PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI UMUM

NAMA :

NO BP :

KELOMPOK :

DOSEN PENDAMPING :

LISA YUSMITA, S.TP, MP

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

UNIVERSITAS DHARMA ANDALAS
2024
Hafsan, S.Si., M.Pd.
Eka Sukmawaty, S.Si., M
1
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat rahmat dan
kasih sayang-Nya juga Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum ini dapat diselesaikan
dengan baik. Penuntun praktikum ini disusun untuk membantu mahasiswa dalam
melaksanakan praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum, sehingga dapat menguasai
ketrampilan di laboratorium secara maksimal. Penuntun praktikum ini mencakup
pengenalan alat-alat laboratorium Mikrobiologi pada umumnya, Sterilisasi, Cara dasar
dalam pembuatan medium pertumbuhan, Isolasi mikroorganisme, Teknik pemindahan
mikroba, Penghitungan mikroba dan Pewarnaan gram. Disadari bahwa penyusunan
penuntun praktikum ini belum sempurna, maka masukan yang positif dari pembaca sangat
diharapkan demi perbaikan dimasa datang. Semoga penuntun praktikum ini bermanfaat
bagi kita semua.

Padang, Desember 2023

Penyusun

2
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) wajib hadir 5 menit sebelum acara

praktikum berlangsung.
2. Praktikan diharuskan memakai jas praktikum berwarna putih yang bersih (sebelum
memasuki laboratorium), sandal jepit bersih, alat pelindung berupa sarung tangan
(handscoon) dan masker (pada saat pengambilan dan penimbangan media,
inokulasi mikroba, isolasi mikroba dan perlakuan yang berhubungan dengan
mikroba. Pemakaian jas praktikum dan masker juga diwajibkan saat melakukan
pengamatan hasil di luar jam praktikum).
3. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja
sebelum praktek berlangsung.
4. Praktikan bekerja secara berkelompok sesuai pengelompokan yang telah ditentukan
dan diharapkan proaktif untuk belajar. Tiap-tiap kelompok kecil bekerja bersama-
sama dalam satu meja untuk tiap acara praktikum.
5. Praktikan diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai
praktikum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalikan dalam
kondisi bersih dan utuh. Semua praktikan bertanggung jawab terhadap kebersihan
dan keamanan ruang praktikum serta alat-alat yang digunakan.
6. Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan
melapor ke asisten. Praktikan yang merusakkan, memecahkan atau menghilangkan
alat diwajibkan menuliskan pada blangko yang telah disediakan di lab di bawah
pengawasan assisten.
7. Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan
menjauhkan segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil
praktikum.
8. Pengamatan praktikum dilakukan sesuai kebutuhan dan waktu yang telah
ditentukan.
9. Pengamatan praktikum yang dilakukan di luar jam praktikum harus didampingi
oleh assisten. Praktikan bisa membuat kesepakatan dengan assisten sesuai
kebutuhan dan waktu yang diperlukan.

3
 10. Bila praktikan berhalangan dan tidak dapat mengikuti acara praktikum yang
menyebabkan nilai-nilainya kosong, maka nilai akhir adalah seluruh nilai yang ada
dan kemudian dikonversi berdasar standar nilai yang telah ditetapkan.

SOP PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Setiap praktikan akan selalu berhubungan dengan mikroba patogen selama

menjalankan Praktikum Mikrobiologi. Untuk mencegah hal-hal yang tidak diinginkan,
setiap praktikan diharuskan mentaati peraturan yang telah ditetapkan dan menjalankan
petunjuk yang diberikan assisten.
1. Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang
disediakan. Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium!
2. Sekalah baik-baik meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah
kegiatan laboratorium.
3. Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk
ke toilet atau bila anda ke luar dari ruangan laboratorium.
4. Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium.
5. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di
laboratorium.
6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen atau mampu
menimbulkan penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak
berbahaya, tetapi beberapa diantaranya berbahaya.
7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apa pun dari ruangan
mikroba/ruangan laboratorium.
8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur
dengan mikroba lain.
9. Bila biakan yang sedang anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja praktikum,
tuangkan desinfektan di atasnya, seka dengan kertas tissue/kapas dan buang di
tempat yang disediakan untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi.
10. Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya,
sapukan dan buang di tempat yang disediakan untuk pecahan kaca.
11. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten.
4
12. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan.
13. Jarum inokulasi dan ose harus disterilkan dengan cara memijarkan seluruh panjang
kawatnya sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan dapat
dihindarkan dengan cara memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam
yang berwarna lebih biru.
14. Apabila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari 1 kali, jangan meletakkannya
langsung di atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga
pipet yang telah tersedia.
15. Api pada pembakar bunsen harus dimatikan pada waktu tidak digunakan.
16. Biakan yang tidak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakai yang mempunyai
potensi bahaya harus diletakkan dalam tempatnya masing-masing yang disediakan
sebagai berikut :
a. Cawan petri, labu dan reaksi diletakkan di tempat yang disediakan.
b. Pipet harus diletakkan dalam wadah berisi desinfektan.
c. Kaca obyek dan penutupnya harus diletakkan dalam tempat-tempat khusus
yang telah diberi desinfektan. Bakteri yang ada pada kaca obyek belum
tentu mati semuanya sekalipun telah difiksasi dengan panas, jadi berhati-
hatilah menanganinya.
d. Jangan sekali-kali membuang biakan di tempat cuci.
17. Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan sendiri
atau rekan lain.
18. Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat.
19. Setiap praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke
tempat semula setelah digunakan, selain itu praktikan diharuskan untuk
membersihkan meja kerja, memeriksa nyala api dan listrik dipadamkan, menutup
kran air dan gas, mencuci tangan dengan desinfektan/lysol, kemudian melapor ke
assisten/dosen jaga.
20. Cucilah jas laboratorium anda sehingga selalu bersih pada waktu anda datang
kembali ke laboratorium pada waktu berikutnya. Gunakanlah sarung tangan dan
masker yang selalu baru di setiap praktikum mikrobiologi.

5
 I. PENGENALAN ALAT

A. Tujuan : Mahasiswa mengenal alat-alat yang digunakan selama praktikum, mengetahui

fungsinya serta memahami cara pemakaiannya.
Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal:
Alat-alat elektrik
• Mikroskop cahaya
• Mikroskop stereo
• Autoklaf elektrik
• Inkubator
• Hot plate & stirrer
• Colony counter
• Biological Safety Cabinet (BSC)
• Mikropipet
Alat-alat gelas dan keramik
• Cawan Petri
• Pipet ukur
• Pipet tetes
• Tabung reaksi
• Labu Erlenmeyer
• Mortar & pestle
• Beaker glass
• Buncen burner
• Gelas ukur
• Batang L / Drugalsky
Alat-alat non gelas
• Jarum inokulum / ose
• Rubber bulb
• pH meter universal

6
B. Dasar Teori
Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)
Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya.
Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih
kecil dari 0,1 mm.
Bagian-bagian Mikroskop:
1. Eyepiece / oculars (lensa okuler) untuk
memperbesar bayangan yang dibentuk lensa
objektif
2. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif )
untuk memutar objektif sehingga mengubah
perbesaran
3. Observation tube (tabung pengamatan / tabung
okuler)
4. Stage (meja benda) untuk meletakkan spesimen
5. Condenser (condenser) untuk mengumpulkan
cahaya supaya tertuju ke lensa objektif
6. Objective lense (lensa objektif) untuk memperbesar spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) untuk memperbesar dan
memperkecil cahaya lampu
8. Main switch (tombol on-off)
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) untuk menyamakan focus antara
mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) untuk menaikkan atau menurunkan
objectglass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri
objek glas

7
 15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) untuk menaik-turunkan meja benda (untuk
mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus) untuk menaik-turunkan meja benda secara
halus dan lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) untuk menaik-turunkan
kondenser
Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika meja
benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan
memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal
(13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup
kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus
b. Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2) pada perbesaran
selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. kemudian putar sekrup halus (16)
untuk mendapatkan fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi

Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa
objektif jika fokus telah didapatkan

Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu, misal 40x, dan ingin
memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak

8
perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak
A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas).

Tambahan :
a. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini akan
mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang
tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata.
b. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan
focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri
c. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan
mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh)
Perbesaran total
Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran
lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x
Penggunaan minyak imersi
Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa untuk
memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih
jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan
cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Biasanya dapat digunakan minyak
imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100
a. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran
objektif 100x
b. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa
c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x dengan
kertas lensa yang dibasahi xilol

9
Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope)
Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak
terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya digunakan untuk
mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur. Berikut merupakan uraian tentang
mikroskop stereo :
1. Ocularseyepiece (lensa okuler)
2. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter)
3. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran)
4. Focusing knob (sekrup pengatur fokus)
5. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan)
6. Stage clip (penjepit spesimen / preparat)
Prosedur operasi
1) Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5), jepit
jika perlu
2) Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3)
kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4)
3) Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar, putar Zoom Control Knob (3)
ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya. Mikroskop ini memiliki
pilihan perbesaran:

Autoklaf (Autoclave)
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang
digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Jadi
tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15
pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.
Diagram autoklaf vertical :
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
10
 3. pengukur tekanan
4. kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. Lempeng sumber panas
8. Aquades (dH2O)
9. Sekrup pengaman
10. batas penambahan air

Cara Penggunaan :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup
harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih
dahulu.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.
5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 menit dimulai
sejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.

Inkubator (Incubator)
Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau
memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini
dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.
Kisaran suhu untuk inkubator sekitar 10-70oC.
11
Hot plate stirrer dan Stirre bar
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)
berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan
pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat
dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi.
Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100
dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat
lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.

Colony counter
Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang
tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca
pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran
yang sangat bergunauntuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat
banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung
otomatis yang dapat di-reset.

Biological Safety Cabinet

Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga
disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna
untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola
pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi
steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan.
Prosedur penggunaan BSC adalah sebagai berikut:
1. Hidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya
matikan segera sebelum mulai bekerja
2. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah
3. Nyalakan lampu neon dan blower
4. Biarkan selama 5 menit
5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 %
6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok
dan biarkan menguap

12
 7. Masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh (overload)
karena memperbesar resiko kontaminan
8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga
efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril
9. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan
yang berbahan bakar gas.
10. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas
kerja
11. Setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari
BSC
12. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu
tangan dibasuh dengan desinfektan
13. Matikan lampu neon dan blower

Mikropipet (Micropippete) dan Tip

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil,
biasanya kurang dari 1000 μl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya
mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara
1μl sampai 20 μl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu
pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 μl. Dalam penggunaannya
mikropipet memerlukan tip.

Cara Penggunaan :
1. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan
lancarnya mikropipet.
2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet.
3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi.
13
 4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob
maka cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal
mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip
akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang
berfungsi mendorong tip keluar.

Cawan Petri (Petri Dish)

Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian
bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri
tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan
yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media
sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media
sebanyak 10 ml.

Pipet Ukur (Measuring Pippete)

Pipet ukur merupakan alat untuk
memindahkan larutan dengan volume yang diketahui.
Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet
ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10
ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan
pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan
volume yang diingini. Volume yang dipindahkan
dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan
mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar.

Pipet tetes (Pasteur Pippete)

Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume
yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu penerapannya
14
adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media, penambahan reagen
ada uji biokimia, dll.

Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan
untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan
mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun
cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal,
tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang
dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2
bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep
tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan
tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu
sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut
tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan efisiensi, media yang
ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.

Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan
yang. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan
menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung
akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat
beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat
ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500
ml, 1000 ml, dsb.

Gelas ukur (GraduatedCylinder)

Berguna untuk mengukur volume suatu
cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki
beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada
saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume
tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung
larutan.
15
Batang L (L rod)
Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di
permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan
tersebut tersebar merata. Alat ini juga disebut spreader.

Mortar dan Pestle

Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk
menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan, misal
daging, roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut.

Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi.
Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media
media, menampung akuades dll.

Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi
yang steril adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat
membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara
tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang
paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang
berwarna biru (paling panas). Pembakar bunsen dapat menggunakan
bahan bakar gas atau metanol.

16
Jarum Inokulum
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan
untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum
biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga
dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat
berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating
loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating
needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk
melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan
untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Jarum inokulum ini
akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.

pH Indikator Universal
Berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan.
Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada
media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH
indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian
strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.

Pipet Filler / Rubber Bulb

Pipet Filler adalah alat untuk menyedot
larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet
ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet
yang resisten bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran
yang masing-masing saluran memiliki katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna
untuk mengeluarkan udara dari gelembung. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan
maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi
untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur.

17
Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Pengenalan Fungsi Alat-alat yang terdapat di laboratorium Mikrobiologi
No Gambar Alat Nama Alat Fungsi

18
19
 II. STERILISASI

A. Tujuan : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi, tyndalisasi serta

mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis

Sterilisasi :
1) Pengertian sterilisasi
2) Macam-macam sterilisasi
a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)
b. Sterilisasi secara fisik
❖ Pemanasan
• Dengan api langsung
• Panas kering
• Uap air panas
• Uap air panas bertekanan
❖ Penyinaran UV
c. Sterilisasi secara kimia dengan larutan disinfektan
3) Prosedur/Teknik aseptis
a) Mensterilkan meja kerja
b) Memindahkan biakan (streak)
c) Menuang media
d) Pipetting
4) Prinsip cara kerja autoklaf
5) Sterilisasi dengan cara penyaringan
6) Tyndalisasi
7) Sterilisasi dengan udara panas
8) Prinsip kerja Biological Safety Cabinet
B. Dasar Teori
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari
semua bentuk kehidupan. Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu
secara mekanik, fisik dan kimiawi.

20
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat
kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan
tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya
larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
❖ Pemanasan
a) Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,
contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
b) Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180oC. Sterilisasi panas
kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung
reaksi dll.
c) Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi
dehidrasi.
d) Uap air panas bertekanan : menggunakan autoklaf
❖ Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya
untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety
Cabinet dengan disinari lampu UV
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain
alkohol.
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik
aseptis

21
22
Saran-saran kerja aseptis :
1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer
sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk)
dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau
dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas
yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian
api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di
luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin
kondisi aseptisnya.

Prinsip cara kerja autoklaf

Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab

pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk mensterilkan
23
berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121oC.
Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi
memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara
panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121oC dan tekanan 15 psi (2
atm) selama 15 menit.
Alasan digunakan suhu 121oC atau 249,8 oF adalah karena air mendidih pada suhu
tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan
laut (sea level) air mendidih pada suhu 100oC, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan
di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan mendididh pada suhu
121oC. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada
ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf
diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya
tercapai suhu 121oC untuk mendidihkan air.
Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121 oC dan tekanan
15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama
kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi
autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara
ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu
yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur.
Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun
perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0
psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba
pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus
stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore
strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses
sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan
autoklaf telah bekerja dengan baik. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan
dengan autoklaf adalah :
• Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
• Pelarut organik, seperti fenol
• Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan
hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
24
 • Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat
• Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa
garam mineral lain.
• Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
• Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf Jangan
mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang
dibiarkan kosong. Jika mensterilkan media 1 liter yang ditampung pada erlenmeyer 2 liter
maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi
cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap
(volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan
(ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori
dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus
tidak akan tersaring dengan metode ini. Sterilisasi dengan penyaringan
dapat dilakukan dengan berbagai cara :
1) Non-disposable filtration apparatus
• Disedot dengan pompa vakum
• Volume 20-1000 ml
2) Disposable filter cup unit
• Disedot dengan pompa vakum
• Volume 15-1000 ml
3) Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
• Disedot dengan pompa vakum
• Volume 15-1000 ml
4) Syringe filters
• Ditekan seperti jarum suntik
• Volume 1-20 ml
5) Spin filters
• Ditekan dengan gaya setrifugasi

25
 • Volume kurang dari 1 ml

Cara kerja menggunakan nondisposable filtration apparatus

Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan
Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran
penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer
penampung.
Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis
(sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan
yang akan disterilkan.
Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.
Setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung di erlenmeyer,
maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril
dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.

Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan
tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya
susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang
berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.
Cara kerja :
Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan
sumbat atau aluminium foil.
Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar
menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C
kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan
mematikan mikroba).
Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang
waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang
belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.

26
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)
Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti
cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara
panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat
gelas.
➢ Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil
➢ Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.

Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet

Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja
mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara
kotor untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter.
BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Lamina flowhood atau
Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang
bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk
dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri
dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang
berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.

27
 III. PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN

A. Tujuan : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar (NA) dan
Potato Dekstrosa Agar (PDA) serta larutan pengencer.

B. Dasar Teori
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul
kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat
dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi
media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
➢ air (H2O) sebagai pelarut
➢ agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi
oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 °C.
➢ gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam
amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis
mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
➢ Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai
pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi
mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme
sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur
pelikan/trace element.
➢ Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau
anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber
karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
➢ Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.
Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
28
 ➢ Vitamin-vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan
tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator
perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan
untuk menghambat pertumbuhan mikroba non target/kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
➢ Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat
dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling)
yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media.
Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus
diaduk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang
terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
➢ Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot,
liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya
tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
➢ Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa,
plasenta dan daging sapi.
➢ Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol.
Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
➢ Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam
amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam
amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik
➢ Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat.
➢ Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat
dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media
tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang.

29
 ➢ Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(NutrientBroth), LB (LactoseBroth).

2. Medium berdasarkan komposisi

➢ Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
➢ Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara
pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan
ekstrak kentang.
➢ Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
➢ Media untuk isolasi, Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk
pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
➢ Media selektif/penghambat, Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah
suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba
lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah
Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang
ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran
terhadap garam.
➢ Media diperkaya (enrichment), Media diperkaya adalah media yang mengandung
komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks
seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk
mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan
komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
➢ Media untuk peremajaan kultur, Media umum atau spesifik yang digunakan untuk
peremajaan kultur:
➢ Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik, media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah

30
 Koser’s Citratemedium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan
asam sitrat sebagai sumber karbon.
➢ Media untuk karakterisasi bakteri, Media yang digunakan untuk mengetahui
kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk
menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose
Broth, Arginine Agar.
➢ Media diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,
misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di
sekeliling koloni.

Larutan Pengencer

Larutan pengencer adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh

pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan
jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per
ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran
adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih
mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan mikroba
yang ditanam.

Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh

biasanya mangandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang
digunakan untuk pembuatan media dan larutan pengencer adalah fosfat. Pengunaan fosfat
dikarenakan satu-satunya komponen anorganik yang mengandung sifat buffer pada kisaran
pH normal, yaitu merupakan pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari
mikroba. Selain dari itu fosfat tidak mempunyai unsur racun bagi mikroba. Garam fosfat
yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat atau kalium
hidrogen fosfat. Selain larutan yang mengandung buffer fosfat, larutan pengencer lain yang
biasanya digunakan adalah larutan garam fisiologis (0,85%) atau larutan reagen. Larutan
pengencer ditempatkan dalam tabung reaksi dengan volume sebanyak 9 ml dalam setiap
tabung reaksi.

31
Prosedur Kerja:
1. Pembuatan Media Nutrien Agar (NA)
Bahan :
Bahan yang digunakan antara lain adalah: media NA dan aquadest 200 ml

Cara Kerja :

1. Timbang media NA sebanyak 4,6 gram dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 500
ml
2. Tambahkan aquadest 200 ml lalu aduk hingga media larut.
3. Panaskan larutan media NA dengan menggunakan hot plate stirrer sambil diaduk
hingga mendidih dan media menjadi kuning jernih. Pada saat pemanasan jangan
sampai terbentuk buih berlebihan sehingga meluap.
4. Setelah mendidih, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet
volume : 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung
reaksi untuk NA tegak, kemudian tutup mulut erlenmeyer dan mulut tabung reaksi
menggunakan kapas dan alumunium foil.
5. Sterilisasi media NA yang ada di erlenmeyer dan tabung reaksi dengan autoklaf
pada suhu 121oC selama 15 menit.
6. Setelah diautoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak
tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan
memadat.

32
Pembuatan Media Potato Dekstrosa Agar (PDA)
Bahan yang diperlukan antara lain: media PDA dan aquadest 200 ml
Cara Kerja :

1. Timbang media PDA sebanyak 7,8 gram dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 500
ml
2. Tambahkan aquadest 200 ml lalu aduk hingga media larut.
3. Panaskan larutan media PDA dengan menggunakan hot plate stirrer sambil diaduk
hingga mendidih menjadi jernih.
4. Setelah mendidih, tutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan alumunium
foil.
5. Sterilisasi media PDA yang telah jadi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit

Pembuatan Larutan Pengencer Garam Fisiologis 0,85%

1. Timbang 0,85 gram NaCl dan dimasukan ke dalam gelas piala 200 ml.
2. Tambahkan dengan 100 ml aquadest, lalu aduk hingga garam larut.
3. Pipet sebanyak 9 ml dan masukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi.
4. Tutup dengan kapas dan alumunium foil.
5. Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

33
 IV. ISOLASI MIKROORGANISME

A. Tujuan : mahasiswa mengerti dan memahami cara mengisolasi dan memisahkan

mikroba dari campurannya sehingga didapatkan kultur murni
Pada umumnya kita dapat menjumpai mikroba pada setiap tempat baik dalam
tanah, udara, air bahkan pada hampir semua benda terdapat mikroba. Tentu saja dalam
mempelajari mikroba mahasiswa harus mengerti dan memahami bagaimana mengisolasi
dan memisahkan mikroba tersebut agar didapat biakan murni sesuai dengan yang
dikehendaki sehingga dapat dipelajari morfologi, biologi ataupun karakteristik mikroba
tersebut. Sebelum dapat melakukan isolasi maka yang harus dilakukan terlebih dahulu
adalah pengambilan sampel atau contoh. Sampel yang diambil bisa dari tanah, air, bagian
tanaman ataupun manusia dan sebagainya.

B. Dasar Teori
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan
kemampuan biokimiawinya.
Alat dan Bahan
✓ Tabung reaksi
✓ Cawan Petri
✓ Oven
✓ Inkubator
✓ Vortex
✓ Tanah gembur
✓ Air sungai/Air danau/Air kanal
✓ Media NA
✓ Media PDA
✓ Aqauades
✓ Streptomicyn/penicillin/kloramfenikol

34
Cara Kerja
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut
merupakan prosedur pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka
cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang
diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat
permukaan hingga ujung perakaran.
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal
dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan
arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan
dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan
dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

3. Sampel Bakso
4. Sampel Roti

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan
dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi
bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril
pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada
35
 umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah
meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar
sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan
sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam
larutan atraktan semisal pepton water.

b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba

yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi
relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse
merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke
dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya
sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas
dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat
dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba
yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas
kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara
lain bakso, biji, buah dll. Untuk sampel dari tanah tak perlu
dimaserasi.

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengencera bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi Jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran
sebelumnya.
Cara Kerja :
➢ Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang
digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.
Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
36
 ➢ Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ketabung
10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak
tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran
terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet
ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.

3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk
tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran
terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di
permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan
adalah sebagai berikut :
➢ Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas
permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil
kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian
didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
➢ Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya
tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
37
 ➢ Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-
sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2 Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 oC) untuk dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh
dipermukaan agar yang kaya oksigen dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak
banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah
sebagai berikut :
➢ Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat
yang masih cair (>45oC)
➢ Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel kedalam cawan kosong
➢ Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk
menghomogenkan suspense bakteri dan medium, tunggu media memadat kemudian
kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk
pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,
sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga
diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

38
b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan
kultur ke dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
Cara kerja :
➢ Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah
permukaan agar.
➢ Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni
tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T
Cara kerja :
➢ Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
➢ Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
➢ Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag
pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan
yang sempurna
➢ Lakukan hal yang sama pada daerah 3

b.3 Goresan kuadran (Quadrant Streak)

Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
39
mikroorganisme. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Cara Kerja
Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
➢ Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10 -8
➢ Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada
medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam
➢ Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang
relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
➢ Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan
teknik streak kuadran Inkubasi 1x24 jam.

Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :

➢ Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit
dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatif tetap bertahan
➢ Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung
pengenceran bertingkat
➢ Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media
PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubasi selama
1x24 jam.

40
 ➢ Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
Inkubasi pada suhu ruang 1x24 jam.

V. PEMINDAHAN MIKROORGANISME

A. Tujuan: mempelajari cara pemindahan satu koloni bakteri ke media agar tegak dan
miring.

B. Dasar Teori
Dalam teknik pembiakan murni selain dibutuhkan cara memporoleh suatu biakan
murni juga diperlukan cara memelihara serta mencegah kontaminasi dari luar yang berasal
dari udara yang tentu saja mengandung banyak mikroorganisme.
Agar Miring
Media agar miring yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakkan
miring sehingga mempunyai permukaan media yang luas. Media ini digunakan untuk
menumbuhkan dan menyimpan biakan murni sebagai stok biakan murni NA. Pembuatan
agar miring tidak boleh menyentuh tutup tabung saat dimiringkan. Agar ini mempunyai
permukaan luas sehingga sering digunakan untuk menumbuhkan atau menyimpan biakan
murni. Beberapa teknik goresan yang biasa digunakan adalah goresan T, goresan kuadran,
goresan radix dan goresan sinambung.
Agar tegak
Media agar tegak yaitu media agar padat yang berisi agar yang dibiarkan tegak
hingga beku. Agar tegak ini digunakan untuk membiakkan bakteri dengan cara tusuk.

Bahan dan alat yang diperlukan antara lain: agar tegak, agar miring, biakan bakteri,
aquadest, tabung reaksi, lampu Bunsen, jarum ose, jarum preparat.

Pemindahan mikroba ke agar miring

1. Siapkan media NA miring.
2. Longgarkankan tutup dari tabung reaksi yang berisi media. Jangan dilepaskan !

41
 3. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga
kawat memijar.Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung
sampai memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!
4. Masukkan jarum ose dalam biakan bakteri dan ambil 1 ose biakan bakteri.
5. Ambillah tabung reaksi yang berisi agar miring, buka tutup tabung reaksi, dan
bakar mulut tabung reaksi.
6. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan
zigzag pada permukaan NA miring.
7. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.
8. Beri label pada tabung reaksi dan Inkubasikan selama 24 jam kemudian amati
pertumbuhannya.

Pemindahan mikroba ke agar tegak.

1. Siapkan media NA tegak.
2. Longgarkankan tutup tabung reaksi yang berisi media. Jangan lepaskan.
3. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga
kawat memijar.Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung
sampai memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!
4. Masukkan jarum ose dalam biakan bakteri dan ambil 1 ose biakan bakteri.
5. Ambillah tabung reaksi yang berisi agar tegak, buka tutup tabung reaksi, dan bakar
mulut tabung reaksi.
6. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara tusukan pada
permukaan NA tegak.
7. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.
8. Beri label pada tabung reaksi dan Inkubasikan selama 24 jam kemudian amati
pertumbuhannya.

42
 VI. PENGHITUNGAN DAN PENGUKURAN MIKROBA

A. Tujuan: untuk mempelajari cara penghitungan dan pengukuran mikroba tertentu

dengan menggunakan Metode Hitungan Cawan (Total Plate Count )

B. Dasar Teori
Metode penghitungan sel mikroorganisme di bagi menjadi 2 yaitu :
a. Secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang
mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup
saja dengan menggunakan metode Hitungan Cawan (Total Plate Count)
b. Secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati
atau yang hidup dengan alat Haemocytometer. Kelemahan metode penghitungan
ini adalah tidak dapat membedakan sel yang hidup dan mati sehingga angka yang
diperoleh merupakan total sel yang ada dalam populasi.

Penghitungan menggunakan Metode Hitungan Cawan (Total Plate Count)

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup
ditumbuhkan pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa
menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan cara paling sensitif untuk menentukan
jumlah jasad renik, dengan alasan:
a) Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung
b) Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
c) Dapat digunakan untuk isolasi, dan identifikasi mikroba karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampang spesifik.
Selain keuntungan-keuntungan tersebut diatas, metode hitungan cawan juga
mempunyai kelemahan sebagai berikut:
➢ Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa
sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.
➢ Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang
berbeda pula.

43
 ➢ Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar.
➢ Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan
koloni dapat dihitung

Teknik Penanaman pada metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara, yakni
metode tuang (pour plate), dan metode permukaan (surface / spread plate). Pada metode
tuang (pour plate), sejumlah sampel (1ml atau 0,1ml) dari pengenceran yang dikehendaki
dimasukkan kecawan petri, kemudian ditambah agar-agar cair steril yang didinginkan (45-
50oC) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Pada penanaman
dengan metode permukaan (surface / spread plate), terlebih dahulu dibuat agar cawan
kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar-
agar tersebur. Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril. Jumlah
koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut.

44
 VII. PEWARNAAN GRAM

A. Tujuan : Mahasiswa mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan

mengelompkkan bakteri ke dalam kelompok gram positif atau gram negatif.
B. Dasar Teori
1. Pembuatan Pulasan Bakteri
Bakteri atau mikroba dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan atau
dengan pewarnaan. Pengamatan tanpa pewarnaan lebih sukar dan tidak dapat dipakai
untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba lainnya
transparan atau semi transparan Dengan pewarnaan, dapat dilihat struktur sel mikroba
lebih seksama. Fungsi pewarnaan adalah a). memberi warna pada sel atau bagian-
bagiannya sehingga tampak kontras dan lebih jelas, b). untuk menunjukkan bagian-bagian
struktur sel, dan c). membedakan mikroba satu dengan yang lain.
Pewarnaan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pewarnaan.
Hasil pewarnaan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator
dan sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan
fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : a). Mencegah mengkerutnya globula-
globula protein sel, b). merubah afinitas zat warna, c). mencegah terjadinya otolisis sel, d).
dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan
bentuk atau strukturnya, e). melekatkan bakteri di atas objek glass dan f). membuat sel-sel
lebih kuat/keras. Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri
adalah dengan membuat lapisan suspensi/pulasan bakteri di atas objek glass, kemudian
dikeringanginkan dan dilalukan beberapa kali di atas nyala lampu spiritus/bunsen.
Alat dan bahan :
1. objek glass
2. Jarum ose
3. Lampu Bunsen
4. Label preparat
5. Aquades steril
6. Kultur murni bakteri
7. Penjepit objek glass

45
Cara kerja pembuatan pulasan bakteri :
1. Labellah objek glass yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan
memijarkannya pada nyala bunsen dan dinginkan.
2. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan di
tengah-tengah objek glass dan ratakan seluas ± 1 cm2.
3. Jika kultur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil
kultur dan letakkan di tengah-tengah objek glass yang sebelumnya telah diberi
aquadest steril dan ratakan.
4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan objek glass.
5. Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-hati, jangan
sampai terlalu kering/gosong), tergantung jenis pewarnaanya.
6. Pulasan bakteri siap untuk diwarnai

2. Pewarnaan Gram
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri

46
dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi
dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian
yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki
muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak
banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet,
Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa
antara lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif
dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel
selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara
dua lapis membran sel.
Alat dan bahan :
a. preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dari bakteri gram positif Bacillus subtilis
dan gram negatif Escherichia coli
b. kristal violet
c. lugol’s iodine
d. ethanol 96% / aseton
e. akuadest
f. counterstain (Safranin)
g. Kertas tissue
h. Mikroskop

Prosedur pewarnaan Gram

Cara Kerja Dampak / Hasil
1. Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan kaca
telah difiksasi dari bakteri gram (objek glass)
positif misal Bacillus subtilis dan
gram negatif misal Escherichia coli
47
2. Teteskan kristal violet sebagai
pewarna utama pada kedua
preparat , usahakan semua ulasan
terwarnai dan tunggu selama ± 1
menit
3. Cuci dengan akuades mengalir
4. Teteskan mordant (lugol’s iodine)
lalu tunggu ± 1 menit
5. Cuci dengan akuades mengalir
6. Beri larutan pemucat (ethanol 96%
/ aseton) setetes demi setetes
hingga etanol yang jatuh berwarna
jernih. Jangan sampai terlalu
banyak (overdecolorize)
7. Cuci dengan akuades mengalir
8. Teteskan counterstain (safranin) Safranin akan mewarnai sel gram negatif
dan tunggu selama ± 45 detik
9. Keringkan preparat dengan kertas
tissue yang ditempelkan di sisi
ulasan (jangan sampai merusak
ulasan) lalu biarkan mengering di
udara.
Kristal ungu akan mewarnai seluruh
permukaan sel bakteri gram positif dan
negatif
Adanya lugol’s iodine menyebabkan adanya
ikatan kristal violet dengan iodine yang
akan meningkatkan afinitas pengikatan zat
warna
oleh bakteri. Pada gram positif dapat
terbentuk kristal violet iodin ribonukleat
pada dinding sel
Penetesan etanol absolut menyebabkan
terbentuknya pori-pori pada gram negatif
yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid
larut dalam etanol), sehingga komplek
kristal violet-iodine akan lepas dari
permukaan sel gram negatif, sedangkan
pada gram positif kristal violet-iodine tetap
menempel di dinding sel, sel gram negatif
menjadi bening.
menjadi berwarna merah, sedangkan gram
positif tidak terpengaruh. Counterstain
hanya berfungsi sebagai pengontras saja
48
➢ Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan kristal violet-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan
sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram
positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit
dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan kristal
violet-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
➢ Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (kristal violet), khususnya pada gram positif. Mungkin
akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

49