahan dan alat yang akan
digunakan dalam proses kultivasi disterilkan, maka dimulailah proses
isolasi untuk mendapatkan biakan murni. Bahan yang diinokulasikan
pada medium disebut inokulum.
Media pertumbuhan merupakan suatu bahan yang mengandung
berbagai jenis nutrisi yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme diatas ataupun di dalamnya. Selain untuk menumbuhkan
mikroba, medium dapat pula digunakan untuk isolasi, memperbanyak,
pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Meskipun
setiap mikroorganisme memerlukan persyaratan medium yang berbeda,
namun pada intinya memerlukan keburuhan dasar yang sama yaitu, air,
karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Supaya mikroba dapat
tumbuh baik dalam suatu medium, perlu dipenuhi syarat-syarat sebagai
berikut :
1. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh
mikroba
2. Medium harus mempunyai tekanan osmose, tegangan muka, dan pH
yang sesuai.

1
3. Medium harus steril.
4. Medium tidak mengandung zat-zat penghambat.
Berdasarkan komposisi kimiawinya, medium dapat dibedakan
menjadi medium sintetik dan non-sintetik (kompleks). Medium sintetik
merupakan medium yang komposisi kimiawinya diketahui dengan pasti
dan dibuat dari bahan-bahan dengan kemurnian tinggi seperti NA
(Nutrient Agar), PCA (Plate Count Agar), PDA (Potato Dextrose Agar),
dan lain-lain; medium ini biasanya digunakan untuk mempelajari
kebutuhan makanan mikroba. Sedangkan medium non-sintetik
merupakan medium yang komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan
pasti seperti kaldu nutrient dalam bentuk ekstrak daging dan pepton,
medium ini banyak digunakan untuk menunbuhkan dan mempelajari
taknosomi mikroba.
Berdasarkan fungsinya medium dapat dibedakan menjadi (1)
medium serbaguna yaitu medium yang dapat menunjang sebagian besar
pertumbuhan mikroorganisme, (2) medium selektif yaitu medium yang
ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk menghambat
pertumbuhan sebagian mikroorganisme tanpa menghambat pertumbuhan
mikroorganisme yang diinginkan,misalnya medium yang mengandung
kristal violet pada kadar tertentu untuk mencegah pertumbuhan bakteri
Gram positif tanpa mempengaruhi bakteri Gram negative., dan (3)
medium diferensial yaitu medium yang ditambah reagensia atau zat
kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk
pertumbuhan atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat untuk
membedakan bakteri himolitik dan non himolitik. (4) Medium diperkaya
(enriched medium) yaitu medium yang ditambah zat tertentu misalnya
serum, darah, ekstak tumbuh tumbuhan sehungga dapat digunakan untuk
menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu. (5) Medium penguji (assay
medium) yaitu medium dengan susunan tertentu yang digunakan untuk
pengujian vitamin, asam amino, antibiotic, dan sebagainya.
Medium dapat dibuat dalam bentuk cair, semi padat dan padat
bergantung pada tujuan penggunaanya. Medium cair seperti NB (Nutrient
Broth) biasanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dalam
jumlah besar, penelaahan fermentasi dan berbagai macam uji. Medium
padat merupakan medium yang ditambahkan bahan pemadat seperti agar-
agar yang biasa digunakan untuk mengamati morfologi koloni dan
mengisolasi biakan murni. Sedangkan medium setengah padat yaitu
medium yang mengandung agar-agar tetapi dalam jumlah sedikit
dibandingkan dengan medium padat biasa digunakan untuk menguji
motilitas dan kemampuan fermentasi.
Untuk membuat medium yang tersusun atas beberapa bahan dapat
dilakukan cara berikut ini :
1. Mencampur bahan – bahan. Garam-garam dan bahan-bahan lain
dilarutkan dalam aquadest kemudian dipanaskan dalam pemanas air agar
larutannya homogen.
2. Menyaring medium. Beberapa jenis medium kadang-kadang perlu
disaring, sebagai penyaring dapat digunakan kertas filter, kapas atau kain.

2
Untuk medium agar atau gelatin penyaringannya dilakukan sewaktu
medium panas.
3. Menentukan dan mengatur pH. Penentuan pH suatu medium cair dapat
dilakukan menggunakan kertas indikator universal ataupun pH meter. pH
diatur sesuai dengan yang diharapkan.
4. Memasukkan medium ke dalam tempat tertentu Sebelum disterilkan
medium dimasukkan ke dalam tabung steril atau tempat – tempat lain
yang steril kemudian ditutup kapas dan bagian kapasnya dibungkus
kertas sampul (kertas perkamen) agar tidak basah sewaktu disterilkan.
5. Sterilisasi medium. Sterilisasi tergantung macam mediumnya,
umumnya dilakukan sterilisasi cara basah.

TUJUAN
1. Mahasiswa memahami berbagai jenis dan fungsi medium bagi
microorganism.
2. Mahasiswa mampu melakukan perhitungan kebutuhan media jadi dan
racik.
3. Mahasiswa mampu membuat medium jadi dan medium racik.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu erlenmeyer,
cawan petri, tabung reaksi, timbangan, dan autoclave. Sedangkan bahan
yang digunakan yaitu NA, NB dan air destilasi.

PROSEDUR KERJA
a. Pembuatan media racik PGYA
i. Media PGY memiliki komposisi 10 g pepton, 40 g glukosa dan 5 g
yeast ekstrak,
Bacteriological Agar 15 g untuk 1000 ml medium.
ii. Hitunglah kebutuhan bahan media PGYA untuk pembuatan 100 ml
media
sesuaikan dengan komposisi pada butir (i).
iii. Timbanglah bahan-bahan yang diperlukan sesuai hasil perhitungan
butir (ii), serta CaCO3 0,5% (0,5 g untuk 100 ml media).
iv. Campurkan dan larutkan semua bahan tersebut
v. Masukkan media tersebut pada erlenmeyer 200 ml dan sumbatlah
dengan kapas
vi. Sterilisasi media tersebut pada suhu 121oC selama 15 menit.

b. Pembuatan Media buatan PDA dan APDA dari ekstrak kentang.

i. Komposisi 1000 ml media PDA terdiri dari Potato infusion(ekstrak
kentang) 200 ml, Glukosa 20 g, Agar 15 g, Aquadest 800 ml, dan untuk
membuat APDA
tambahkan larutan 10% asam tartarat untuk mengatur pHnya menjadi
3,5 – 4,0.
ii. Ekstrak kentang (Potato Infusion) sebanyak 200 ml dibuat dengan cara
merebus 200 g kentang yang telah dikupas, dicuci dan dipotong(dibelah)

3
dalam 1 liter air selama 1 jam, saring filtrat yang diperoleh sebanyak 200
ml (sehingga diperoleh 200 ml sari kentang).
iii. Tambahkan bahan-bahan lainnya ke dalam 200 ml ekstrak kentang
tersebut (lihat poin (i))
iv. Larutkan semua bahan tersebut dan masukkan ke dalam erlenmeyer
dan sumbatlah dengan kapas.
v. Sterilisasi media tersebut pada suhu 121oC selama 15 menit.

c. Pembuatan media jadi/siap pakai NA, NB, PCA, PDA, dan MRSA.
i. Bacalah komposisi dan cara pembuatan media tersebut yang tertera
pada
kemasan masing-masing media.
ii. Timbanglah bahan sesuai dengan kebutuhan.
iii. Larutkan media dan tempatkan pada wadah yang sesuai (erlenmeyer
atau tabung reaksi), dan sumbat dengan kapas
iv. Sterilisasi media pada suhu dan waktu tertentu sesuai petunjuk pada
kemasan
dan perhatikan bila ada catatan khusus untuk media tertentu.

d. Pembuatan media Lactose broth untuk menghitung MPN

i. Setiap kelompok membuat seri pengenceran MPN 4 tingkat
pengenceran dengan menggunakan sistem 3 seri tabung (4 x 3 tabung,
setiap tabung berisi 9 ml media Lactose Broth)
ii. Timbanglah bahan untuk keperluan tersebut.
iii. Larutkan semua bahan dan masukkan ke dalam tabung reaksi serta
masukkan
satu tabung Durham pada setiap tabung reaksi tersebut, sumbatlah
dengan
kapas.
iv. Sterilisasi media

Pembuatan Agar Cawan

1. Hitung jumlah media yang diperlukan untuk membuat 50 ml NA.
2. Timbang NA sesuai dengan ketentuan dan larutkan dalam 50 ml
aquades didalam erlenmeyer.
3. Panaskan larutan NA diatas pemanas sambil diaduk hingga mendidih.
4. Tutup erlenmeyer dengan menggunakan sumbat kapas.
5. Sterilisasi medium pada suhu 1210C selama 15 menit.
6. Dinginkan medium hingga tidak terlalu panas dan tidak memadat.
7. Tuangkan medium kedalam cawan petri ± 15 -17,5 ml per cawan.

Pembuatan Agar miring

1. Hitung jumlah media yang diperlukan untuk membuat 50 ml NA.
2. Timbang NA sesuai dengan ketentuan dan larutkan dalam 50 ml
aquades didalam erlenmeyer.
3. Panaskan larutan NA diatas pemanas sambil diaduk hingga mendidih.
4. Tuangkan NA kedalam tabung reaksi ± 5-7 ml per tabung
5. Tutup tutup tabung reaksi dengan menggunakan sumbat kapas.

4
6. Sterilisasi medium pada suhu 1210C selama 15 menit.
7. Dinginkan medium dalam tabung pada kondisi miring (kemiringan
45°C) hingga benar-benar memadat dan agar miring siap untuk
digunakan..

Media Agar Tegak :

i. Campurkan bahan/media yang digunakan dengan aquades (sesuai
ketentuan
masing-masing media)
ii. Panaskan dalam beaker glass, kemudian tuangkan pada tabung reaksi
sebanyak 5 mL – 7 mL
iii. Tutup dengan kapas dan kertas payung, dan disterilisasi dalam
autoklaf.
iv. Setelah selesai disterilisasi, letakkan dalam posisi tegak (pada rak
tabung reaksi) hingga benar-benar memadat dan agar tegak siap untuk
digunakan.

g). Pengujian Sterilitas Pembuatan Media :

i. Simpanlah selama 3 hari – 1 minggu pada suhu kamar, satu cawan agar
padat atau satu tabung reaksi untuk media cair dan larutan pengencer
yang sudah disterilisasi.
ii. Amati apakah terdapat kontaminan atau tidak. Hal ini dilakukan untuk
menguji
kondisi sterilisasi media yang telah saudara lakukan apakah sudah
dilakukan dengan benar, dilakukan secara aseptis (terutama pada
pembuatan media agar cawan) dan terhindar kontaminasi pada saat
penyimpanan.

5
 Teknik Kultivasi

Kultur mikroba dibiakkan dengan cara menginokulasikan pada

agar cawan, dimana penyebaran kultur dilakukan dengan goresan di atas
agar. Tujuan penyebaran kultur adalah untuk memisahkan sel-sel
mikroba satu dengan yang lain, sehingga setelah inkubasi masing-masing
sel akan tumbuh dan berkembang biak membentuk kumpulan sel atau
koloni yang terpisah dan dapat terlihat oleh mata (Sumbali dan Mehrotra,
2009). Koloni yang tumbuh pada agar cawan dapat dibedakan dalam
besarnya, warna, penampakan (keruh atau bening). Bentuk
penyebarannya dan bentuk permukaannya. Berikut adalah beberapa
teknik isolasi yang dapat dilakukan pada agar cawan.

a. Metode gores (streak plate)

Prinsip dari teknik isolasi ini adalah menggoreskan satu ose kultur pada
media agar padat. Ada beberapa cara untuk menggoreskan kultur pada
agar cawan (Streak Plate), yaitu :
1. goresan langsung
2. goresan kuadran
3. goresan radian

b. Metode Tuang (Pour Plate).

Pada metode ini, bahan pangan yang diperkirakan mengandung mikroba
dan telah
diencerkan, dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dituangkan ke
dalamnya
medium agar cair steril yang bersuhu 47 - 50°C. Selanjutnya diinkubasi.

c. Metode Permukaan (Spread Plate).

Pada metode ini, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan
petri dan
dibiarkan beku. Setelah membeku sempurna, sampel yang telah
diencerkan dipipet pada permukaan tersebut dan diinkubasikan.
Kandungan mikroba pada suatu bahan tergantung dari mana bahan
tersebut berasal, bagaimana proses produksi, dan bagaimana cara
menanganinya. Sebelum suatu bahan dianalisa mikrobiologinya,
diperlukan tahap pengenceran sehingga perhitungan jumlah mikroba
dapat diperoleh dalam jumlah yang akurat dan masuk akal (Yousef and
Carlstrom, 2003). Berikut adalah tahapan dalam melakukan pengenceran
sampel sebelum dilakukan inokulasi pada media pertumbuhan.

6
Gambar 3. Teknik Isolasi Mikroba Dengan Metode Sebar (Spread plate)
dan
Metode Tuang (Pour plate) (Anonymous, 2007)

Transfer Kultur
Mikroorganisme dipindahkan dari satu media ke media lainnya
dengan cara sub kultur. Teknik ini merupakan suatu teknik dasar yang
penting dan selalu digunakan dalam menyiapkan ataupun
mempertahankan stok kultur. Mikroorganisme selalu ada baik di udara,
di laboratorium, dan di peralatan. Mereka dapat berperan sebagai sumber
kontaminasi eksternal dan hal ini dapat mempengaruhi hasil eksperimen,
kecuali jika menggunakan teknik yang benar dalam sub kultur. Berikut
ini adalah langkah-langkah penting yang harus diperhatikan dalam
transfer aseptis mikroorganisme (Cappuccino dan Sherman, 1983).

7
1. Loop atau ose harus selalu disterilisasi dengan cara memijarkan pada
api Bunsen sampai ujungnya berwarna kemerahan. Setelah dibakar loop
atau ose tidak boleh diletakkan, tetapi harus dipegang tangan dan biarkan
selama 10-20 detik hingga agak dingin. Tabung tempat stok kultur dan
tabung kosong tempat inokulasi dipegang pada ujung jari telunjuk tangan
lainnya dan ditahan dengan ibu jari. Kedua tabung dipegang berdekatan
dan dipisahkan dengan ibu jari sehingga membentuk huruf V.
2. Tutup tabung dibuka dengan cara memegang tutup pertama
menggunakan jari
kelingking dan tutup kedua dengan jari manis, kemudian tarik tutup
tabung sampai terlepas. Setelah dibuka, tutup tabung harus tetap
dipegang oleh tangan yang memegang loop atau ose. Setelah dibuka,
secara perlahan-lahan lewatkan leher tabung reaksi pada api bunsen.
Setelah itu, dinginkan ose atau loop dengan cara menempelkan pada
dinding bagian dalam tabung yang telah disterilisasi sebelum
memindahkan sampel inokulum.
3. Loop atau ose digunakan, tergantung dari jenis medium kulturnya.
Loop digunakan untuk kultur yang berasal dari broth kultur. Sedangkan
ose digunakan untuk memindahkan kultur dari agar miring dengan cara
perlahan-lahan goreskan ujung ose pada permukaan media padat yang
berisi kultur, sehingga tidak merusak agar.
4. Loop atau ose kemudian dimasukkan kedalam tabung sub kultur. Pada
media cair, loop atau ose digoyang perlahan untuk mencampurkan
mikroorganisme. Sedangkan untuk media agar miring, goreskan ose
perlahan pada permukaan agar secara lurus ataupun zigzag. Untuk
inokulasi agar tegak, masukkan ose atau loop secara tegak lurus kedalam
agar sampai bagian bawah tabung, kemudian tarik kembali ose seperti
pada saat memasukkan ose.
5. Langkah selanjutnya, setelah loop atau ose dikeluarkan dari tabung
reaksi, panaskan kembali leher tabung reaksi melalui api bunsen, dan
tutup kembali dengan kapas semula.
6. Pijarkan loop atau ose pada api bunsen sampai ujungnya berwarna
kemerahan, untuk mematikan mikroorganisme yang mungkin masih ada
pada ujung ose.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mahasiswa mampu melakukan berbagai teknik transfer kultur secara
aseptis
2. Mahasiswa mampu melakukan teknik isolasi kultur dengan metode
goresan
kuadran

BAHAN DAN ALAT

Alat : tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri, ose, rak tabung, bunsen,
korak api,
gelas beaker.Bahan :

8
PROSEDUR KERJA
Untuk mengembangkan ketrampilan memindahkan kultur secara aseptis,
maka praktikan harus memahami dan menguasai cara kerja atau langkah-
langkah dalam metoda aseptis pemindahan kultur. Berikut ini akan
disajikan langkah-langkah yang harus diikuti oleh praktikan.

ltur E.coli

telapak tangan dan mengeringkannya dengan tisu.

a. Transfer kultur dari tabung reaksi ke tabung reaksi (Pommerville,

2011)
1. Siapkan tabung reaksi dan ose yang akan digunakan pada rak.
2. Pegang tabung reaksi yang berisi kultur stok dan tabung reaksi yang
akan
diinokulasidengan tangan kiri secara berdampingan (gambar 1.1 a)
3. Pegang ose dengan tangan kanan seperti saat memegang pensil.
4. Pijarkan ose di atas api spirtus sampai merah membara (gambar 1.1 b)
5. Biarkan ose dingin (10 sampai 20 detik) sebelum menyentuh kultur
yang akan
dipindahkan.
6. Buka tutup kapas pada tabung reaksi yang berisi kultur stok dengan
menjapitnya diantara jari kelingking dengan jari manis dan pada
tabung reaksi tempat kultur yang akan dipindah dengan jari manis dan
jari tengah, kemudian bakar mulut tabung dengan api spirtus (gambar
1.1 c, d)
7. Broth ke agar miring/tegak. Masukkan ose ke dalam tabung yang
berisi media cair dan dan ambil satu ose kultur dan pastikan terlihat
ada media yang terambil pada loop ose (gambar 1.1 e 1). Masukkan
ose yang mengandung media ke dalam tabung yang berisi agar miring.
Letakkan loop ose pada permukaan agar bagian bawah dan goreskan
secara zig zag dari bawah ke atas dan keluarkan ose dari tabung.
Sedangkan pada media agar tegak, ose yang mengandung mikroba
ditusukkan pada media agar tepat pada bagian tengah hingga ¼ dasar
media, lalu tariklah ose dari media agar secara tegak ke atas.
8. Agar miring ke broth. Masukkan ose ke dalam tabung yang agar
miring, letakkan ose pada permukaan agar yang ditumbuhi mikroba
dan ambil satu ose kultur dengan menarik loop ose dari bawah ke atas
dan pastikan terlihat ada kultur yang terambil pada loop ose (gambar
1.1 e 2). Masukkan ose yang mengandung mikroba ke dalam tabung
yang berisi agar cair dan campurkan pada media dengan meduk ose
secara perlahan hingga kultur terlepas daro ose. Keluarkan ose dari
tabung.
9. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas (gambar 1.1.f,
g), selanjutnya diletakkan kembali pada rak.

9
10. Panaskan ose setelah selesai dipakai atau sebelum diletakkan kembali
(gambar 1.1 h).
11. Jika belum mahir, tabung reaksi bisa dipegang secara bergantian.
12. Inkubasikan tabung reaksi yang sudah diinokulasi pada inkubator.

Gambar 5. Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke tabung

reaksi secara aseptis (Pommerville, 2011)

b. Transfer kultur dari tabung reaksi ke cawan petri (Tabo, 2004)

1. Pijarkan ose di atas api spirtus sampai merah membara.
2. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindahkan.
3. Bakar mulut tabung reaksi dengan api spirtus, kemudian masukkan ose
dan ambil satu ose kultur yang tumbuh dalam tabung reaksi.
4. Bakar mulut tabung reaksi sekali lagi dan tutup dengan kapas,
selanjutnya diletakkan kembali pada rak.
5. Buka cawan Petri tempat kultur yang akan dipindahkan dengan tangan
kiri.
6. Goreskan ose pada media agar dan tutup kembali cawan Petri.
7. Inkubasikan cawan Petri pada inkubator.
Setelah selesai melakukan kegiatan transfer kultur, api bunsen dimatikan
dengan cara menututup api dengan penutup bunsen dan dilarang
mematikannya dengan meniup api tersebut dengan mulut. Meja kerja
dibersihkan kembali dengan alkohol 70 % dan dikeringkan dengan tisu.

10
Gambar 6. Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke cawan petri secara
aseptis (Tabo, 2004)

c. Tranfer kultur pada cawan petri dengan goresan kuadran (Cappuccino

dan
Sherman, 1983) :
1. Buatlah pembagian sektor dengan menggunakan spidol permanen pada
dasar
cawan petri yang mengandung media (seperti pada gambar dibawah ini).
2. Pijarkan ose kemudian gunakan untuk mengambil suspensi sampel,
buka sedikit tutup cawan, goreskan ose dipermukaan agar sektor 0
dengan cara bolak-balik dan rata.
3. Pijarkan ose dan biarkan dingin, ose yang masih panas akan
menghasilkan bunyi mendesis bila mengenai permukaan agar-agar.
Segera setelah ose dingin, buat goresan ose dari sektor 0 menuju tepi
sektor I, dan buatlah goresan bolak-balik tidak bertumpang tindih sampai
sektor I terisi penuh.
4. Putar cawan petri sehingga sektor I berada disebelah kiri anda, ulangi
langkah ke3 untuk mengencerkan biakan dari sector 1 ke sector II,
demikian pula cara yang sama dari sector II ke sector III. Perhatikan
langkah-langkah pada Gambar 1.
5. Berilah label pada dasar cawan petri, yaitu nama, kelompok, media
yang digunakan, dan tanggal praktikum.
6. Letakkan cawan petri dengan posisi terbalik, inkubasi pada suhu 30oC
selama 2-3 hari.
7. Lakukan pengamatan morfologi pertumbuhan koloni pada media agar
cawan yang meliputi penampakan fisiologis seperti pada Gambar 2.7

Morfologi Koloni Mikrorganisme

Berikut ini karakteristik pertumbuhan koloni mikroorganisme pada media
agar
cawan, agar miring dan agar tegak (Cappuccino and Sherman, 1983).

11
(a) Bentuk (b) Elevasi

(c) Permukaan (d) Margin

Gambar 8. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Mikroorganisme Pada
Media Agar
Cawan (Fardiaz, 1987)

12
Gambar 9. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Pada Media Agar Miring
(a) dan Media Agar Tegak (b) (Fardiaz, 1987).

13
 BAB 4
TEKNIK PRESERVASI KULTUR

Landasan Teori
Preservasi kultur dapat dilakukan dalam jangka pendek dan
jangka panjang. Tujuan utama preservasi yaitu mereduksi atau
mengurangi laju metabolisme dan mikroorganisme hingga sekecil
mungkin dengan mempertahankan viabilitasnya dan memelihara
sebaikmungkin biakan sehingga diperoleh angka perolehan (recovery)
dan kehidupan (survival) yang tinggi (Machmud, 2001).

Preservasi jangka pendek

Preservasi jangka pendek mikroba dilakukan untuk keperluan
rutin penelitian yaitu dengan cara memindahkan mikroba ke medium
baru secara berkala misalnya sebulan sekali. Cara ini banyak dilakukan di
laboratorium untuk pemeliharaan isolat mikroba.Teknik ini mempunyai
kendala diantaranya kemungkinan terjadi perubahan genetic melalui
seleksi varian dan peluang terjadinya kontaminasi. Beberapa teknik yang
umum dilakukan dalam preservasi jangka pendek antara lain:

1. Biakan Agar Miring

Agar miring merupakan suatu bentuk medium yang digunakan
untuk membiakanmikroba terutama yang bersifat aerobik atau anaerobik
fakultatif. Ciri-ciri kultur termasuk pembentukan warna dan bentuk
pertumbuhannya dapat segera diamati pada agar miring. Inokulasi
mikroba pada agar miring dapat dilakukan dengan cara menggoreskan
(streak) secara zig zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum
ose yang bagian atasnya dilengkungkan.

2. Biakan Agar Tegak

Agar tegak sering dipakai untuk uji motilitas suatu mikroba.
Inokulasi mikroba pada agar tegak dapat dilakukan dengan menusukkan
(stab) loop pada medium agar tegak untuk menstimulir pertumbuhan
mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen atau anaerobik.

Gambar 10. Teknik Preservasi dengan Metode Gores pada Agar Miring
dan Agar Tegak

14
Preservasi jangka Menengah

Preservasi Kultur Murni Menggunakan Metode Paper Filter

Landasan teori
Metode penyimpanan paper filter merupaka metode penyimpanan
kering yang menggunakan potongan kertas filter sebagai pengganti
media. Menurut penelitian Fong (2000), teknik penyimpanan paper filter
sangat efektif untuk pemeliharaan berbagai jenis yeast dengan nilai
isolate lebih dari 75% dengan lama penyimpanan 2-4 tahun. Penelitian
yang dilakukan oleh Kulkarni dan Chitte (2015) menyebutkan bahwa
kultur murni yang disimpan menggunakan metode paper filter yang
dikemas dalam wadah kedap udara dan disimpan pada suhu 4 oC dapat
disimpan selama 2-3 tahun. Metode paper filter yang dikemas dalam
plastik seal pada suhu dingin 5oC dapat digunakan untuk menyimpan
kultur murni E.coli dengan nilai viabilitas 94,3% selama 8 minggu
penyimpanan (Ryan et al., 2019).

Tujuan Praktikum:
1. Menyimpan kultur murni E.coli dalam Paper filter disk.
2. Mengetahui daya hidup kultur.

Bahan: Kultur Murni Eschericia coli, Nutrient Broth (NB),Nutrient Agar

(NA), Alkohol 70%.
Alat: Kertas filter Whatmann (Paper filter) dengan ukuran 1x1 cm,
Cawan Petri,Tabung Reaksi,Tabung Erlenmeyer 250ml, Autoklaf,
Desikator, Jarum ose, Batang pengaduk, Jangka vortex, Colony
counter, Mikropipet, Pipet tip, Alumunium foil, Pinset, Plastik seal
dan kertas kopi/ kertas kraft.

Prosedur kerja
1. Kultur murni E.coli ditumbuhkan di dalam media broth NA selama
24jam sehingga diperkirakan mempunyai densitas koloni 108sel/mL.
2. Paper filter dibuat berukuran 1x1cm atau bentuk bulat dengan jari2 1
cm dan disterilkan menggunakan otoklav.
3.Paper filter steril diletakkan dalam cawan petri (steril) dan ditetesi
hingga jenuh kultur broth E.coli (no 1) atau 0,5mL.
4. Paper filter yang mengandung kultur dilakukan perhitungan jumlah
kulturnya menggunakan media PCA atau NA (sebagai jumlah kultur
awal).
5. Cawan petri yang berisi Paper filter di letakkan di dalam desikator
yang telah berisi butiran silica gel (di bagian bawah desikator) dengan
tujuan mengeringkan, selama 24jam pada suhu ruang.
6. Paper filter yang sudah kering telah mengandung sejumlah tertentu
biakan murni dan siap disimpan.
7. Penghitungan jumlah kultur dalam Paper filter, untuk mengetahui
apakah ada perbedaan jumlah kultur dengan sebelum disimpan di
dalam paper filter.

15
 Daya hidup= jumlah kultur paper filter kering/jumlah kultur dalam
paper filter sebelum dikeringkan x 100%.
8. Paper filter yang mengandung kultur murni dibungkus menggunakan
plastic seal dan disimpan.

Preservasi Jangka Panjang

Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan
koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba. Metode preservasi jangka
panjang yang paling efektif dan banyak dilakukan adalah metode
liofilisasi (liophylization/freeze drying) dan kriopreservasi
(cryopreservation/cryogenic preservation).

1. Liofilisasi.
Liofilisasi merupakan dua teknik penyimpanan jangka panjang
yang paling baik yaitu meliputi pembekuan dan pengeringan. Secara
garis besar tahapan proses ini meliputi pembuangan uap air dengan cara
sublimasi vakum dari status beku. Sebelum proses pengeringan, perlu
dilakukan proses pembekuan. Pada tahap pembekuan, suspensi sel
mikroba dapat dibekukan dengan menambahkan campuran pendingin
seperti es kering dalam etanol. Alternatif lain adalah pembekuan dengan
cara sentrifugal dimana suspensi suspensi sel dibekukan dengan cara
pendinginan dan penguapan pada kondisi vakum sementara ampulnya
diputar dengan kecepatan rendah untuk menghindari timbulnya buih.
Selanjutnya suspensi beku mikroba di dalam ampul dikeringkan dalam
kondisi vakum. Selanjutnya ampul kering dapat disimpan pada suhu
ruang di tempat gelap. Kemampuan bertahan hidup jangka panjang
mikroba dapat ditingkatkan dengan penyimpanan dalam kulkas. Hal yang
perlu diperhatikan adalah cairan pengawet/preservatif yang digunakan
untuk pembuatan suspensi sel untuk mencegah kerusakan sel hidup pada
tahap pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif adalah
menstabilkan protein, mencegah kerusakan akibat pembekuan dan
melindungi dari kekeringan yang berlebihan. Pemilihan preservatif
terhantung pada mikroba yang akan disimpan. Salah satu senyawa
preservatif yang terbaik dan telah digunakan untuk penyimpanan jangka
panjang adalah mist dessicants yang merupakan cairan dengan komposisi
pepton difco 12 g dan glukosa 30 g dalam 100 ml akuades. Beberapa
cairan preservatif lain yang sering digunakan adalah larutan pepton 1%,
larutan susu skim 1%, larutan Naglutamat 1% dan larutan campuran
serum kuda dengan pepton 10%.

2.Kriogenik
Preservasi mikroba pada suhu sangat rendah yaitu dengan cara
pembekuan dalam nitrogen cair yang bersuhu -196oC dimaksudkan untuk
menjaga viabilitas dan stabilitas genetik. Berbagai jenis bakteri dapat
dibekukan langsung dalam mediumnya tetapi penambahan senyawa
krioprotektan seperti gliserol atau dimethylsulfoxide (DMSO) dapat
mengurangi dampak negatif (stres) dari pembekuan. Penyimpanan
mikroba dilakukan pada suhu -80oC untuk mereduksi kecepatan

16
metabolismenya. Semakin rendah suhu penyimpanan maka semakin kecil
peluang kehilangan viabilitasnya.

TUJUAN PRAKTIKUM :
Melakukan teknik kultivasi serta preservasi untuk menyimpan kultur
murni yang telah didapatkan dari hasil teknik isolasi.

ALAT DAN BAHAN :

Alat : tube steril, pipet mikro, tip steril, bunsen
Bahan :
gliserol 60%, alkohol 70 %, spirtus, aquades

PROSEDUR KERJA (Opsdiagnostic, 2013) :

i. Buat larutan stok gliserol konsentrasi 60% dan disterilisasi
ii. Masukkan 0,5 ml kultur dan 0,5 ml gliserol ke dalam tube steril
dengan perbandingan 50%: 50% (konsentrasi akhir gliserol 30% v/v)
iii. Vortex agar gliserol terdispersi
iv. Beri label pada tube sesuai nama mikroba, hari dan tanggal
pembuatan
v. Bekukan dalam freezer uhu -20oC.

DAFTAR PUSTAKA
Cappuccino, J.G. dan Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory
Manual. Addison-Wesley Publishing Company: Calofornia.
Fardiaz, S. 1987. Penuntuk Praktek Mikrobiologi Pangan. Lembaga
Sumberdaya Informasi Institut Pertanian Bogor : Bogor.
Fong YK, Anuar S, Lim HP, Tham FY, Sanderson FR. 2000. A modified
filter paper technique for long term preservation of some fungal
cultures, Mycologist, 14(3):127-130.
Kulkarni GA and Chite RR. 2015. Preservation of thermophilic bacterial
spores using filter paper disc technique, J.
Bioprocessing&Biotechniques, 5(4), http://dx.doi.org/10.4172/2155-
9821.1000223.
Machmud, M. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.
Buletin AgroBio 4(1):24-32
Moore, L.W. and R.V. Carlson. 1975. Liquid Nitrogen Storage Of
Phytopathogenic Bacteria. Phytopathology 65:246-250
Opsdiagnostic. 2013. Protocol for Freezing Bacteria Using Glycerol.
http://opsdiagnostics.com/notes/protocols/Protocol%20for%20Freezin
g%20B
acteria%20using%20Glycerol.htm. Diakses Maret 2013.
Pommerville, J.C. 2011. Alcamo’s Laboratory Fundamentals of
Microbiology. Jones and Bartlett Learning, LLC: USA.
Ryan F, Kustyawati ME, Suharyono, Rizal S. 2019. Teknik Paper filter
disk untuk penyimpanan E.coli, Skripsi, Universitas Lampung, 2019.

17
Sumbali, G. dan Mehrotra, R.S. 2009. Principles of Microbiology, 1 Ed.
Tata McGrow Hill Education Private Limited: New Delhi.
Tabo, N.A. 2004. Laboratory Manual in Microbiology. Rex Book Store,
Inc.:Manila
Yousef, A.E. dan Carlstrom, C. 2003. Food Microbiology: A Laboratory
Manual. John Wiley and Sons, Inc: Canada

18
 BAB 5
ISOLASI MIKROORGANISME

I. PENDAHULUAN
Keberadaan mikroba pada suatu bahan memiliki jumlah yang
sangat banyak dan beragam sehingga untuk diperoleh suatu biakan
murni perlu dilakukan teknik isolasi. Isolasi mikroba merupakan suatu
cara untuk memisahkan atau memurnikan mikroba tertentu dari
lingkungan sehingga diperoleh kultur atau biakan murni. Dalam
melakukan isolasi, perlu dilakukan pengenceran terhadap jumlah
mikroba dalam suatu bahan sehingga diperoleh jumlah mikroba dalam
rentant tertentu yang dapat dihitung pada media agar cawan.
Teknik isolasi, dilakukan pada medium agar cawan dengan
menggunakan goresan zigzag/sambung, radian, T, dan kuadran.
Goresan zigzag dilakukan dengan menarik garis dalam bentuk zigzag
dari ujung atas medium hingga bagian bawah cawan tanpa putus.
Goresan radian dilakukan dengan membentuk garis zigzag pada
bagian atas medium kemudian menarik garis tegak lurus dari beberapa
titik pada garis. Goresan T dilakukan dengan membagi cawan
kedalam tiga bagian yang membentuk hurup T, sedangkan goresan
kuadran dilakukan dengan membagi cawan menjadi empat kuadran.
Penggoresan pada setiap setiap bagian dilakukan dengan goresan
zigzag yang kemudian dilanjutkan pada bagian berikutnya dengan
mengambil garis dari titik terakhir kuadran Hasil penggoresan
mikroba dengan menggunakan sistem kuadran pada medium agar
cawan akan membentuk kultur yang semakin tipis dan semakin murni
pada akhir kuadran dan ujung goresan.

II. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk melakukan isolasi terhadap
mikroba dengan menggunakan Teknik goresan zigzag, radiant, T dan
kuadran.

III. ALAT DAN BAHAN

19
 Peralatan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu cawan
petri, ose, bunsen, dan inkubator. Sedangkan bahan yang digunakan
yaitu medium Nutrient Agar, aquades, larutan pengencer, alkohol dan
biakan mikroba.

IV. PROSEDUR KERJA

1. Siapkan tempat bekerja yang steril dengan menyemprotkan alkohol
pada meja kerja dan kemudian mengelapnya dengan lap/tisu bersih.
Nyalakan api bunsen pada tempat bekerja.
2. Siapkan 4 cawan NA yang sudah dingin dan siap untuk digores.
3. Ijarkan jarum ose pada api bunsen, dinginkan, dan kemudian ambil
satu ose sample yang sudah disiapkan.
4. Goreskan ose pada medium agar cawan dengan menggunakan goresan
zigzag, radian, T, dan kuadran.
5. Inkubasi agar cawan yang telah di inokulasi pada incubator suhu 32oC
dengan kondisi terbalik selam 2 hari.
6. Amati pertumbuhan mikroba pada goresan yang terbentuk.

20
 BAB 6
OBSERVASI MIKROBA DENGAN MIKROSKOP

PENDAHULUAN
Pengamatan terhadap mikroba dapat dilakukan dengan
menggunakan mikroskop untuk melihat struktur mikroba tersebut. Dalam
hal observasi dengan menggunakan mikroskp diperlukan persiapan
sampel atau olesan bakteri pada kaca preparat yang baik sehingga bakteri
dapat jelas diamati. Olesan bakteri yang baik yaitu yang tidak terlalu
tebal dan tidak terlalu tipis serta bila difiksasi dengan panas akan tahan
terhadap pencucian ketika dilakukan proses pewarnaan sehingga
organismenya tidak akan hilang tercuci serta tidak salah bentuk ataupun
menyusut.
Hal penting yang perlu diperhatikan dalam pembuatan preparat mikroba
untuk pengamatan mikroskop yaitu kaca objek yang akan dipakai harus
bersih dan tidak tergores, kemampuan menaruh jumlah mikroorganisme
yang tepat pada kaca objek sehingga olesan yang dihasilkan tidak terlalu
tebal dan juga tidak terlalu tipis. Pada olesan yang tebal, sel-sel bakteri
akan bertumpuk sehingga sulit unutk menentukan bentuk sel secara
individu dan jumlah yahaya yang melewati specimen akan sedikit
sehingga menyulitkan pengamatan. Olesan yang terlalu tipis akan
menyebabkan kesulitan dalam pencarian sel-sel pada pengamatan
mikroskop. Olesan bakteri harus betul-betul kering sebelum dilakukan
fiksasi dengan panas untuk menghindari perubahan bentuk sel yang
diakibatkan oleh terebusnya sel dalam air yang tersisa. Proses fiksasi
dilakukan untuk mematikan mikroorganisme dan menempelkannya pada
kaca objek.

TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk membuat preparat/olesan bakteri
dan mengamati struktur bakteri dengan menggunakan mikroskop.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini yaitu kaca objek,
cover glass, jarum ose, bunsen, dan mikroskop. Sedangkan peralata yang
akan digunakan yaitu biakan bakteri dari medium cair dan padat.

PROSEDUR KERJA
1. Bersihkan kaca objek dengan menggunakan alkoho dan keringkan.
2. Untuk pembuatan perparat dari medium cair, siapkan 1-2 ose penuh
biakan cair pada kaca objek dan ebarkan organisme hingga merata.
3. Untuk pembuatan perparat dari medium padat, teteskan 1-2 ose
aquades steril pada kaca objek. Dengan jarum ose lurus, pindahkan
sedikit biakan keatas air pada kaca objek, campurkan dan sebarkan
hingga merata.
4. Keringkan preparat dengan mengangin-anginkannya di udara hingga
kering.

21
5. Lakukan fiksasi terhadap kaca objek tersebut dengan melewatkannya
diatass api bunsen hingga kaca objek terasa panas apabila ditempelkan
pada punggung tangan.
6. Amati preparat tersebut dibawah mikroskop dan gambarkan struktur
sel yang diamati.

22
 BAB 7
PEWARNAAN GRAM

PENDAHULUAN
Pengecatan Gram pertama kali dikembangkan oleh Christian
Gram seorang dokter dari Denmark pada tahun 1883. Pengecatan gram
termasuk pengecatan diferensial karena dapat digunakan untuk
membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram
negatif dan bakteri Gram positif. Ada 4 reagen yang digunakan dalam
pengecatan Gram:
1. Cat utama, yaitu larutan violet kristal.
2. Mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan cat
utama (kompleks antara cat utama dengan senyawa yang dicat), misalnya
larutan Iodine.
3. Bahan peluntur (decolorizing agent), yaitu solven organik (alkohol
atau aseton) yang dapat digunakan untuk melunturkan cat utama.
4. Cat penutup, seperti safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-
sel yang telah kehilangan cat utamanya setelah perlakuan dengan alkohol.
Warna cat penutup harus berbeda dengan warna cat utama.
Pewarnaan gram merupakan suatu metode pewarnaan yang
digunakan untuk membedakan mikroba kedalam gram positif dan gram
negative. Pengelompokan ini didasarkan pada perbedaan komposisi
dinding sel bakteri gram positif dan negative yang menyebabkan
perbedaan reaksi gram yang terjadi. Bakteri gram positif akan menahan
kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur,
sedangkan bakteri gram negative akan kehilangan kompleks warna ungu
kristal pada pembilasan oleh alkoho namun akan terwarnai oleh pewarna
tandingannya yaitu safranin. Pada bakteri gram positif yang memiliki
dinding sel tebal menyusut oleh perlakuan alkoho karena terjadi dehidrasi
yang menyebabkan pori dinding sel menutup sehingga mencegah
larutnya kompleks ungu kristal-iodium. Sedangka pada gram negative
mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya yang
larut oleh alkoho dana seton. Larutnya lipid oleh alkoho pada pewarnaan
gram akan memperbesar pori-pori dinding sel yang menyebabkan proses
pemucatan berlangsung lebih cepat.

TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk melakukan pewarnaan gram
terhadap bakteri serta membedakan antara bakteri gram positif dan gram
negative.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang diguakan pada praktikum ini yaitu kaca preparat,
cover glass, bunsen, ose, pipet dan mikroskop. Sedangkan bahan yang
digunakan yaitu biakan bakteri, pewarna kristal violet, pewarna iodin,
alkoho 95%, safranin, dan aquades.

PROSEDUR KERJA

23
1. Bersihkan kaca preparat dengan alkoho dan biarkan hingga kering.
2. Oleskan biakan bakteri pada kaca preparat dan fixasi dengan
pemanasan diatas api bunsen. Olesan bakteri dibuat tidak terlalu tebal
dan tidak terlalu tipis.
3. Teteskan pewarna kristal violet2-3 tetes pada kaca preparat, biarkan
selama 1 menit.
4. Cuci dengan air mengalir, kemudian dikering anginkan dengan kipas
angin, dan bilas dengan aquades.
5. Teteskan beberapa tetes pewarna iodin pada kaca preparat, biarkan
selama 1 menit.
6. Buang sisa zat warna yang ada dan bilas dengan aquades.
7. Miringkan gelas benda, teteskan alkohol 95% pada kaca preparat,
biarkan selama 30 detik.
8. Buang sisa alkohol yang ada dan bilas dengan aquades.
9. Teteskan pewarna safranin pada kaca preparat, biarkan selama 2 menit.
Buang sisa zat warna yang ada dan bilas dengan aquades.
Keringkan keaca preparat. Amati sel dengan menggunakan mikroskop.

4.5. Uji Katalase

Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat

memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting
untuk pertumbuhan bakteri aerobic karena H2O2 yang dibentuk dengan
pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel
mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk katalase negatif misalnya
Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus dan Clostridium.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mengamati ada tidaknya aktivitas katalase mikroba
2. Menentukan bakteri katalase negatif atau katalase positif

ALAT DAN BAHAN :

Alat : mikroskop, gelas obyek, pipet tetes
Bahan :

xylinum, Kimia : H2O2

PROSEDUR KERJA (Roberts and Greenwood, 2003)

1. Ambil 1 loop mikroba dari agar cawan/ miring dan pindahkan pada
gelas obyek.
2. Beri 1-2 tetes larutan 3% H2O2
3. Amati yang terjadi, adanya enzim katalase ditandai dengan
terbentukknya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat
seperti busa sabun

24
 BAB 8
KUANTIFIKASI MIKROBA

1. PERHITUNGAN MIKROKROSKOP LANGSUNG

PENDAHULUAN
Perhitungan jumlah mikroba sangat penting dilakukan dalam
pengujian mikrobiologis. Pengukuran mikroba secara mendasar dapat
dilakukan melalui penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel.
Penentuan jumlah sel dilakukan untuk mikroorganisme sel tunggal
seperti bakteri, sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan untuk
mikroorganisme sel tunggal dan berfilamen. Perhitungan miroskopis
dilakukan secara langsung dengan menggunakan alat berupa
hemasitometer dengan bantuan mikroskop. Penggunaan metode ini
memiliki keuntungan yaitu pelaksanaan yang cepat tanpa memerlukan
banyak peralatan, sedangkan kelemahannya yaitu tidak dapat
membedakan antara sel hidup dan sel mati dalam populasi yang dihitung.
Pada beberapa mikroorganisme eukariotik, penambahan zat warna
(seperti methilen blue) pada sel dapat digunakan untuk membedakan sel
yang mati dan yang hidup dimana sel yang hidup dapat menyerap zat
warna tersebut sedangkan sel yang mati tidak dapat menyerap zat warna.
Namun, hal tersebut tidak dapat diimplementasikan pada setiap
mikroorganisme, seperti pada khamir yang akan tetap akan menyerap zat
warna walaupun selnya mati. Pada metode ini juga akan sangat sulit
untuk menghitung sel yang berukuran sangat kecil dikarenakan ketebalan
hemasitometer yang tidak memungkinkan penggunaan lensa objektif
minyak imersi.

TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk melakukan perhitungan
mikrooganisme dengan menggunakan hemasitometer.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini yaitu hemasitometer,
cover glass, dan mikroskop. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu
biakan mikroba yang dihitung.

PROSEDUR KERJA
1. Bersihkan permukaan hemasitometer
2. Teteskan suspensi sampel yang akan dihitung sebanyak 0,1 ml pada
permukaan hitung hemasitometer. Biarkan hingga memenuhi ruang
hitung hemasitometer dan tutup permukaan hitung dengan cover glass.
3. Amati hemasitometer dengan menggunakan mikroskop.
4. Hemasitometer memiliki sembilan area yang masing-masing
berukuran 1 mm2. Kotak yang berada ditengah (semua sisi dibatasi
garis ganda) berukuran 1 mm2 dan dibagi menjadi 25 kotak besar.
Setiap kotak besar ini dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil sehingga
terdapat 400 kotak kecil didalam kotak tengah.

25
5. Hitunglah jumlah sel yang terdapat pada 80 kotak kecil
6. Perhitungan jumlah sel:
 Jumlah sel dalam setiap 1 mm2 hemasitometer =

 Kedalaman cairan pada hemasitometer adalah 0,1 mm, maka volume

cairan yang tercelup kedalam kotak berukuran 1 mm 2adalah 0,1 mm3,
sehingga jumlah sel dalam setiap mm3 (sel/mm3)

 Jumlah sel dalam suspense awal (sel/ml) = jumlah sel dalam setiap
mm3x 1000 mm3/ml

2. METODE PERHITUNGAN CAWAN

Pendahuluan
Metode perhitungan cawan prinsipnya adalah bahwa setiap sel
mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium akan berkembang
membentuk koloni. Metode ini paling sensitif karena hanya sel hidup
yang dihitung, beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus,
dapatdigunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni
yang terbentuk meungkin berasal dari satu sel mikroba dengan
penampakan pertumbuhan yang spesifik. Teknik pengenceran sampel
dan inokulasi pada cawan perlu dikuasai untuk mengerjakan metode
cawan. Pengenceran sampel betujuan untuk mendapatkan jumlah koloni
yang dapat dihitung pada cawan. Dalam persyaratan mikrobiologi cawan
yang diplih untuk perhitungan koloni yaitu cawan yang mengandung
koloni antara 30 – 300 koloni. Karena jumlah mikroorganisme pada
sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-
kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang
memenuhi syarat tersebut maka dilakukan sederetan pengenceran.
Jumlah mikroorganisme yang terdapat pada sampel asal ditentukan
dengan mengalikan jumlah koloni yang terhitung dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Metode cawan ini dapat dibedakan dalam dua cara yaitu (1)
metode Tuang (Pour Plate), dimana pada metode ini bahan pangan yang
diperkirakan mengandung mikroba dan telah diencerkan, dimasukkan ke
dalam cawan petri kemudian dituangkan ke dalam cawa medium agar
cair steril yang bersuhu 47-50oC. banyaknya media yang dituangkan ke
dalam cawan sebanyak 2/3 tinggi cawan selanjutnya diinkubasi setelah
media memadat. (2) metode Permukaan (Surface Plate/ spread Plate).
Pada metode ini media disterilkan lebih dahulu dan dituangkan ke dalam
cawan dibiarkan membeku/memadat. Setelah memadat sampel yang
telah diencerkan dipipet dan diinokulasi ke permukaan media, diratakan
dengan spreader dan diinkubasi.
Cara menghitung koloni:1). Cawan yang dipilih dan dihitung
adalah yang mengndung jumlah koloni antara 30-300, (2). Beberapa
koloni yang berganung mnjadi satu merupakan suatu kumulan koloni

26
yang terlihat sebagai suatu garis tebal., (3) perbandingan jumlah bakteri
dari hasil pengenceran yang berturut turut antara pengenceran yang lebih
besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2,
haslnya dirata rata; tetapi jika lebih besar dari 2, yang dipakai jumlah
mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya., (4). Jika dilakukan ulangan
(duplo), setelah memenuhi syarat hasilnya dirata rata.
Perhitungan:
Faktor pengenceran =FP
FP = pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x jumlah yang
ditumbuhkan
Koloni per mL = Jumlah koloni x (1/FP)

Contoh perhitungan:
1. Penetapan jumlah koloni dalam sampel cair.
Pengenceran awal 1:10 )=10-1) dibuat dengan cara mengencerkan
1 mLsampel ke dalam 9 mL larutan pengencer, dan dilanjutkan dengan
pengenceran yang lebih tinggi misalnya sampai 10-5 atau 10-6,
tergantung pada mutu sampelnya (bahannya). Semakin tinggi jumlah
mikroba yang terdapat di dalam bahan sampel semakin tinggi
pengenceran yang harus dilakukan. Jika setelah inkubasi diperoleh 62
koloni cawan yang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni
dapat dihitung sebagai berikut (1 mL larutan pengencer dianggap
mempunyai berat 1 gram).

FP = pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x jumlah yang

ditumbuhkan.
FP = 1/10 x 1/10x1/10x1/10 x 1,0
= 10-4
Koloni per mL = jumlah koloni x FP
= 62 x 1/10-4
= 62 x 104
= 6,2 x 105

2. Penetapan total mikroba dari bahan padat.

Jika 1,3 gram bahan padat misalnya keju, diencerkan dengan 48
mL alrutan pengencer, dan dibuat pengenceran selanjutnya yaitu 1:7,
1:65, kemudian 1 mL dari pengenceran terakhir diencerkan lagi dengan
74 mL larutan pengencer. Dari pengenceran yang terakhir, sebanyak 0,1
mL diinokulasikan pada permukaan cawan petri yang berisi media padat.
Setelah inkubasi ternyata pada pengeceran yang terttinggi tumbuh 172
koloni.

Penetapan jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut :

Faktor pengenceran = Pengenceran awal x Pengenceran selanjutnya x
Jumlah yang ditumbuhkan

1,3 1 1 1
= x x x x 0,1
48  1,3 7 65 74  1

27
 1,3
=
49,3 x 7 x 65 x 75 x 10

Jumlah koloni per gram = juml koloni X FP

49,3 x 7 x 65 x 75 x 10
= 172 x
1,3
= 2 225 895 000
= 2,2 x 109

Cara pengenceran di atas perhitungannys tidak praktis. Cara yang

lebih praktis adalah dengan mengencerkan sampel secara decimal sampai
pengenceran 10-7, misalnya dengan pengenceran 1:10 (yaitu 5 g sampel
dalam 45 mL larutan pengencer), 1:103, 1: 105, dan 1: 107, kemudian 1
mL dari pengenceran terakhir diinokulasi pada medium dalam cawan.
Setelah inkubasi tumbuh koloni sebanyak 220, sehingga”

1
Jumlah koloni per gram = 220 x
10  7

= 2,2 x 109

Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk melakukan perhitungan jumlah
mikroba pada sampel dengan menggunakan metode hitungan cawan /
Total Plate Count.

Alat dan bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini yaitu cawan petri,
tabung reaksi, pipet mikro, bunsen, dan incubator. Sedangkan bahan yang
digunakan yaitu sampel, larutan garam fisiologis, dan mediun PCA.

Prosedur kerja
1. Siapkan empat seri tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam
fisiologis yang sudah disterilisasi.
2. Masukan 1 ml atau 1 gr sampel kedalam tabung reaksi pertama (10 -1).
Homogenkan larutan dengan menggunakan vortex.
3. Ambil 1 ml sampel dari tabung reaksi pertama dan masukan kedalam
tabung reaksi kedua (10-2).
4. Lakukan pengenceran hingga tabung reaksi ke empat (10 -4).
5. Inokulasi sampel yang telah telah diencerkan dari tabung reaksi ke-4
sejumlah 1 ml (10-4) dan 0,1 ml (10-5) pada cawan yang telah berisi
PCA dengan menggunakan metode sebar.
6. Inkubasi sampel selama 2 hari pada suhu 320C.
7. Hitung jumlah koloni yang terdapat pada cawan dengan menggunakan
bantuan colony counter.

28
8. Tentukan jumlah mikroba yang terdapat di dalam sampel.

1. Penghitungan Mikroba permukaan Daging/Ikan

(McLandsborough, 2003)
1. Dengan menggunakan batang pengoles (swab) steril, yaitu batang lidi
yang pada bagian ujungnya dibungkus kapas, mikroba pada
permukaan contoh seluas 4 cm 2 (2cm x 2 cm) diambil dengan cara
mengoleskan batang pengoles yang sudah dibasahi dengan 5 ml air
pengencer steril, ke kiri dan ke kanan masing-masing sebanyak tiga
kali pada luas permukaan 4 cm2. Cara ini dapat dilakukan dengan
membuat cetakan penolong seluas 2 cm x 2 cm yang terbuat dari
alumunium foil atau alumunium steril.
2. Batang pengoles yang telah dioleskan tersebut kemudian direndam di
dalam air
pengencer atau air destilata steril yang sebelumnya telah digunakan
untuk membasahi batang pengoles tersebut.
3. Batang diputar-putar dan diperas pada dinding tabung untuk
melepaskan mikroba yang melekat pada kapas pengoles tersebut. Dari
suspensi olesan tersebut dibuat pengenceran sampai 1 : 1000 atau 1 :
10000 atau lebih tinggi, tergantung dari mutu daging atau ikan,
diperlukan pengenceran yang semakin tinggi untuk dapat menghitung
jumlah mikroba pada permukaan.
4. Penumbuhan mikroba dibuat dari pengenceran yang dikehendaki,
masing-masing empat cawan untuk setiap pengenceran, yaitu dua
cawan (duplo) diberi PCA dan dua cawan lainnya untuk medium VRB.
Inkubasi dilakukan pada suhu 25oC selama 3 – 5 hari. Jumlah koloni
yang tumbuh pada PCA dan VRB dihitung, tetapi untuk menghitung
jumlah koloni yang berwarna merah tua (merah (ungu) yang ditandai
dengan pengendapan bila disekitarnya (batas pinggir koloni tidak
jelas). (Catatan : untuk daging/ikan air tawar pemupukan dilakukan
pada media VRBA, PCA dan NA sedangkan untuk ikan laut/kerang
dilakukan pada media VRBA, TCBSA, PCA dan NA ).
5. Perhitungan bakteri pada permukaan contoh adalah sebagai berikut:
Jumlah koloni per 4 cm2 permukaan = jumlah koloni dalam 5 mL
suspensi olesan.
= 5 x jumlah koloni per mL suspensi olesan
= 5 x jumlah koloni per cawan x 1/pengenceran
Jumlah koloni per cm2 = ¼ x 5 x jumlah koloni per cawan x
1/pengenceran

Sayuran Daun (Fardiaz, 1987)

1. Potonglah secara aseptik sayuran seluas 2 cm x 2,5 cm atau 2 x 1 cm x
2,5 cm,menggunakan pinset dan pisau/gunting yang terlebih dahulu
sudah dicelupkan ke dalam alkohol dan dipijarkan.
2. Celupkan potongan tersebut ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 25
ml larutan pengencer.
3. Setelah dikocok sebanyak 25 kali, lakukan pemupukan suspensi
tersebut sebanyak 1ml atau 0,1 ml, masing-masing pada dua cawan .

29
4. Tuangkan media agar (VRBA, PCA dan NA) pada masing-masing
cawan biarkan memadat dan diinkubasikan pada posisi terbalik pada
suhu 30 – 32oC selama 48 – 72 jam.
5. Hitung koloni yang tumbuh dan hitung jumlah koloni mikroba per cm2
permukaan sayuran.
Jika penumbuhan dilakukan 1 mL maka:
Jumlah koloni mikroba per cm2 =
1cm 2 25mL
= 2
x x jumlah koloni rata rata 1mL suspensi
2 x 2,5 cm 1mL
Jika pemupukan dilakukan 1 mL maka:
Jumlah koloni mikroba per cm2 permukaan=

1cm 25mL
2
x x jumlah koloni rata rata 0,1mLsuspensi =
2 x2,5cm 0,1mL

2. Penghitungan mikroba pada sayuran (Fardiaz, 1987)

1. Potong sayuran secara aseptic seluas 2 cmx2,5 cm aau 2cm x 1cmx
2,5cm, menggunakan pinset dan pisau/gunting yang telah didesinfeksi
menggunakan alkohol dan dipijarkan.
2. celupkan potongan sampel ke dalam labuErlenmeyer yang berisi 25
mL larutan pengencer.
3. setelah dokocok sebanyak 25 kali, lakukan penanaman suspensi
sampel sebanyak 1 mL atau 0,1mL masing masing pada dua cawan.
4. tuangkan media agar VRBA, PCA dan NA pada masing masing cawan
dan biarkan memadat, kemudian diinkubasi pada posisi terbalik pada
suhu 30-32oC selama 48 -72 jam.
5. dihitung koloni yang tumbuh dan dihitung jumlah koloni mikroba per
cm2 permukaan sayuran.

Bila penanaman sampel sebanyak 0,1 mL, maka:

Jumlah koloni mikroba per cm2 permukaan

1 cm 2 25mL
= 2
x x jumah koloni rata rata 0,1 suspensi
2 x2,5cm 0,1mL

Bila sampel yang diinokulasikan sebanyak 1mL, maka

Jumlah koloni mikroba per cm2 permukaan +
1cm 2 25mL
= 2
x x jumlah koloni ratarata 1mL suspensi
2 x 2,5cm 1mL

3. Penghitungan mikroba pada telur (Robert and Greenwood, 2003)

1. Telur dicuci dengan air sabun sampai bersih, tiriskan lalu dicelupkan
ke dalam alkoho 70% selama 10 menit, dan ditiriskan.
2. Letakkan, di atas pinggan alumunium, dan pijarkan bagian ujung yang
runcing sehingga alkohol habis terbakar.

30
3. Lubangi bagian ujung yang runcing tersebut, lalukan di atas api
sebentar, dan dituangkan seluruh isinya ke dalam gelas piala steril.

Pengenceran
1. Setelah telur yang dipecahkan dikocok dengan sendok atau spatula
steril, pipet 10ml atau timbang 10 gram ke dalam 90 ml larutan
pengencer yang berisi butiran gelas, sehingga diperoleh pengenceran 1 :
10. Butiran gelas ditujukan untuk membantu memecahkan membran-
membran.
2. Kocok sebanyak 25 kali, dan buatlah pengenceran selanjutnya yaitu
10-2.
.
Penumbuhan
1. Lakukan penumbuhan duplo sehingga di dalam cawan mengandung
contoh sebanyak 10-1, 10-2, 10-3 ml atau gram.
2. Tuangkan media cair (VRBA, SSA, PCA dan NA) ke dalam cawan,
dan goyangkan supaya merata. Setelah agar memadat, inkubasikan
dengan posisi terbalik pada suhu 30 – 32oC selama 48 – 73 jam.

4. Produk Turunan Susu (Mentega)

Uji yang dilakukan terhadap mentega terutama adalah penentuan
jumlah kapang dan khamir.Dengan menggunakan spatula, pindahkan
kira-kira 15-20 gram mentega kedalam tabung reaksi berukuran besar
yang sudah steril.Rendam tabung tersebut di dalam penangas air pada
suhu 45° C selama 10 menit. Menggunakan pipet yang masih hangat,
pindahkan sebanyak 10 ml mentega cair kedalam larutan pengencer 90
ml. Setelah dikocok, buatlah pemupukan duplo sebanyak 10-, 10-2 dan
10-3 ml contoh menggunakan Acidified Potato Dextrose Agar (pH± 3,5).
Setelah inkubasi pada suhu kamar selama 3-5 hari, hitung jumlah koloni
yang tumbuh, dan laporkan jumlah kapang dan khamir per ml mentega.

5. Susu Pasteurisasi

Uji terhadap susu pasteurisasi dilakukan untuk melihat adanya

bakteri termodurik yang masih hidup setelah proses pasteurisasi. Pipetlah
5 ml susu mentah kedalam tabung reaksi bertutup ulir. Contoh susu
jangan sampai tercecer pada leher atau bagian atas tabung reaksi.
Letakkan tabung berisi susu tersebut kedalam penangas air pada suhu
63°C (tepatnya 62,8°C). Sebagai control terhadap suhu, letakkan juga
satu tabung berisi susu dan thermometer. Setelah suhu pada tabung
control mencapai 62,8° C, hitung waktunya sampai 30 menit. Kemudian
tabung diangkat dan dinginkan segera dengan mencelupkan didalam air
yang diberi es.
Buatlah pengenceran 10-1 dan 10-2 dari contoh susu yang telah
dipasteurisasi tersebut, dan lakukan pemupukan duplo yang berisi 10 -,
10-2 dan 10-3 ml contoh menggunakan Plate Count Agar. Inkubasikan
pada suhu 30-32° C selama 2-3 hari. Hitung koloni yang tumbuh dan

31
laporkan sebagai jumlah bakteri termodurik per ml atau LPC (Laboratory
Pasteurization Count) per ml.

6. Susu Bubuk

Timbang sebanyak 10 gram susu bubuk dan pindahkan kedalam 90 ml

larutan pengencer yang telah dihangatkan sampai 45° C. Kocok perlahan-
lahan, diamkan 1-3 menit, dan kocok kembali dengan baik sampai susu
bubuk larut. Hindari timbulnya busa yang berlebihan. Buatlah
pengenceran sampai 10-2, dan lakukan pemupukan duplo sebanyak 10-
1
,10-2,10-3 ml contoh menggunakan Plate Count Agar. Setelah inkubasi
selama 2-3 hari pada suhu 30-32° C, hitung jumlah koloni yang tumbuh,
dan laporkan jumlah mikroba per gram susu bubuk.

7. Produk Turunan Susu (Es krim)

Dengan menggunakan spatula, pindahkan kira-kira 15-20 gram

es krim kedalam tabung reaksi berukuran besar yang sudah steril.
Rendam tabung tersebut didalam penangas air pada suhu 45° C sampai es
krim meleleh seluruhnya. Waktu untuk melelehkan es krim tidak boleh
lebih dari 15 menit. Es krim diaduk dan pindahkan sebanyak 10 ml
kedalam larutan pengencer 90 ml. Setelah dikocok, lakukan pengenceran
selanjutnya sampai 10-2. Buatlah pemupukan duplo sebanyak 10-1, 10-2,
10-3 ml contoh menggunakan plate count agar. Setelah inkubasi
selama 2-3 hari pada suhu 30-32° C, hitung jumlah koloni yang tumbuh,
dan laporkan jumlah mikroba per ml es krim.

3. METODE TURBIDIMETRI
Pendahuluan
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan
menggunakan metode turbidimetri. Metode ini merupakan metode yang
cepat untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu larutan secara tidak
langsung. Perhitungan jumlh mikroba dilakukan dengan mengukur
tingkat kekeruhan suatu sampel dengan spektrofotometer. Mikroba dalam
suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya.
Pertumbuhan sel bakteri dalam suatumedium cair akan meningkatkan
kekeruhan media, yang akanmempengaruhi jumlah sinar yang dapat
ditransmisikan menembus medium. Metode pengukuran ini tidak dapat
membedakan antara sel hidung dan sel mati yang terdapat pada sampel.
Pada pengukuran menggunakan spektrofotometer, cahaya yang
mengenail sel mikroorganisme di dalam suspensi sampel akan
dihamburkan, sedangkan cahaya yang lolos akan diteruskan melewati
sampel dan mengaktivasi foto tabung yang akan mencatat nilai persen
transmitannya (%T). Semakin sedikit jumlah sel didalam suspense, maka
semakin besar intensitas cahaya yang lolos dan semakin tinggi pula
persen transmitant yang tercatat. Nilai transmitant kemudian diubah dan

32
dinyatakan sebagai nilai absorbant (A) atau rapat optis. Kolerasi antara
rapat optis suatu sampel dengan jumlah sel dapat ditentukan dengan
membandingkan jumlah koloni yang tumbuh pada metode hitungan
cawan dengan nilai absorban (A) yang didapat dari hasil pengukuran
spektro pada tingkat pengenceran yang sama.

Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan utnuk mengetahui metode perhitungan
mikroorganisme dengan menggunakan spektrofotometer.

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini yaitu tabung reaksi,
pipet mikro, bunsen, incubator, dan spektrofotometer. Sedangkan bahan
yang digunakan yaitu sampel yang akan diuji, larutan garam fisiologis,
dan NB.

Prosedur kerja
1. Siapkan empat seri tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam
fisiologis yang sudah disterilisasi.
2. Masukan 1 ml atau 1 gr sampel kedalam tabung reaksi pertama (10 -1).
Homogenkan larutan dengan menggunakan vortex.
3. Ambil 1 ml sampel dari tabung reaksi pertama dan masukan kedalam
tabung reaksi kedua (10-2).
4. Lakukan pengenceran hingga tabung reaksi ke empat (10 -4).
5. Inokulasi sampel yang telah telah diencerkan dari tabung reaksi ke-4
sejumlah 1 ml (10-4) dan 0,1 ml (10-5) pada tabung reaksi yang telah
diisi dengan NB steril.
6. Inkubasi sampel selama 2 hari pada suhu 320C.
7. Ukur nilai kekeruhan sampel dengan menggunakan spektrofotoeter
pada panjang gelombang 240 nm.
8. Tentukan nilai absorban pada setiap sampel.
9. Buatlah grafik kolerasi antara nilai absorban dan jumlah koloni yang
terhitungpada metode cawan.

Lampiran. Aturan SPC (Fardiaz, 1987)

SPC (Standart Plate Count) adalah standar yang menjelaskan mengenai
cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada
untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu sampel. Cara
menghitung koloni adalah sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah
koloni antara 30-300
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat
dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitungsebagai satu koloni

33
Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan-peraturan
sebagai berikut :
1.Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama
dan kedua.Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5,
harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua.

Jumlah koloni per pengenceran Standard plate Keterangan

count
10-2 10-3 10-4
234 28 1 2,3x104 28 dan 1<30
700 125 10 1,3 x 105 700>300; 10<30
TBUD TBUD 197 2,0x106 TBUD>300

2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

kurang dari 30 koloni pada cawan petri (<30), hanya jumlah koloni
pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dihitung
sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi
jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per Standard plate Keterangan

pengenceran count
-2 -3 -4
10 10 10
16 1 0 <30 x 103 Hitung pengenceran 10-2
(1,6x103)

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

lebih dari 300 koloni pada cawan petri (>300), hanya jumlah koloni
pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara
menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri, kemudian hasilnya
dikalikan 4. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per Standard Keterangan

pengenceran plate count
10-2 10-3 10-4
TBUD TBUD 355 >3,0x106 Hitung pengenceran 10-4
(3,6x106)
TBUD 325 20 >3,0x105 Hitung pengenceran 10-4
(3,3x105)

4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan

jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan
2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan
mempertimbangkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil

34
 tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil
yang terkecil.

Jumlah koloni per Standard Keterangan

pengenceran plate count
-2 -3 -4
10 10 10
293 41 4 3,5 x 104 Hitung rata-ratanya karena
41000/29300 = 1,4 (<2)
140 32 2 1,4x104 Hitung pengenceran 10-2
karena
32000/14000 = 2,3

5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil dari salah
satu.

Jumlah koloni per Standard Keterangan

pengenceran plate count
10-2 10-3 10-4
175 16 1 1,9 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2
208 17 0
138 42 2 1,5 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2
162 43 4 karena perbandingan antara
pengenceran 10-3, dan 10-2
adalah 2,4
290 36 4 3,1x104 Rata-rata dari pengenceran 10-2
280 32 1 Dan 10-3 karena perbandingan
antara kedua pengenceran
adalah 1,2
291 25 3 3,0x104 Rata-rata dari pengenceran 10-2
305 27 0 meskipun 305>300

35
4. METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN)
Pendahuluan
Most Probable Number (MPN) merupakan suatu metode
perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif hasil
pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik. Perhitungan
dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif yang ditumbuhi mikrobia
setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang
positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau
terbentuknya gas pada tabung durham. Metode MPN biasanya digunakan
untuk menghitung total koliform pada sampel yang berbentuk cair,
meskipun dapat juga untuk sampel padat dengan terlebih dahulu
membuat suspensi 1:10 dari sampel tersebut. Prinsip dari metode ini
yaitu mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu agar setelah inkubasi
diharapkan terjadi pertumbuhan pada tabung positif – negative
dicocokkan dengan Tabel nilai MPN untuk 3 seri tabung atau 5 seri
tabung sesuai seri yang digunakan. Dengan pengenceran akan didapatkan
konsentrasi dimana semakin rendah tingkat pengenceraannya maka akan
semakin banyak tabung positif yang muncul dan semakin tinggi tingkat
pengencerannya semakin jarang tabung positif yang muncul.Tabung
positif merupakan tabung yang terdapat gelembung gas di dalam tabung
durham. Kombinasi yang dipilih untuk nilai MPN yang dimaksud
dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua
tabung positif, sedangkan pada pengenceran yang berikutnya ada tabung
yang negatif. Jika pada pengenceran yang keempat atau seterusnya masih
ditemukan tabung yang hasilnya positif tersebut harus ditambahkan pada
nilai kombinasi yang ketiga (terakhir). Metode MPN dapat digunakan
untuk menghitung jumlah mikroba jenis tertentu yang terdapat di antara
mikroba-mikroba lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactose broth
maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan
dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasanya
digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman
karena bakteri koliform termasuk bakteri yang dapat memfermentasi
laktosa. Kombinasi kemunculan tabung positif dan negative
menggambarkan prakiraan konsentrasi mikroorganisme pada sampel
sebelum diencerkan. Berikut di bawah ini adalah table yang menunjukan
nilai MNP dari 3 seri sampel.

Cara perhitungan MPN:

Tabel. Hasil pengamatan pada metode MPN (Fardiaz, 1987)
Juml tabung positif pada Kombinasi Nilai MPN Count
pengenceran MPN MPN/mL
10-2 10-3 10-4
10-5
(3 2 1) 3 2 1 1,50 1,5x 103
0

36
 (3 1 1) 3 1 1 0,75
0
(3 (3 2 3 2 1 1,50
1)
(0 2 0) 0 2 0 0,062
0

Kombinasi 3 2 1
Nilai MPN dari Tabel MPN (3 tabung) = 1,50
1
MPN Count = Nilai MPN x
Pengenceran tabung yan di tengah
3
= 1,50 x 1/10-
= 1,5 x 10-3

Kombnasi 3 1 1
Nilai MPN dari Tabel MPN (3 tabung) = 0,75

1
MPN Count = Nilai MPN x
Pengenceran tabung yang di tengah

= 0,75 x 1/10-3
= 7,5 x 102
Tujuan
Praktium ini bertujuan untuk menghitung jumlah mikroba dengan
menggunakan metode Most Probable Number (MPN)

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini yaitu tabung
reaksi ulir, tabung durham, pipet mikro, bunsen, dan incubator.
Sedangkan peralatan yang digunakan yaitu medium LB dan sampel
air yang akan diuji.

Prosedur kerja
1. Siapkan sembilan tabung reaksi ulir yang telah diisi dengan medium
LB steril dan dilengkapi dengan tabung durham.
2. Nomori tabung dengan seri A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, dan C3.
3. Masukan 1 ml sampel kedalam tabung reaksi A1, A2, A3.
4. Masukan 1 ml sampel kedalam tabung reaksi B1, B2, B3.
5. Masukan 1 ml sampel kedalam tabung reaksiC1, C2, dan C3.
6. Inkubasi sampel selama satu hari pada suhu 30m-32oC selama 48 jam.
7. Hitung jumlah tabung yang mengandung gelembung gas pada tabung
durham untuk setiap seri.
8. Tentukan nilai MPN dari seri tersebut pada table
9. Total MPN sampel =

Uji Penguat (Fardiaz, 1993)

37
 Terbentuknya gas di dalam LB atau dalam BGLBB tidak selalu
menunjukkan jumlah bakteri koli karena mikroba lainnya mungkin juga
ada yang memfermentasi laktosa dengan membentuk gas, misanya
bakteri asam laktat dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu perlu
dilakukan penguat pada agar EMB. Dengan menggunakan jarum Ose,
contoh dari tabung MPN yang menunjukkan uji penduga positif
(terbentuk gas) masing masing diinokulasikan pada agar cawan EMB
dengan cara menggores kwadran, kemudian diinkubasi pada suhu 35 oC
selama 24jam. Jumlah cawan EMB pada masing masing pengenceran
yang menunjukkan adanya pertumbuhan koliform, baik fecal maupung
nofekal dihitung, dan MPN penguat dapat dihitung dari Tabel MPN 7
tabung atau 15 tabung.

38
Gambar 12. Tabel Nilai MPN tiga seri tabung (Fardiaz, 1993)

39
40
Enumerasi Langsung

Enumerasi mikroba secara langsung dilakukan dengan cara

menghitung jumlah sel yang tampak pada pengamatan dengan
menggunakan mikroskop. Teknik ini banyak digunakan karena dapat
dilaksanakan dengan cepat dan murah dengan meggunakan alat yang
disebut dengan counting chamber. Alat ini berupa lempeng gelas yang
pada permukaannya dibuat petak-petak yang sangat kecil berbentuk bujur
sangkar dengan luas dan kedalamam tertentu (misal luas petak 1/400
mm2 dan kedalaman 0,05 mm). Sebagai contoh yang ada di
pasaran :Hawksley counting chamber, Petroff-Hauser counting chamber,
Haemocytometer.

TUJUAN PRAKTIKUM :

Mahasiswa mampu menentukan jumlah petak yang ada pada

haemocytometer

haemocytometer

BAHAN DAN ALAT

Alat : Haemocytometer (perhatikan luas maupun kedalaman petak yang
tertera pada alat tsb), micropipette atau sejenis, mikro tip
Bahan :
cerevisiae dalam media cair PGY

PROSEDUR KERJA (Kasmidjo, dkk., 1994)

1. Bersihkan haemacytometer dan gelas penutupnya dengan larutan
detergen, bilas dengan air suling lalu alkohol, kering anginkan.
2. Suspensi yeast yang akan ditentukan jumlah selnya digojog dengan
vortex sehingga tercampur merata.
3. Ambil suspensi tersebut dengan pipet sebanyak kira-kira 5 –
(gunakan micropipette) dan teteskan tepat pada petak-petaknya.
4. Tutuplah dengan gelas penutupnya dan letakkan pada meja mikroskop.
5. Mula-mula amati dengan menggunakan perbesaran lemah untuk
menemukan petak-petaknya. Kemudian tentukan dari petak mana
penghitungan akan dimulai, misalnya, mulai dari petak yang berada
disudut kiri atas.
6. Kemudian perbesaran mikroskop diubah ke perbesaran sedang, atur
focus sampai sel-sel yeast nampak jelas.
7. Hitung jumlah sel dalam setiap petak kecil. Sel-sel yang berada pada
garis batas atas atau batas kanan dihitung sebagai milik petak yang
bersangkutan, tapi bila berada pada batas bawah atau batas kiri tidak
dihitung. Lakukan hal yang sama untuk petak-petak berikutnya.
Dalam melakukan penghitungan gunakan tally counter untuk mencatat
jumlah sel dalam setiap petak. Hindari menghitung ulang untuk petak

41
 yang sama. Catatlah jumlah sel setiap petak maupun jumlah
petakyang dihitung.
8. Tentukan jumlah sel yeast rata-rata dari 25 petak untuk menghitung
jumlah selyeast tiap ml bahan.

Jumlah sel rata-rata tiap petak x1000 x FP

Jumlah sel/ml = -------------------------------------------------------------------
Luas petak (mm2) x kedalaman petak (mm)

Catatan : Bila jumlah sel yeast tiap petak terlalu banyak, maka suspensi
yeast diencerkan dengan larutan pengencer steril sampai jumlah sel setiap
petak sekitar 50. Catatlah faktor pengenceran yang digunakan.

1mm
Volume = 0,1 mm3
1mL = 1 cm3= 1000mm3
1 mm

1 mm

Gambar: Haecytometer

42
 BAB 9
PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN
TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA

PENDAHULUAN
Syarat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh keberadaan nutrisi
dan kondisi lingkungan tempat mikroba tersebut tumbuh. Kondisi
lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba diantaranya yaitu,
suhu, pH, keberadaan gas atmosfer, keberdaan cahaya, air dan kadar
garam pada medium. Mikroorganisme dapat tumbuh pada kondisi
lingkungan sesuai dengan karakteristik mikroorganisme tersebut.
Mikroorganisme yang tumbuh pada suhu 0 – 30oC disebut
mikroorganisme psikrofil, pada suhu 25 – 40oC disebut mesofil dan
mikroba yang tumbuh pada suhu diatas 50oC disebut mikroba termofil.
Pada tingkat keasaman yang berbeda, mikroorganisme dapat
dikelompokan menjadi mikroba asidofil yang tumbuh pada pH 2 -5,
mesofil tumbuh pada pH 5.5 – 8.0 dan alkalifil yang tumbuh pada pH 8.4
-9.5. Berdasarkan keberadaan oksigen di udara mikroorganisme dapat
dibedakan menjadi aerob yaitu mikroba yang akan tumbuh dengan
keberadan oksigen dan mikroba anaerob yaitu mikroba yang tumbuh
tanpa adanya oksigen. Selain itu, terdapat mikroorganisme yang tumbuh
pada kondisi dengan kadar garam tinggi yang disebut dengan mikroba
halofil.

TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu, pH dan
kadar garam (tekanan osmosis medium) terhadap pertumbuhan mikroba.

ALAT DAN BAHAN

Peralatan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu tabung
reaksi,sumbat kapas, erlenmeyer, ose, bunsen, oven, inkubator dan
refrigerator. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu medium Nutrient
Broth, HCl, NaOH, NaCl, alkoho dan biakan mikroba.

PROSEDUR KERJA
a. Pengaruh Faktor Suhu terhadap Pertumbuhan Mikroba
1. Siapkan 3 tabung reaksi berisi medium Nutrient Broth sebanyak 7 ml
untuk setiap tabung
2. Sterilisasi medium sebelum digunakan.
3. Inokulasikan 2 ose biakan mikroba ke dalam medium yang telah
dingin. Lakukan pekerjaan dengan cara aseptis.
4. Simpang tabung reaksi pertama pada incubator (suhu 32 oC), taung
reaksi kedua pada referigator (suhu 4oC), dan tabung ketiga pada oven
(suhu 70oC) selama 2 hari.
5. Amati dan bandingkan kekeruhan dan pembentukan endapan pada
medium untuk setiap perlakuan.

b. Pengaruh pH pada Pertumbuhan Mikroda

43
1. Siapkan 3 tabung reaksi berisi medium NB yang memiliki pH masing-
masing 3, 7, dan 9.
2. Sterilisasi medium sebelum digunakan.
3. Inokulasikan 2 ose biakan mikroba ke dalam medium yang telah
dingin. Lakukan pekerjaan dengan cara aseptis.
4. Inkubasi biakan pada suhu 32oC selama 2 hari
5. Amati dan bandingkan kekeruhan dan pembentukan endapan pada
medium untuk setiap perlakuan

c. Pengaruh Tekanan Tekana Osmosis pada Pertumbuhan Mikroba

1. Siapkan 5 tabung reaksi berisi medium NB yang telah diberikan NaCl
dengan konsentrasi 0, 1%, 3%, 5%, dan 10%
2. Sterilisasi medium sebelum digunakan.
3. Inokulasikan 2 ose biakan mikroba ke dalam medium yang telah
dingin. Lakukan pekerjaan dengan cara aseptis.
4. Inkubasi biakan pada suhu 32oC selama 2 hari
5. Amati dan bandingkan kekeruhan dan pembentukan endapan pada
medium untuk setiap perlakuan.

DAFTAR PUSTAKA
Cappuccino, J.G. and Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory
Manual.Addison-Wesley Publishing Company: Calofornia.
Fardiaz, S. 1987. Penuntuk Praktek Mikrobiologi Pangan. Lembaga
Sumberdaya. Informasi Institut Pertanian Bogor : Bogor.
Fardiaz, S. 2003. Analisa Mikrobiologi Pangan. PT. RajaGrafindo
Persada : Jakarta.
Kasmidjo, R., dkk. 1994. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Terapan.
Fakultas Teknologi Pertanian UGM : Yogyakarta.
McLandsborough, L. 2003. Food Microboilogy Laboratory. CRC Press :
Boca Raton.
Roberts, D. and Greenwood, M. 2003. Practical Food Microbiology.
Blackwell Publishing : London
SapariantiE, Ningtyas DW, Nurcholis M, Sarita I, Heppy F., 2014. Buku
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Terapan, Jur THP, Fakultas
Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya.

44